全 文 ：Sep．2008
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生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第5期
2008年9月
溶剂稳定性蛋白酶产生菌
Bacillusichen@rmisYPl的发酵优化
李 霜，陈加罡，何小丹，何冰芳
(南京工业大学 制药与生命科学学院，南京210009)
摘要：溶剂稳定性蛋白酶产生茵BacilluslicheniformisYPl分离自油田土样。考察了碳源、氮源、金属离子等营养
因素对YPI菌株发酵产溶剂稳定性蛋白酶的影响。YPI菌株发酵产胞外蛋白酶的最佳碳源为淀粉。果糖、甘露糖
和乳糖显著抑制产酶；最佳氮源为酵母膏，干酪素、酵母粉和牛肉膏促进产酶，玉米浆和尿素显著抑制产酶。Mn“
可以显著促进酶活，Mg“可以促进产酶，在初步优化的培养条件下，YPl菌株的胞外蛋白酶产量迭980U。
关键词：Baeill驸licheniforrnisYPI；耐有机溶剂；优化
中图分类号：Q814 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)05—0040—04
OptimizationofcultivationconditionsofBacilluslicheniformisYPl
forproducingorganicsolvent-stableprotease
LIShuang，CHENJia—gang，HEXiao—dan，HEBing-fang
(CollegeofLifeScienceandPharmaceuticalEngineering，NanjingUniversityofTechnology，Naming210009，China)
Abstract：Anorga icsolvent··tolerantbacteriumproducinganorganicsolvent·-stableproteasewasisolated
fromsoilandidentifiedasBacilluslicheniformisYPl．Theeffectsofcarbonsource，nitrogensourceand
metalionsontheproductionoforganicsolvent—stableproteaseby trainYPlwereinvestigated．Theb st
carbonsourceWastarch．Fructose，sorbitol，andlactosegr atlyreducedtheproteaseproduction．The
bestorganictrogensourcewasyeastextractpaste．Casein，yeastextractpowder，andbeefextractpaste
suppofledproteaseproductionwhileCOrnsteepliquorinhibitedthproteaseproduction．Theadditionof
metalionsM92+increasedtheproteaseproduction．whileMn2+enhancedtheproteasectivity．Thespe—
cificproteasectivitywasupto980UwhenstrainYPlWascultivatedin heoptimizedmedia．
Keywords：Bacillusl chen@rrnl岱‘YPl；organicsolvent—stableprot ase；optimization
溶剂稳定性蛋白酶(organicsolvent-stableprote-
ase)是一类较新颖的极端蛋白酶，能耐受较高浓度
的各类有机溶剂，可用于有机相催化肽或酯的合成
以及手性拆分等功能。利用蛋白酶在有机相催化
肽合成，可以避免氨基酸的外消旋作用，减少对氨
基酸侧链的保护及脱保护‘1|。溶剂稳定性蛋白酶
应用在催化肽合成中，可望通过提高反应体系中溶
剂的比例而大大提高反应的收率，并使蛋白酶催化
肽合成更具有实用价值。
溶剂稳定性蛋白酶通常由耐有机溶剂的极端
收稿日期：2008-04．17
基金项目：国家973计划资助项目(2004CB719600)；国家863计划资助项目(2006AA022202)
作者简介：李霜(1976一)．女，湖北荆州人．博士，研究方向：极端微生物。
联系人：何冰芳，教授，博士生导师，E-mail：bingfanghe@njut．edu．cn
万方数据
2008年9月李霜等：溶剂稳定性蛋白酶产生菌Bacillus托船凡扣m如YPl的发酵优化·41·
微生物所产生，且以Pseudomonas属细菌居多心。J，
仪有少数文献报道了产生菌为Bacillus属细菌¨1。
Bacilluswhenifom厶YPl分离自油田土样，是一株
天然的溶剂耐受菌，能耐受环己烷、甲苯、二甲基亚
砜(DMSO)等多种溶剂，所产的胞外蛋白酶具有广
泛的溶剂耐受性，对溶剂的耐受体积分数高达
50％，具有良好的应用前景【6j。本文通过考察各种
营养因子对B．1whenifom括YPl产蛋白酶的影响，
优化其发酵条件。
1材料与方法
1．1实验菌株及试剂
耐有机溶剂极端微生物Bacillusl&hen拆。胤扭
YPl，本室分离保藏；酪蛋白(CaseinAcidHydroly—
sate)购自Sigma公司；Folin．酚试剂购自北京鼎国生
物技术公司。
1．2实验方法
1．2．1培养基及培养方法
1)MLB培养基L2J：蛋白胨10g／L，酵母粉
5 g／L，NaCl5∥L，MgS040．5g／L，pH7．2。
2)基本培养基(BM)073：甘油10mL／L，蛋白胨
10g／L，(NH4)2S04l g／L，KH2P040．5g／L，CaCl2
1 g／L，NaCl1 g／L。
分别将BM培养基中的甘油和蛋白胨进行取
代，考察碳源和有机氮源对YPl菌株产蛋白酶的影
响；将BM培养基中的CaCI：成分取代成终浓度为2
mmol／L的各种离子，考察金属离子对YPl菌株产
蛋白酶的影响。各种培养基均调整pH至7．5。以
MLB培养基过夜培养B．1when折orm括YPl获得种子
液，以体积分数2％接种量接人各种发酵培养基，于
30oC，180r／min培养。
1。2．2微生物生长的测定
取发酵液1mL，10000r／min离心1min后，弃
上清液，用1mL无菌水悬浮菌泥，稀释，测样品
的DD660。
1．2．3蛋白酶活力测定
参照文献[8]略改动，以质量分数l％酪蛋白
(0．1mol／LTfis-HCI缓冲液，pH9．0)为底物，以发
酵上清液为粗酶液，取粗酶液0．5mL加入到1mL
底物中，置于40℃水浴中反应10min后，加入3mL
质量分数10％三氯乙酸终止反应，室温下静置15
rain，100 0r／rain离心3min，取上清液lmL加入5
mL0．55mol／L碳酸钠溶液、1mLFolin一酚试剂，充
分混匀后，置40℃水浴显色15min，取出冷却到室
温，以先加入三氯乙酸终止反应的样品为窄白对
照，测样品的A。如。每单位(U)蛋白酶活定义为在
相应条件下，每mL发酵液每rain催化产生1斗g酪
氨酸。
I．2．4蛋白酶溶剂稳定性的测定
取发酵上清液2mL分别与等体积的无菌水
(对照)、二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺
(DMF)混匀，于40℃，180r／rain振荡处理1h，检测
蛋白酶的残余活力。
2结果与讨论
2．1 B．1&hen折。肌括YPl在BM培养基中的生长及
产酶状况
接种B．1wheniform括YPl至BM培养基进行产
酶发酵，每间隔一定时间取样进行细胞生长及蛋白酶
活力测定，结果如图1所示。YPl菌株在BM培养基
中的菌体生长与产胞外蛋白酶成正相关性，培养20h
到达稳定期，菌体细胞密度较稳定；此时发酵液中的
蛋白酶活力亦到达相对稳定的高峰时期，发酵液中的
蛋白酶活力在20～30h内维持稳定，酶活约320—
340U；此后蛋白酶活力显著下降，发酵48h时，蛋白
酶活力保留62％。胞外蛋白酶的产生通常具有群体
敏感性(quorumsensing)，且U在菌体生长的对数后期
具有一定菌体密度后才产生一J。显然，YPl菌株的产
酶调控方式具有特殊性。
4 8 12162024283236404448
t，II
300
2001}g
避
100
O
图1 Baci胍1when咖。观厶YPI在BM培养基中
的生长及产酶状况
Fig．1GrowthcurVeandproteaseproductionofBac讲m
lwhen斩。胁蠡YPlculturedinbasalmedium
2．2碳源对YPl菌株产蛋白酶的影响
将BM培养基中的甘油分别取代为葡萄糖、淀
粉、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露糖和乳糖(质量分数均
万方数据
·42· 生物加工过程 第6卷第5期
为1％)，培养24h，36h后，YPl菌株在各种培养基
中的生长及产蛋白酶的情况如表1所示。YPl菌株
在不含碳源的BM培养基中的生物量及蛋白酶活力
仅为相应对照的46％和67％，表明培养基中添加碳
源对YPl菌株的生长和产酶具有重要影响。YPl
菌株能利用上述各种碳源进行生长，利用淀粉、葡
萄糖、麦芽糖和蔗糖产生的生物量高于利用甘油时
的生物量；培养24h，淀粉、麦芽糖、蔗糖相对甘油分
别提高蛋白酶活力1．62，1．35，1．18倍，其中淀粉为
最佳碳源，YPI菌株利用淀粉时，生物量和蛋白酶产
量及稳定性(24—36h)均较好。单糖对YPl菌株
的产酶效果不及淀粉，葡萄糖对蛋白酶活力的影响
不显著；培养24h，甘露糖、果糖、乳糖分别导致培养
基中蛋白酶活力下降至68％，62％和47％。
表1碳源对Ypl菌株产蛋白酶的影响
Table1 Effectofcarbonsourcesonprotease
productionofstrainYPl
碳源
24h 36h
相对生物量相对酶活相对生物量相对酶活
2．3氮源对YPl菌株产蛋白酶的影响
复杂的有机氮源对微生物胞外蛋白酶的产生
具有重要作用，通过筛选各种有机氮源来大幅促进
微生物产胞外蛋白酶已有较多的报道，其中酵母
膏、牛肉膏、豆粕粉等是常用的有机氮源。
分别考察蛋白胨、酵母膏、酵母粉、牛肉膏、玉
米浆、酪蛋白、脱酚棉籽蛋白、尿素等有机氮源(质
量分数均为1％)对YPl菌株产蛋白酶的影响，结果
如表2所示。YPl菌株在不含有机氮源的BM培养
基中，生物量相对BM培养基降低至42％，而蛋白
酶活力几乎检测不到，表明有机氮源对YPl菌株产
蛋白酶具有重要的诱导作用。
相对蛋白胨，YPl菌株利用酵母膏、干酪素、酵
母粉、牛肉膏和脱酚棉籽蛋白等有机氮源时的生物
量差异不显著，但具有更好的产酶活力。利用酵母
膏为有机氮源培养24h时，发酵液中蛋白酶活力为
对照的2．66倍，其余分别为1．85，1．71，1．63和
1，27倍。以玉米浆和尿素为有机氮源时，YPl菌株
的生物量变化不显著，但发酵液中蛋白酶活力显著
下降。
表2有机氮源对YPl菌株产蛋白酶的影响
Table2 Effectoforganictrogensourceson
proteaseproductionofstrainYPl
有机氮源
24h 36h
相对生物量相对酶活相对生物量相对酶活
2．4无机盐对YPl菌株产蛋白酶的影响
利用终浓度为2mmol／L的各种无机盐(MgSO。、
ZnSO。、CuSO。、MnSO。、FeSO。)取代BM培养基中的
CaCI，成分，培养24h后，考察无机盐对YPl菌株产
蛋白酶的影响，结果如图2所示。添加MgSO。和
MnSO。后显著促进YPI产蛋白酶，培养基中蛋白酶的
活力达1．48和1．91倍，而添加ZnSO。、FeSO。和
CuSO。后培养基中的蛋白酶产量分别下降了约35％，
40％和8％。由于金属离子对蛋白酶本身的活力会
产生影响，因此向BM培养基发酵获得的YPl蛋白酶
液中添加终浓度为2mmol／L的上述各种无机盐后检
测蛋白酶活力，其相对活力如图2所示。酶液中添加
Mn2+，Cu2+和Fe2+能显著促进活力分别达2．76，1．55
和1．21倍，而M92+，Zn2+对活力无显著影响。
万方数据
2008年9月李霜等：溶剂稳定性蛋白酶产生菌BacilluslicheniformisYPl的发酵优化 ·43·
图2无机盐对YPl产蛋白酶及蛋白酶活力的影响
Fig．2Effectofmentalionsonproteaseproduction
andproteaseactivity
2．5 YPl菌株在优化培养基中的产酶状况
根据上述实验结果，获得初步优化的培养基配
方(淀粉10g／L，酵母膏10g／L，(NH。)2S041 g／L，
KH2P040．5g／L，MgS040．25g／L，NaCI1 g／L)，YPl
菌株利用该培养基于30℃，180r／min下培养24h
后，培养基上清液中蛋白酶活力达980U。
由于微生物通常含有多种蛋白酶的同工酶，为
确保优化后的培养基配方中所产的蛋白酶依然具
有溶剂耐受性，对优化后的配方发酵获得的蛋白酶
粗酶液进行溶剂耐受性实验；结果表明YPl菌株在
该培养基中产生的胞外蛋白酶经体积分数50％的
亲水溶剂DMSO和DMF处理后残余活力分别为处
理前的97％和95％。进一步将采用PB试验等方法
进行配方的多因素优化。
3结论
1)BacilluslicheniformisYPl发酵过程中，胞外
蛋白酶产生与菌体生长成正相关，培养至稳定期
时，发酵液中蛋白酶活力最高。
2)YPl菌株发酵产胞外蛋白酶的最佳碳源为
淀粉，果糖、甘露糖和乳糖显著抑制产酶。
3)有机氮源对YPl菌株产胞外蛋白酶具有重
要的诱导作用，酵母膏为最佳氮源，干酪素、酵母粉
和牛肉膏对产酶有促进作用，玉米浆和尿素显著抑
制产酶。
4)Mn2+、Cu2+和Fe“能显著促进YPl蛋白酶
的活力，M92+和Mnh可促进YPl菌株产蛋白酶，
zn“、Cu2+和Fe“抑制菌株产酶。
5)采用经优化的培养基配方，YPl菌株发酵液
中的溶剂稳定性蛋白酶活力可达980U。
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