全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
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收稿日期"$%% ?&& ?&&
基金项目"科技部资助项目#$%%QSP&%%.*$)天津市科委资助项目#%*O+\+,6%.#%%&%O6OR0)%.$%%$
作者简介"赵 晶#&!.%$&女&山西太原人&硕士研究生&研究方向"纳米生物传感器)张娟琨#联系人$&教授& 1^M3CJ":;3E4`afBKGB>@IK>LE
基于纳米多孔硅 845;;反射镜免标记
生物传感器的研究
赵"晶&&宋诗莹$&张子怡(&傅晶晶&&曾志鹏&&张娟琨&
#&>天津科技大学 生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室&天津市工业微生物重点实验室&天津 (%%.#*)
$>天津科技大学 现代分析技术研究中心&天津 (%%.#*)(>天津体育学院 运动人体科学系&天津 (%%(!&$
摘"要"构建一种基于多孔硅/2344反光镜的免标记的纳米生物传感器&通过在纳米多孔硅上固定的适配子的特异
性识别能力&检测溶液中四环素浓度 当适配子结合不同浓度的四环素溶液时&引起多孔硅/2344反光镜内部有效
折射率的变化&反射谱峰位进而发生变化 传感器的有效检测范围为 & j$%%
#
47Z&检测限为 &
#
47Z
关键词"免标记生物传感器)多孔硅 /2344反射镜 )反射光谱
中图分类号"W($h&&""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$%# ?%%# ?%#
U54]04W7400H.210/124H510I2//5/2W9242311.6.:2/845;; 40760:F24
O+P-SCE4
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*H1F45:F"PaCEI DFM32a@21F2@@E3ED19CDG@EGD293G@I DE B;@AD2DKGGCJCLDE /23442@FJ@LBD2N3GLDEGB2KL1
B@I FD2I@B@LBCE4B;@B@B23LHLJCE@GA@LCFCL3JHCE B;@GDJKBCDE NCB; B;@L3A39CJCBHDFB;@E3ED1AD2DKGGCJCLDE1
FCV@I 3AB3M@2>T;@E B;@3AB3M@2N3GCEB@423B@I NCB; B@B23LHLJCE@GDJKBCDE DFICF@2@EBLDEL@EB23BCDEG&
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NDKJI FK2B;@24@E@23B@L;3E4@GNCB; B;@2@FJ@LBCDE GA@LB2KMA@3aG>Y;@@F@LBC[@I@B@LBCDE 23E4@DFB;@
G@EGD2N3G&
#
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#
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#
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L0G K24I1" M32a@21F2@@9CDG@EGD2)AD2DKGGCJCLDE /23442@FJ@LBD2)2@FJ@LB3EL@GA@LB2KM
""纳米多孔硅材料具有极大的比表面积&能够有
效地吸附液体和气体&已有将纳米多孔硅作为化学
和生物学传感器的报道*& ?(+ 由于纳米多孔硅易于
整合到电化学系统(具备半导体材料的特性&QKD
等*. ?#+ &用此性质构建电化学生物传感器 O;3E4
等*&+利用纳米多孔硅在紫外激发下可以发射荧光
及荧光强度的变化构建基于荧光强度的蛋白生物
传感器&ZC等*5+利用多孔硅结构的表面等离子共振
体系光学性质构建生物传感器
适配子是通过指数富集配基系统进化技术
#0 Z^^\$筛选出的能与靶分子特异性结合的单链
R,P或W,P片段&作用形式上更类似抗体&可与靶
分子高亲和力特异性结合 适配子具有靶分子范
围广(制备合成简单等特点&经修饰的适配子稳定
性较好&可常温保存和运输&寡核苷酸适配子人工
合成具有极高的精确性(重复性和纯度的特点**+
笔者首次将纳米多孔硅 /2344反光镜与适配子结
合&利用光学测量方法&构建免标记生物传感器
在制备多孔硅的过程中&固定腐蚀液中 +)的
浓度&周期性地改变电流密度和腐蚀时间&使多孔
硅不同多孔度层的折射率和厚度交替的改变&并使
1
+
m
+
l1
Z
m
Z
l
&
7.&式中 1
+
(1
Z
和
+
(
Z
是相邻
不同多孔度层的折射率和厚度&
&
是 /2344波长
这样就能制备多孔硅 /2344反光镜*!+ &这是多孔硅
在光学器件中的一个非常重要的应用&能实现多孔
硅的窄峰发射*+ 从光学角度来看&可以把多孔硅
看作是空气和单晶硅的混合物*&%+ 如果孔内浸入
不同液体或者不同浓度的同一液体&多孔硅的有效
折射率会发生变化&进而使反射光谱的峰位发生变
化 利用上述特性&多孔硅可被用来测量不同液体
的折射率和液体的浓度&这是多孔硅在传感器领域
的一个很重要的应用
本文报道一种基于多孔硅 /2344反光镜的生物
传感器&由多孔硅 四环素适配子构成 当加入目标
分子四环素时&传感器内部的有效折射率发生改
变&通过紫外 可见分光光度计检测其反射谱&通过
反射谱峰位的变化量确定溶液中四环素的含量
C? 材料与方法
C=C?实验材料和仪器
(
!LM&单面抛
光$购于天津半导体研究所)牛血清白蛋白#/0P$(
& 乙基 ( #( 二甲基氨丙基$ 碳化二亚胺
# R^6$&M 羟基琥珀酰亚胺#,+0$及盐酸四环素
标准品#g$均购于北京鼎国生物技术有限公司)
( 氨丙基 三乙氧基硅烷#P化工有限公司 所用其他化学试剂均由天津化学
试剂研究所提供
脉冲信号发生器为石家庄无线电四厂的 0X,Q
Y^Q$%%( RR0函数信号发生器)S0显微镜为日本 S^-Z公司产品)Xd $##% 紫外 可
见分光光度计为日本岛津公司产品
C=A?实验方法
&>$>&"纳米多孔硅的制备
实验用硅片是x&%% y晶向 <型单晶硅 实验
用电解池为聚四氟乙烯单池结构&硅片为阳极&铂
柱电极为阴极&通过阳极电化学脉冲腐蚀制备多孔
硅 脉冲腐蚀电流幅值为 $% MP7LM$&脉冲周期为
#% MG&占空比为 %h#&腐蚀时间 *# MCE 腐蚀液配比
为@#.!g+)$k@#无水乙醇$k@#+
$
-$ l&k&k$
刚制备好的多孔硅片用去离子水冲洗&用体积
分数 %h#g的+
$
-
$
做电解液进行阳极氧化&处理 $%
MCE&使多孔硅表面形成一层很薄的氧化膜&然后将
多孔硅片浸入@#,+
(
!+
$
-$k@#+
$
-
$
$k@#+
$
-$ l
&k&k&%组成的混合溶液中&*% i保温 $% MCE&进行
亲水化处理&以改变多孔硅表面的氧化层的疏水
性&同时使多孔硅表面更加均匀 处理完毕后用蒸
馏水冲洗干净&在真空干燥箱中 $%% i干燥处理
& ;
用紫外 可见分光光度计通过积分球光路路径&
以/30-
.
标准品为对照&对新制备的多孔硅反射谱
进行检测&以确定制备的基于多孔硅的 /2344反光
镜反射峰位的稳定性
&>$>$"适配子的固定化
用P@#去离子水$ l&k&% 的比例混合&用 & MDJ7Z的+6J
溶液调整此混合液的 A+为 *h% 混合液在 #% i恒
温水浴&把制备好的多空硅片浸入上述溶液中&搅
拌&反应 ( ; 然后用去离子水冲洗干净
用 %h& MDJ7Z R^6及 %h& MDJ7Z,+0混合溶液
于 #% i预反应 & ;&之后将用P硅片浸入混合溶液中&#% i反应 $ ; 然后用去离
子水冲洗干净&室温干燥
将 $#
#
47
#
Z的四环素适配子溶液 #
#
Z铺展于
上述修饰过的多孔硅片上&(* i保温 & ;&使其充分
反应 用 $ M47MZ/0P溶液封闭多孔硅的空白位
点 之后用 A+*h% 的 干燥器中 对新制备的多孔硅片及修饰并固定适
配子后的多孔硅片利用紫外可见分光光度计对其
反射谱进行测定&并对反射峰位进行比较&确定反
射峰位的变化
用相同的方法对琼脂糖颗粒进行修饰后固定
适配子&并进行四环素结合后通过抑菌试验证明固
定化后的适配子的活性
&>$>("待测物标准溶液的配制
用灭菌后的去离子水配制质量浓度为 &(&%(
$#(#%(&%%(&#% 和 $%%
#
47Z系列浓度的盐酸四环素
标准品溶液
%5 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
&>$>."溶液浓度的检测及工作曲线的绘制
如果孔内浸入不同液体或者不同浓度的同一
液体&则多孔硅 /2344反射谱峰位发生变化 为了
利用反射谱的峰位变化量测量目的物浓度&需先
绘制标准曲线 将系列浓度的四环素标准溶液按
浓度由低到高依次取 &%
#
Z铺展于多孔硅表面&使
溶液分别浸入多孔硅 /2344反光镜的微孔中&#
MCE 后用去离子水冲洗表面&干燥&用紫外 可见分
光光度计对其反射谱进行检测&确定反射谱峰位
与溶液浓度的关系&并绘制工作曲线&确定拟合
方程
&>$>#"阴性对照实验及非特异性吸附实验
用上文所述的相同方法对修饰后未固定四环
素适配子的多孔硅片进行结合四环素后的反射谱
峰位置的变化实验作为阴性对照)同时用固定四环
素适配子的多孔硅片对青霉素的结合后的反射谱
峰位置的变化实验来确定构建的多孔硅 /2344反光
镜对非特异性分子吸附能力
A 结果与讨论
A=C?多孔硅的表面进行表征
通过阳极电化学脉冲腐蚀制备多孔硅表面均
匀平整&多孔硅表面在 #%% EM尺度上的原子力显微
镜#P)b$形貌图见图 & 由图 & 可知"多孔硅表面
呈不规则的岛丘状结构&岛状突起的最高处落差可
达到 !% EM&多孔硅的孔径达到 $% EM
图 C?多孔硅结构的*TU照片
T.;=C?*TU 9.:F34027E!1F43:F340
A=A?制备的多孔硅反射光峰位的稳定性
应用阳极脉冲腐蚀法制备的基于多孔硅 /2344
反光镜通过对腐蚀条件的控制&可以实现不同反光
镜其反射峰位的一致#图 $$ 由图 $ 可知&不同的
多孔硅 /2344反光镜其反射峰位置稳定地出现在
(5# EM处 因此&应用相同条件制备的多孔硅
/2344反光镜作为生物传感器的基片&实现对生物
分子的检测&其稳定性和精确度是有保证的
A=Q?适配子固定化前后多孔硅845;;反射镜反射
峰位的比较
""由于/2344反光镜是由折射率不同的两层交替
出现而产生的反射峰&刚制备好的多孔硅&可以看
作是空气和单晶硅的混合物)当其上固定特异性识
别分子后&孔中的空气被挤出&由于交联剂和适配
子存在其自身的折射率&所以多孔硅中多孔度不同
层次间的有效折射率会发生变化& 从而使 /2344反
3(9(L为制备的不同多孔硅/2344反光镜的反射光谱
图 A?不同的多孔硅845;;反光镜反射光谱
T.;=A?_.7040/F9242311.6.:2/845;; 40760:F5/:0
190:F421:29G
光镜反射峰位置发生变化#图 ($ 由图 ( 可知"固
定适配子后的多孔硅/2344反光镜其反射峰位置发
生右移&右移约 &% EM
&5"第 # 期 赵"晶等"基于纳米多孔硅/2344反射镜免标记生物传感器的研究
3%固定适配子后多孔硅/2344反光镜反射光谱)
9%固定适配子前多孔硅/2344反光镜反射光谱
图 Q?固定适配子前后多孔硅845;;反光镜反射光谱
T.;=Q?T.O0I59F5J04H072405/I57F04924231
1.6.:2/845;; 40760:F5/:0190:F421:29G
A=R?适配子固定化后的活性
适配子作为特异性识别分子&是通过单链 R,P
内部氢键自身形成的二级结构和目标分子进行特
异性结合 在适配子固定化过程中引入一些化学
基团与适配子结合&可能破坏其自身二级结构&故
对适配子固定化后的活性进行鉴定#图 .$ 由图 .
可知"固定化后的适配子对四环素有很好的亲和
性&可以用于后续的检测
3%固定适配子经特异性吸附四环素后的琼脂糖颗粒)9%吸附
四环素未洗脱的琼脂糖颗粒)L%吸附四环素洗脱后的琼脂糖颗
粒)I%仅表面修饰后的琼脂糖
图 R?固定化适配子吸附四环素的抑菌圈
T.;=R?T.O0I59F5J045I1249FF0F45:G:6./0
5/F.H5:F04.56:.4:60
A=@?多孔硅845;;反光镜固定适配子后对四环素
的检测
""通过紫外 可见分光光度计对固定适配子后的
多孔硅/2344反光镜及其吸附不同质量浓度的四环
素溶液后的反射率在 (%% j.#% EM范围内进行扫
描&确定反射峰位置#图 #$ 从图 # 可以看出"由于
四环素适配子结合不同质量浓度的四环素后&四环
素对多孔硅层的有效折射率产生影响&反映在反射
谱上即为反射峰位置出现了不同程度的位移 根
据反射峰的具体位置与吸附四环素的质量浓度的
相关关系&发现当吸附四环素质量浓度为 & j$%%
#
47Z的范围内有较好的线性关系&易于绘制标准曲
线#图 53$&待测物的最低检测限为&
#
47Z 当四环
素适配子与不同质量浓度青霉素溶液进行非特异
性吸附&检测其反射谱峰位&发现反射谱峰位与青
霉素溶液质量浓度之间几乎没有线性关系#图 59$&
说明四环素适配子对四环素分子具有特异性吸附能
3%结合 $%%
#
47Z四环素溶液)9%结合 &%%
#
47Z四环素溶液)
L%结合 $#
#
47Z四环素溶液)I% 结合 &#%
#
47Z四环素溶液)
@%结合 #%
#
47Z四环素溶液)F%结合 &%
#
47Z四环素溶液)
4%结合 &
#
47Z四环素溶液
图 @?845;;反光镜结合不同浓度四环素
溶液后845;;反光镜反射谱
T.;=@?S0760:F.2/190:F45 27E242311.6.:2/
845;; 40760:F2417.O0I./1263F.2/127
I.7040/F:2/:0/F45F.2/127F0F45:G:6./0
3%/2344反光镜反射峰位与四环素溶液质量浓度的关系) 9%
/2344反光镜反射峰位与青霉素溶液质量浓度的关系) L%未固
定适配子的 /2344反光镜反射峰位与四环素溶液质量浓度的
关系
图 V?845;;反光镜反射峰位与抗生素质量浓度的关系
T.;=V?S065F.2/1-.9H0FK00/F-0:2/:0/F45F.2/27
1263F.2/5/IF-0905]27845;; 40760:F24
$5 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
力 当用未固定适配子的/2344反光镜对不同质量
浓度四环素溶液进行吸附&检测其反射谱峰位&发
现反射谱峰位与四环素溶液质量浓度之间几乎没
有线性关系#图 5L$&说明在基于多孔硅 /2344反光
镜适配子生物传感器中起生物识别作用的是四环
素适配子&这种生物识别作用具有特异性
Q?结?论
根据/2344反光镜独特的光学性质&结合纳米
多孔硅传感器的特殊结构&制备了基于多孔硅/2344
反光镜免标记的生物传感器 通过对单晶硅片的
腐蚀和修饰&利用P)b对其结构进行表征 通过紫
外 可见分光光度计对其发射峰位置的稳定性&修饰
过程&特异性识别分子的固定及其与目标分子的结
合进行检测&获得了目标分子浓度与反射峰位置变
化的规律& 确定了检测限为 &
#
47Z& 有效检测范围
为 & j$%%
#
47Z
参考文献"
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JC4;B1@MCBCE4GCJCLDE L;CA 3G3ADB@EBC3J9CDG@EGD2AJ3BFD2M*S+>
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5.&515.$.>
**+"齐永志&姚春艳&罗阳&等>适配子型压电传感器的实验研究
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423BCE4N3[@4KCI@G@EGD2FD2L;@MCL3JMDECBD2CE4*S+>0@EGD2G3EI
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*&%+ <3L;DJGaC6&032BD2b&03CJD2bS&@B3J>/CDG@EGCE4KGCE4AD2DKG
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""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
&5(51&&5.#>
国外动态
利用病毒从水中分离出+
$
麻省理工学院材料化学家安琪拉!贝尔彻领导的团队模拟植物利用太阳光分离水&对一个病毒进行了
基因改造&同时将其作为生物支架&将一些纳米组件搭建在一起&最终把+
$
-分离成了氢原子和氧原子 这
一研究成果在将水变成氢燃料的漫漫征程中迈出了关键一步
贝尔彻表示&虽然他们的最终目的是从水中得到+
$
&但将 -
$
从水中分离出来面临的技术挑战更大&于
是该研究团队首先开始攻克这一难关 贝尔彻的团队将无毒的细菌病毒b&( 进行基因改造&让它吸附一个
催化剂分子#氧化铱$和一个吸光物质#锌卟啉$&并同它们绑在一起&吸光物质源源不断地将阳光沿着病毒
传递&于是该病毒就变成了类似电线的设备&能够高效地将氧从水分子中分离出来 随后的实验发现&一段
时间后&该病毒,电线-会簇拥在一起&失去效力 于是&研究人员将它们变成凝胶状态封入一个胶囊&这些
病毒因此能够保持自己的状态&从而维持了其稳定性和有效性 这种方法使产生-
$
的效率提高了 . 倍&研
究人员希望能够找到同样的以生物学为基础的系统来完成这个反应的另一半过程%%%分离+
$
目前&从水
中分离的氢被分解成了质子和电子 研究人员正在进行第二步攻关&将这些质子和电子变成氢原子或者氢
分子
#文伟河$
(5"第 # 期 赵"晶等"基于纳米多孔硅/2344反射镜免标记生物传感器的研究