全 文 ：第７卷第５期
２００９年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２００９
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊｉｓｓｎ１７６２－３６７８．２００９．０５．０１５
收稿日期：２００８－１０－２４
基金项目：天津市科委资助项目（０７ＺＨＸＨＮＣＯ４５００）
作者简介：卢金辉（１９８２—），女，内蒙古呼伦贝尔人，硕士研究生，研究方向：纳米生物传感器；张娟琨（联系人），博士生导师，教授，Ｅｍａｉｌ：
ｚｈａｎｇｊｋ＠ｔｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
免标记光学纳米生物传感器的研究
卢金辉，张娟琨，赵 晶，吴 艳，李 丽，王达飞
（天津科技大学 生物工程学院 天津市工业微生物重点实验室，天津 ３００４５７）
摘 要：利用发光稳定的多孔硅，当蛋白质溶液固定到多孔硅表面时，其发光强度和反射光谱的峰位会随着被测物
质量浓度的变化而发生变化的特性。制备免标记光学纳米生物传感器来检测牛血清白蛋白（ＢＳＡ），把不同质量浓
度的ＢＳＡ溶液固定到多孔硅上测量反射光谱的峰位和荧光强度的变化。实验结果表明：反射光谱的峰位与牛血清
白蛋白的浓度呈线性关系：ｙ＝１４１８９ｘ＋３６６３１，Ｒ２＝０９８９８；荧光强度的降低量与ＢＳＡ溶液的浓度呈线性关系，
检测限为８×１０－９ｍｏｌ／Ｌ。
关键词：免标记生物传感器；纳米多孔硅；反射光谱
中图分类号：ＴＦ１２３．３＋３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２３６７８（２００９）０５００７３０４
Ｌａｂｅｌｆｒｅｅｏｐｔｉｃａｌｎａｎｏｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ
ＬＵＪｉｎｈｕｉ，ＺＨＡＮＧＪｕａｎｋｕｎ，ＺＨＡＯＪｉｎｇ，ＷＵＹａｎ，ＬＩＬｉ，ＷＡＮＧＤａｆｅｉ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，
ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００４５７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓｔａｂｌｅｌｉｇｈｔｅｍｉｔｉｎｇｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎ（ＰＳ）ｃｈｉｐｗａｓｆａｂｒｉｃａｔｅｄＷｈｅｎｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｐｏｓｉｔｅｄ
ｏｎｔｈｅＰＳｃｈｉｐ，ｔｈｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆｐｅａｋｓａｎｄｔｈｅＵＶｖｉｓｉｂｌｅｓｐｅｃｔｒａｏｆｔｈｅｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅｌｉｇｈｔｃｈａｎｇｅｄｗｉｔｈｔｈｅ
ｓｏｌｕｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＡｌａｂｅｌｆｒｅｅｓｅｎｓｏｒｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎｗａｓａｓｓｅｍｂｌｅｄＴｈｅｌｉｎｅａｒ
ｅｑｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅａｎｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｙ＝１４１８９ｘ＋３６６３１，Ｒ２＝０９８９８．Ｔｈｅｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎｌｉｍｉｔｗａｓ８×１０－９ｍｏｌ／Ｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌａｂｅｌｆｒｅｅｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；ｎａｎｏｐｏｒｏｕｓｓｉｌｉｃｏｎ；ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｅｏｐｙ
多孔硅具有极大的比表面积及可见光致发光
特性，是制造传感器的理想材料［１－２］。目前，人们利
用多孔硅层的电导率、光致发光、有效折射系数及
ＰＬ谱折射系数的变化原理制成气敏传感器［３－４］；又
通过把多孔硅表面硅烷化，将ｃＤＮＡ束缚在其表面，
探测吸附ｃＤＮＡ前后的光致发光光谱的折射系数的
变化，制备成生物传感器［５］。
Ｐａｃｈｏｌｓｋｉ等［６－７］利用多孔硅 Ｂｒａｇｇ反射镜能够
有效发光的原理制备了 ＤＮＡ生物传感器。多孔硅
在可见光波长内能够有效发光，从光学角度可以把
多孔硅看作是空气和单晶硅的混合物。如果孔内
浸入不同液体或者不同质量浓度的同一液体，多孔
硅的有效折射率会发生变化，进而使反射光谱的峰
位发生改变。利用上述特性，多孔硅可被用来测量
不同液体的折射率和液体的质量浓度［８］，这是多孔
硅在传感器领域的一个重要应用。
笔者利用脉冲腐蚀法制备了稳定发光的多
孔硅，并利用多孔硅随着分子的吸附反射光谱峰
位和荧光强度发生变化的原理制备了用于检测
牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的免标记光学纳米生物传
感器。
１ 材料与方法
１１ 材料
１１１ 试剂
硅片：由天津半导体研究所提供的Ｐ型＜１００＞
晶型，单面抛光单晶硅，电阻率为 ０１５～０２
Ω·ｃｍ；所用其他化学试剂均由天津化学试剂研究
所提供。
１１２ 仪器
函数信号发生器（ＴＦＧ２００３ＤＤＳ，３ＭＨｚ，石家
庄市数英电子科技有限公司）；电泳仪（ＤＹＹ ８Ｃ
型，北京市六一仪器厂），透射电子显微镜（Ｊｅｍ
１００Ｃｅｘ Ｉ型，上海光学仪器厂）；荧光分光光度仪
（ＲＦ ５３０１型，日本岛津公司）；酶标仪（ＧＦ
Ｍ３０００，南京第四分析仪器有限公司）；紫外可见分
光光度仪（岛津ＵＶ ２５５０型，日本岛津公司）。
１２ 方法
１２１ 纳米多孔硅的制备
采用电化学腐蚀法，先将单晶硅片用无水乙醇
冲洗，并用大量的蒸馏水冲洗，将试样放入腐蚀槽，
加入１０ｍＬ腐蚀液，进行阳极脉冲腐蚀，腐蚀液由
ＨＦ、无水乙醇和水以体积比为１∶１∶２混合。信号发
生器设置为 Ａ路方波，幅度为 ８ＶＰ Ｐ，频率为
２０Ｈｚ，通电１５ｈ后用 ０５％的双氧水直流腐蚀
１０ｍｉｎ（Ｉ＝１５ｍＡ，Ｕ＝１５Ｖ）。制备好后于室温下
避光晾干保存。
１２２ 多孔硅表面蛋白质的固定
将ＢＳＡ溶液滴加到多孔硅表面，放入冰箱４℃
保存１０～１２ｈ，然后取出结合了蛋白质的硅片用去
离子水小心冲洗掉硅片表面未固定的蛋白，在室温
下晾干，不要损坏多孔硅表面。
１２３ 测量方法
使用透射电子显微镜（ＴＥＭ）检测多孔硅的
孔径。
用酶标仪检测多孔硅表面蛋白质的质量浓度。
该实验主要是测定考马斯亮蓝 Ｇ ２５０从 ４６５～
５９５ｎｍ下的最大吸光度（ＯＤ）的变化。当与不同质
量浓度的蛋白质结合后考马斯亮蓝的颜色会发生
变化，由一系列质量浓度的ＢＳＡ溶液和多孔硅反应
５ｍｉｎ，然后读取 ＯＤ５９５。对多孔硅表面荧光强度的
降低与固定的 ＢＳＡ溶液质量浓度之间的关系进行
分析，再用荧光分光光度仪检测其荧光强度，绘制
标准曲线。
用紫外可见分光光度仪检测固定了一系列
质量浓度 ＢＳＡ溶液的多孔硅反射率，测出反射
光谱。
２ 结果与讨论
２１ 纳米多孔硅的ＴＥＭ和荧光稳定性
影响多孔硅发光的因素主要有多孔硅的结
构、气体、其他分子以及多孔硅表面孔径。笔者通
过严格控制多孔硅的腐蚀条件如腐蚀液的比例、
电压、电流和时间等来保持多孔硅的孔径大小和
稳定性。多孔硅在２２０ｍＡ／ｃｍ２下腐蚀，孔径可到
达４～１２ｎｍ，在６００ｍＡ／ｃｍ２下孔径可达到 ３００～
８００ｎｍ［９］。在本文的实验条件下，多孔硅的孔径
达到 ２０ｎｍ（图１）。
图１ 多孔硅孔径的ＴＥＭ照片
Ｆｉｇ．１ ＴｈｅＰＳｐｏｒｅｓｉｚｅｉｍａｇｅｏｆＴＥＭ
２２ 多孔硅反射光谱的测量
多孔硅的孔内浸入不同质量浓度的 ＢＳＡ溶液，
则多孔硅的反射谱峰位会发生变化（图２）。利用反
射谱峰位的变化曲线测量ＢＳＡ溶液的浓度，需绘制
标准曲线（图３），确定反射谱的峰位变化与 ＢＳＡ溶
液质量浓度的函数关系，并根据它们的函数关系求
出线性方程。
由图３得出反射谱峰位与溶液浓度的线性关
系式为ｙ＝１４１８９ｘ＋３６６３１，方差Ｒ２＝０９８９８。
为了验证所得标准曲线的正确性，任意配制 ３组
不同质量浓度的 ＢＳＡ溶液，先用物理方法计算这
些溶液的质量浓度，然后利用反射光谱的峰位变
化分别测定它们的质量浓度。测定结果如表 １
所示。
４７ 生 物 加 工 过 程 第７卷
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）对应的
ＢＳＡ蛋白溶液的质量浓度分别为２９９０、２０８０、１０３４、
０５１２、０１６０、００９０、００１２和０００５ｍｇ／ｍＬ
图２ 固定不同浓度白蛋白溶液的多孔硅反射谱
Ｆｉｇ２ ＴｈｅＲ％ ｏｆＰＳｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ａｆｔｅｒｔｈｅ
ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｗｉｔｈｄｉｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＢＳＡ
图３ 反射谱峰位与溶液质量浓度的关系
Ｆｉｇ．３ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｅａｋｏｆｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ
ｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｄＳｏｌｕｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
表１ ＢＳＡ溶液测试结果
Ｔａｂｌｅ１ ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＢＳＡｓｏｌｕｔｉｏｎｔｅｓｔｉｎｇ
峰位／ｎｍ
理论质量浓度／
（ｍｇ·ｍＬ－１）
测试质量浓度／
（ｍｇ·ｍＬ－１）
３６７３９ ０７５ ０７６１１
３６８１０ １２５ １２６１５
３６９３４ ２１５ ２１３５５
由表１可知：测量结果的相对误差小于１％，理
论值（即酶标仪检测多孔硅表面蛋白质的质量浓度
值）与测试值基本吻合，实验结果与理论值基本相
符。本实验是利用多孔硅进行液体质量浓度测量
的尝试性实验，基本可以达到较准确测量液体质量
浓度的结果。但由于多孔硅的制备现在还不能实
现精确控制，因而在系统测量时有时会带有一定的
随机性。目前，最紧要的任务仍然是探求新的多孔
硅制备方法，实现其微结构的精确控制，最终完全
实现在传感器件中的应用。
３ 多孔硅荧光强度的测量
由图４可知：将多孔硅芯片固定于不同质量浓
度的ＢＳＡ溶液中，测量光强的降低值。这说明多孔
硅的荧光强度与 ＢＳＡ溶液的质量浓度成反比。当
ＢＳＡ溶液质量浓度低于１ｍｇ／ｍＬ时，ＢＳＡ溶液质量
浓度每增加０５ｍｇ／ｍＬ多孔硅的荧光强度就会降低
约９％。当ＢＳＡ溶液质量浓度大于１ｍｇ／ｍＬ时，荧
光降低量变小，这表明多孔硅表面吸附的 ＢＳＡ溶液
已经达到饱和。根据图 ３的数据计算出检测限在
８×１０－９ｍｏｌ／Ｌ。荧光强度的降低可能是由于多孔
硅表面与 ＢＳＡ溶液相互作用而引起的。多孔硅的
纳米结构吸收了紫外光使其表面的离子发光。当
多孔硅表面结合了 ＢＳＡ分子后，其表面的化学结
构、电荷、孔径和结构都受到改变。因此，摄入的能
量和荧光强度都会降低。同时，也发现了气体、生
物材料、无机和有机分子也能改变多孔硅的荧光
强度。
图４ 吸收不同质量浓度ＢＳＡ的多孔硅的荧光强度减少量
Ｆｉｇ．４ ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔｏｆＰＳｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ａｆｔｅｒｔｈｅ
ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｗｉｔｈｄｉｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＢＳＡ
４ 结 论
根据纳米多孔硅表面与蛋白分子的相互作用，
制备了简单、免标记的 ＢＳＡ光学纳米生物传感器。
通过实验得到的多孔硅的孔径约为２０ｎｍ、比表面
积约为５００ｃｍ２／ｃｍ３，在紫外灯下发射荧光。这为新
的光学传感器的发展提供了良好的基础。实验表
明多孔硅吸附不同质量浓度的 ＢＳＡ与荧光强度的
降低量和反射谱峰位成比例关系，同时也发现了气
体、生物材料、无机和有机分子也同样能改变发光
强度和反射谱的峰位。这２种检测 ＢＳＡ的方法不
仅免标记，而且使用了简单的多孔硅制备技术，作
５７ 第５期 卢金辉等：免标记光学纳米生物传感器的研究
为一个测量体系，操作方法简单，灵敏度高，对光学
生物传感器的发展具有重大意义。
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櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
１２１０８１２１１６．
国外动态
借助阳光将ＣＯ２和Ｈ２Ｏ变成生物燃料
据美国《技术评论》杂志报道，一家新兴的美国公司发明了一种可以将 ＣＯ２和 Ｈ２Ｏ变成生物燃料的方
法，使用该方法，每公顷每年可以制造２８×１０６Ｌ左右生物燃料。如果该方法可行，在美国交通领域用生物
燃料取代化石燃料将成为可能，而且，生物燃料的售价也将同化石燃料不相上下。
总部位于美国麻省剑桥的焦耳生物技术公司在特制的光生物反应器中培育了转基因微生物，该微生物
能借助阳光将ＣＯ２和Ｈ２Ｏ变成乙醇或碳氢化合物燃料，人们可以使用传统的化学分离技术收集这些生物
燃料。
该公司的首席执行官比尔·希姆斯表示，如果这个在实验室获得证实的新方法能够大规模进行，那将
是生物燃料工业的一个里程碑。
美国杰能科尝试采用生物异戊二烯生产燃料
全球著名的生物技术公司———杰能科公司已经可以将其生物异戊二烯产品转化成用于生物燃料应用，
如航空燃料的Ｃ１０和Ｃ１５的平台化合物。
杰能科公司开发的生物异戊二烯是通过发酵过程制得，用作石油基异戊二烯的替代产品。当前生物异
戊二烯的应用包括轮胎橡胶、黏合剂和弹性体。
用生物技术改进树木性质
美国Ｍｉｃｈｉｇａｎ技术大学报导了通过基因工程对树木进行改性，可降低４５％杨树中的木素，而纤维素质
量分数较高，可达到７５％，这种改性杨木有利于制浆造纸，而且树木的生长速率明显提高。
（文伟河）
６７ 生 物 加 工 过 程 第７卷