全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
dDJ>! ,D>#
0@A>$%&%
IDC"&%>(5 7`>CGGE>&5*$ ?(5*!>$%&%>%#>%%
收稿日期"$%&% ?%. ?&(
基金项目"国家科技支撑计划项目#$%%*/PR*#/%#$)国际科技合作项目#$%%!R)P(%*&%$
作者简介"杨"键#&!.%$&男&江苏盐城人&硕士研究生&研究方向"酶工程)黄日波#联系人$&教授& 1^M3CJ" 29;K3E4f4V3G>LE
淀粉结合域与
!
淀粉酶的融合表达及其酶学性质
杨"键&&$&金"辉&&$&王青艳&&$&黄日波&&$
#&>广西大学 生命科学与技术学院&广西亚热带生物资源保护利用重点实验室&南宁 #(%%%#)
$>广西科学院 国家非粮生物质能源研究工程中心&南宁 #(%%%*$
摘"要"利用WY1<6W从5%#K&-0+&"8K*(Q\ %! 总W,P中克隆到糖化酶的淀粉结合域#0/R$基因#+E$&将该基因
片段插入
!
淀粉酶#6,*P$基因$1**的 #s端构建融合表达质粒 A0 1^+E$1** 嵌合酶 0/R16,*P在G+$%("#$%#* $&A
/#Sb&% 表达&并经,C1,YP(0@A;3L2HJ0(%% 纯化 酶学性质研究表明"嵌合酶在最适作用条件方面与原始酶并无明
显差别)在以生玉米粉为底物时&其比酶活提高了 !h* 倍&而以可溶性淀粉为底物时其比酶活是原始酶的 &h! 倍&
=M也从 (h*!. 47Z降低为 $h$(. 47Z)嵌合酶在 5# i下的半衰期从 &% MCE 缩短为 . MCE 结果表明&淀粉结合域
0/R的融合赋予了
!
淀粉酶6,*P水解生淀粉的能力
关键词"嵌合酶)淀粉结合域)热稳定性
中图分类号"Y0$(&)8*!5""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$%# ?%%( ?%#
T31.2/0O94011.2/271F54:-H./I./; I2J5./K.F-
!
W5JG65105/I.F1942904F.01
]P,QSC3E
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&S_,+KC
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&TP,Q8CE41H3E
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&+XP,QWC19D
&&$
#&>6DJ@4@DFZCF@0LC@EL@3EI Y@L;EDJD4H&QK3E4VCc@HZ39D23BD2HDF0K9B2DACL3J/CD2@GDK2L@6DEG@2[3BCDE 3EI XBCJC:3BCDE&
QK3E4VCXEC[@2GCBH&,3EECE4#(%%%#& 6;CE3) $>,3BCDE3J,DE1423CE /CD1@E@24H^ E4CE@@2CE4W@G@32L; 6@EB@2&
QK3E4VCPL3I@MHDF0LC@EL@G&,3EECE4#(%%%*&6;CE3$
*H1F45:F"Y;@GB32L;19CEICE4IDM3CE 4@E@+E N3G3MAJCFC@I 9HWY1<6WF2DMBDB3JW,PDF5%#K&-0+
&"8K*(Q\1%!>Y;@FKGCDE @VA2@GGCDE AJ3GMCI N3GLDEGB2KLB@I 9HCEG@2BCE4G9I BD#s@EI DF
!
13MHJ3G@
4@E@$1**>Y;@L;CM@2CL@E:HM@#0/R16,*P$ N3GD[@2@VA2@GG@I CE G+$%("#$%#* $&/#Sb&% 3EI AK2CFC@I
9H,C1,YP3EI 0@A;3L2HJ0(%%>0/R16,*PG;DN@I GB2DE423NLD2E GB32L; ;HI2DJH:CE43LBC[CBH& CBN3G
!h* BCM@G;C4;@2B;3E A32@EB3J@E:HM@6,*P>T;@E B3aCE4GDJK9J@GB32L; 3G3GK9GB23B@& =
M
[3JK@I@1
L2@3G@I F2DM (h*!. 47ZBD$h$(. 47Z& 3EI B;@GA@LCFCL3LBC[CBHCEL2@3G@I F2DM &*h! X7EMDJBD
($h% X7EMDJ>Y;@;3JFJCF@3B5# i I@LJCE@I F2DM&% MCE DF6,*PBD. MCE DF0/R16,*P>Y;@FKGCDE
DF0/RNCB;
!
13MHJ3G@6,*PM3a@I B;@@E:HM@MD2@GKCB39J@FD223NGB32L; ;HI2DJH:CE4>
L0G K24I1"L;CM@2CL@E:HM@)GB32L;19CEICE4IDM3CE)B;@2M3JGB39CJCBH
""淀粉是植物体内重要的储能物质&以淀粉为原
料可发酵生产多种产品 传统采用两步水解法将
淀粉转化为葡萄糖&此过程首先将淀粉液加热至
&&% i&需消耗大量能量 而生淀粉酶可在低于糊
化温度的条件下直接作用于生淀粉颗粒&简化工
艺(降低能耗&WD9@2BGDE 等*&+估算用生淀粉酶产乙
醇可节约耗能 &%g j$%g
淀粉结合域可与不溶性淀粉结合从而增加
不溶性淀粉在活性中心的浓度&赋予淀粉酶利用
生淀粉的能力 *$+ 已发现的淀粉结合域存在于
细菌和真菌的
!
淀粉酶(细菌的环糊精转移酶(
细菌的
!
淀粉酶以及真菌的糖化酶中 *(+ 来自
根霉的糖化酶具有很高的生淀粉酶活力&其生淀
粉利用率可达 5#g j*%g *.+ &其三维结构包括 6
端的催化区域和 ,端的淀粉结合域 笔者所在
实验室克隆到一种不依赖 63$ o的酸性淀粉酶基
因 $1**&但该酶以生淀粉酶为底物时&其酶活非
常低&为了提高其水解生淀粉能力&尝试将根霉
糖化酶的淀粉结合域融合到
!
淀粉酶 6,*P的
,端
C?材料与方法
C=C?材料
&>&>&"菌株与质粒
5%#K&-0+&"8K*(Q\ %! 由笔者所在实验室筛选
保藏)G+$%("#$%#* $&/#Sb&% 为笔者所在实验室保
存)质粒 A0 (^!% 购自_E[CB2D4@E公司
&>&>$"酶与试剂
ZPY3U R,P聚合酶购自 Y3c3W3公司&W@[@21
BPCI
Yb
)C2GB0B3EI LR,P0HEB;@GCGcCB(限制性内切
酶(
$
R,P7L#1
%
M32a@2(Y. 连接酶及标准蛋白质
M32a@2均购自 b/_公司&总 W,P提取试剂盒购自
上海华舜生物工程公司&其余试剂为国产分析纯
&>&>("培养基
Z/培养基"蛋白胨 &% 47Z&酵母粉 # 47Z&,36J
&% 47Z A+*h%&培养基中氨苄青霉素终质量浓度
为 &%%
#
47MZ
土豆培养基"#%% 4土豆去皮切丁&加入 & Z水&
充分煮沸&纱布过滤后滤液定容至 & Z
C=A?方法
&>$>&"5%#K&-0+&"8K*(总 W,P的提取及LR,P的
获得
用华舜生物工程公司 W,P提取试剂盒提取
W;C:DAKGD2H:3@Q\ %! 的总W,P&提取方法参考试
剂盒说明书 以总W,P为模板&反转录获得LR,P&
反转录方法参考试剂盒说明书
&>$>$"5%#K&-0+&"8K*(糖化酶淀粉结合域 0/R的
克隆
根据 Q@E@/3Ea 公布的 5%#K&-0+&"8K*(糖化酶
淀粉结合域的序列引物"
0/R1G@EG@#s1QYY6QQPY66Q6PPQYPYY61
6YPQ6PQYQ6YY1(s& 0/R13EBCG@EG@#s16Q66QPPY1
Y6YQYPQPYP6YYQQYPPYYQQ6P1(s
其中上下游引物分别加了 :*)+
&
和 G$&W
&
酶切位点#下划线部分$&以LR,P为模板<6W扩增
0/R序列
&>$>("杂合酶 0/R16,*P的构建
将扩增得到的+E基因片段经酶切处理后与相
同酶切的重组
!
淀粉酶质粒 A0 (^!%1$1** 连接&获
得新的重组质粒中 +E 序列位于#淀粉酶基因 $1**
的 #s端&如图 & 所示
图 C?杂合酶构建示意图
T.;=C?!:-0J5F.:4094010/F5F.2/27:2/1F43:F.2/
27-GH4.I5JG6510!8_W8$[*
&>$>."淀粉酶基因的表达与纯化
挑取重组子于 (* i($$% 27MCE 摇床培养至
H?
5%%
为 %h5&加入终浓度为 & MMDJ7Z的 _
胞&粗酶液分别经 ,C1,YP( 0@A;3L2HJ0(%% 进行
纯化
&>$>#"淀粉酶酶活的检测
将 #%%
#
ZA+#h# 柠檬酸缓冲液配制的%h& 47Z
的可溶性淀粉和生玉米粉置于 #% i水浴保温
# MCE&加入 &%
#
Z纯酶液在 #% i水浴摇床中反应
&% MCE&利用 R,0 法*#+测定生成还原糖的量 一个
酶活力单位#X$定义为在上述反应条件下&每分钟
转化等价于 &
#
MDJ葡萄糖的还原糖所需的酶量
A?结果与讨论
A=C?6%#?&-0+&"9?*(糖化酶淀粉结合域!8_的克
隆及杂合酶!8_W,$[*的构建
以 5%#K&-0+&"8K*(Q\ %! 的 LR,P为模板&
0/R1G@EG@(0/R13EBCG@EG@为引物<6W获得约 (%% 9A
的片段&双酶切后用相同酶切的质粒 A0 1^$1** 连
接&挑选重组子进行酶切验证&结果如图 $ 所示 测
序结果表明克隆到的 +E 位于
!
淀粉酶基因 $1**
的 #s端&与米根霉糖化酶淀粉结合域氨基酸同源性
为 &%%g
%. 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
b&%
$
R,P7+CEI
%
) b$%RZ$%%% M32a@2)
&%G$&W
&
& L#1
%
双酶切) $%G$&W
&
&:*)+
&
双酶切)
(%G$&W
&
&:*)+
&
&L#1
%
三酶切) .%L#1
%
单酶切
图 A?重组质粒9!#W+@$1[*的酶切验证电泳图
T.;=A?*;54210;06060:F429-2401.15/56G1.127
40:2JH./5/F9651J.I9!#W+@$1[*
K.F-401F4.:F.2/0/YGJ01
A=A?杂合酶!8_W,$[*的纯化
将重组质粒 A0 1^+EE1**导入G>$&/#Sb&% 中&
_
与预测蛋白大小一致 纯酶液用于酶学性质的
测定
A=Q?杂合酶!8_W,$[*与原始酶,$[*酶学性质
的比较
$>(>&"水解淀粉能力
分别以可溶性淀粉和生玉米粉为底物测定杂
合酶与原始酶的酶活&结果汇总见表 & 由表 & 可
知&以可溶性淀粉为底物时&嵌合酶的比酶活由原
来的&*h! X7EMDJ提高到 ($ X7EMDJ&提高了 %h! 倍)
以生 玉 米 粉 为 底 物 时& 嵌 合 酶 的 比 酶 活 由
(.*h( X7
#
MDJ提高到( (*&h$ X7
#
MDJ&提高了 !h*
倍 以不同浓度可溶性淀粉为底物&测定反应速
率&得到 &7@与 &77 之间的关系线&见图 . 由图 .
可以求得 0/R16,*P对可溶性淀粉的 =M值为
$h$(. 47Z&而原始酶的=M为 (h*!. 47Z&可知嵌合
酶对可溶性淀粉的亲和力有所提高
b%A2DB@CE N@C4;BM32a@2) &%AK2CFCL3BCDE DF3MHJ3G@0/R16,*P)
$%AK2CFCL3BCDE DF3MHJ3G@6,*P
图 Q?嵌合酶!8_W,$[*的纯化
T.;=Q?E34.7.:5F.2/275JG6510!8_W8$[*
表 C?嵌合酶与原始酶的比酶活
D5H60C?!90:.7.:5:F.N.FG 27:-.J04.:5JG6510!8_W,$[*5/IK.6IFG90,$[*
酶
相对分子质量7
&%
.
可溶性淀粉为底物 生玉米粉为底物
比酶活7
#X!M4
?&
$
摩尔比酶活7
#X!EMDJ
?&
$
比酶活7
#X!M4
?&
$
摩尔比酶活7
#X!
#
MDJ
?&
$
6,*P 5h!!% $5$h& &*h! #h& (.*h(
0/R16,*P !h%.. . (*h( ($h% .&h ( (*&h$
$>(>$"最适作用条件及热稳定性
以不同 A+缓冲液配制的可溶性淀粉溶液为底
物&分别测定嵌合酶与原始酶的酶活&得到 A+与相
对酶活的关系曲线#图 #$ 在 A+#h# 的条件下在
不同温度下测定酶活&得到嵌合酶与原始酶的温度
相对酶活之间的关系曲线#图 5$ 纯酶液在5# i
下保温 &(((#(&% 和&# MCE后测定其残余酶活&得到
时间与残余酶活之间的关系曲线#图 *$ 由图 #(
图 5 和图 * 可知"嵌合酶的最适作用 A+&最适作用
温度较原始酶均没有明显变化&分别为 #h# j5h% 和
5# i&但嵌合酶的热稳定性有了明显的下降&在
5# i下的半衰期由 &% MCE减少到 . MCE
A=R?讨论
迄今已有多种利用淀粉结合域构建成的嵌合
&."第 # 期 杨"键等"淀粉结合域与
!
淀粉酶的融合表达及其酶学性质
图 R?!8_W,$[*对可溶性淀粉的X./0K504W834]图
T.;=R?X./0K504W834]962F724I0F04J./5F.2/
27A
J
N56307241263H601F54:-
图 @?9"对!8_W,$[*酶活的影响
T.;=@?#70:F1279"2/5JG6510!8_W,$[*
图 V?温度对!8_W,$[*酶活的影响
T.;=V?#70:F127F0J9045F3402/5JG6510!8_W,$[*
图 [?!8_W,$[*在 V@ a下的热稳定性
T.;=[?)440N041.H60F-04J56./5:F.N5F.2/27!8_W,$[*
酶&cD; C`等*5+将来自芽孢杆菌属的环糊精葡萄糖苷
转移酶的淀粉结合域融合到
!
淀粉酶的 6端&构
建成功的嵌合酶与原始酶在酶学性质方面并无明
显差异 +K3等**+将:*$#/0+GA>Y01$(
!
淀粉酶的
生淀粉结合域融合至亮氨酸氨肽酶
"
#ZP<
"
$的 6
端&使后者的酶活提高了 &h& 倍&热稳定性也有了很
大的提高
根据氨基酸序列的相似性以及结合配体的差
异&可将6/b#L329D;HI23B@19CEICE4MDIKJ@$分为 .#
个家族*!+ &而淀粉结合域分布在其中的 5 个家族中
# 6/b$%( 6/b$&( 6/b$#( 6/b$5( 6/b(.(
6/b.&$
*(+
米根霉的糖化酶,端的淀粉结合域属
于6/b$& 家族&该结构域中含有两个碳水化合物结
合位点&分别为 Y2A.*和 YH2($* ?&%+ 淀粉结合域与
!
淀粉酶融合表达获得嵌合酶 0/R16,*P具有生
淀粉水解能力&其比酶活为 .&h X7M4蛋白&较国
内报道的生淀粉酶酶活高*&&+ &且最适作用温度为
5# i&最适作用 A+为 #h# j5h%&热稳定性不依赖
钙离子&与糖化酶十分接近&因而可与糖化酶联合
用于生淀粉同步糖化&具有一定的应用前景
Q?结?论
从5%#K&-0+&"8K*(总W,P中克隆到其糖化酶淀
粉结合域序列&并将其与
!
淀粉酶 6,*P嵌合表
达 嵌合酶在以可溶性淀粉为底物时&酶活较原始
酶6,*P提高了 %h! 倍&而以生玉米粉为底物时其
酶活提高了 !h* 倍&嵌合酶热稳定性也与原始酶有
明显差异
参考文献"
*&+"WD9@2BGDE Q+&TDE4RT&Z@@66&@B3J>,3BC[@D223NGB32L; IC1
4@GBCDE"3a@HGB@A CE @E@24H@FCLC@EB9CD2@FCECE4DF423CE*S+>SDK21
E3JDFP42CLKJBK23J3EI )DDI 6;@MCGB2H&$%%5&#.#$$"(#(1(5#>
*$+"WDI2t4K@:103ED`3W&-[C@ID,&0uEL;@:0>bCL2D9C3JGB32L;19CEI1
CE4IDM3CE *S+>6K2@EB-ACECDE CE bCL2D9CDJD4H&$%%#&! #( $"
$5%1$5*>
*(+"S3E@L@a 0&0@[@Lta S>Y;@@[DJKBCDE DFGB32L;19CEICE4IDM3CE*S+>
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*.+"诸葛斌&姚惠源&诸葛健>生淀粉糖化酶高产菌的选育*S+>微
生物学通报&$%%&&$!#5$"5%15.>
O;K4@/CE&]3D+KCHK3E&O;K4@SC3E>0L2@@ECE43EI MKB3BCE43
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$%%&&$!#5$"5%15.>
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2@IKLCE4GK432*S+>PE3JHBCL3J6;@MCGB2H&&#&(&#($".$51.$!>
$. 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
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9CEICE4IDM3CEGCEBD:*$#/0++0E6#/#+3JA;313MHJ3G@9HFKGCDE NCB;
B;@GB32L;19CEICE4IDM3CE DF:*$#/0+LHLJDM3JBDI@VB2CE 4JKL3ED1
B23EGF@23G@*S+>PAAJC@I 3EI E^[C2DEM@EB3JbCL2D9CDJD4H&$%%%&55
#*$"(%#!1(%5.>
**+"+K3]T&6;Cb6&ZD+)&@B3J>)KGCDE DF:*$#/0++6(*"&6%(")&-%#A
/0+J@KLCE@3MCEDA@ABCI3G@_NCB; B;@23N1GB32L;19CEICE4IDM3CE DF
:*$#/0+GA>GB23CE Y01$( 3JA;313MHJ3G@4@E@23B@G3L;CM@2CL@E:HM@
NCB; @E;3EL@I B;@2MDGB39CJCBH3EI L3B3JHBCL3LBC[CBH*S+>SDK2E3JDF_E1
IKGB2C3JbCL2D9CDJD4Hn/CDB@L;EDJD4H&$%%.&($"$*(1$**>
*!+"ZCK ]KE3E& Z3C]@EBCE4& 6;DK T _& @B3J>0DJKBCDE GB2KLBK2@
DFF3MCJH$& L329D;HI23B@19CEICE4MDIKJ@F2DM 5%#K&-0+&"8K*(
4JKLD3MHJ3G@*S+>/CDL;@MCL3JSDK2E3J&$%%*&.%(#&$"$&1(%>
*+"6;DK T _&<3CYT&ZCK 0 +&@B3J>Y;@F3MCJH$& L329D;HI23B@1
9CEICE4MDIKJ@DF4JKLD3MHJ3G@F2DM5%#K&-0+&"8K*(LDEGCGBGDF
BNDGCB@GAJ3HCE4ICGBCELB2DJ@GCE JC43EI 9CEICE4*S+>/CDL;@MCL3J
SDK2E3J&$%%5&(5#($".51.**>
*&%+ YKE4S]&6;3E4bR&6;DK T _&@B3J>62HGB3JGB2KLBK2@GDFB;@
GB32L;19CEICE4IDM3CE F2DM5%#K&-0+&"8K*(4JKLD3MHJ3G@2@[@3J3
ADJHG3LL;32CI@19CEICE4A3B; *S+>/CDL;@MCL3JSDK2E3J&$%%!&.&5
#&$"$*1(5>
*&&+ 董永存&刘洋&陈源源&等>嗜热菌来源的生淀粉酶分离纯化及
其酶学性质*S+>微生物学报&$%%!#$$"&51&*#>
RDE4]DE4LKE&ZCK ]3E4&6;@E ]K3EHK3E&@B3J>
*S+>PLB3bCL2D9CDJD4CL30CECL3&$%%!#$$"
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
&51&*#>
国外动态
食用醋可造+
$
微生物燃料电池新发展
美国宾夕法尼亚州州立大学近日发布报告称"将食用醋和废水中的细菌短时通电后&能产生干净的氢
燃料&可像汽油一样用于驱动汽车
宾州州立大学教授布鲁斯!罗根#/2KL@ZD43E$介绍&这种,微生物燃料电池-几乎可以将任何可生物降
解的有机材料转变为零碳排放的+
$
罗根说",这是一种运用可降解(可再生有机物生成+
$
的方法-在研究中&罗根及其同事从食用醋中提
炼出醋酸&并将之放入电解槽中&细菌在食用醋酸的同时&释放出电子和质子&并产生了 %h( d的电压 而当
从外界施加另一小额电压时&+
$
即从液体中释放溢出
该方法的效率要超过水分子水解出+
$
和 -
$
的过程 罗根补充说",醋酸电解过程所需能量仅为水解
的 &7&%-因为细菌在电解过程中做了大量工作&包括将有机物分解为亚原子微粒&这使得外来电子很容易
地就可以将释放的微粒重新组合形成+
$
&进而用于汽车驱动 电解过程可以在纤维素(葡萄糖(醋酸盐或其
他可挥发性酸中进行&而水是唯一的电解产物
新的酵母菌株可从木质纤维素原料更有效地使五碳糖发酵
欧洲一个研究团队的研究人员宣布&已使用变革性工程作为合理设计的基因工程的补充&开发出新的
工业酵母菌株 7*$$%*"&)8$(+$("(9#+#*(&它可从木质纤维原料更有效地使戊糖#木糖和阿拉伯糖$发酵 该研
究团队采用了重组菌株#Yb/(%5&$&应用于木糖和阿拉伯糖共利用的集成基因工程化&并将其增加到木糖
和阿拉伯糖的混合物中&以选择稳定的最能使戊糖原料代谢的能力 该研究成果已发表于.SDK2E3J/CDB@L;1
EDJD4HFD2/CDFK@JG/上
荷建成全球最大生物甲醇工厂
荷兰/CDb6,公司发布新闻公报说&该公司在位于荷兰北部小城德尔夫泽尔建成一座生产第二代生物
甲醇的工厂&该工厂生物甲醇年产量将达到 $h# 亿Z&从而成为全球最大的同类工厂
该公司介绍说&新工厂系当地一家旧化工厂改造而成&所生产的第二代生物甲醇主要以有机废弃物为
原料&比如制造肥皂和花生酱等物品时产生的残留物等&通过对这些有机废弃物中的甘油进行提炼&可生产
出生物甲醇
#文伟河$
(."第 # 期 杨"键等"淀粉结合域与
!
淀粉酶的融合表达及其酶学性质