全 文 ：第 １１ 卷第 ４ 期
２０１３ 年 ７ 月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ４
Ｊｕｌ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０４． ００９
收稿日期：２０１２ － ０５ － １４
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３ 计划） （２０１２ＣＢ７２５２０４）；国家自然科学基金青年基金（２１１０６０６４）；国家自然科学基金重点项目
（２０９３６００２）
作者简介：林　 明（１９９０—），男，山东费县人，硕士研究生，研究方向：酶工程；江　 凌（联系人），讲师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｌｉｎｇ＠ｎｊｕｔ． ｅｄｕ． ｃｎ
基于分子对接的洋葱假单胞菌脂肪酶催化制备
Ｒ Ｎ （２ 甲基 ６ 乙基苯基）丙氨酸的分子机制
林　 明１，２，江　 凌１，２，胡　 燚２，张　 洋２，刘维明２
（１． 南京工业大学 食品与轻工学院， 南京 ２１１８００；
２． 南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１１８００）
摘　 要：采用分子对接方法，研究了洋葱假单胞菌脂肪酶（ＢＣＬ）不对称酯水解制备光学纯的 Ｎ （２ 甲基 ６ 乙基
苯基）丙氨酸（ＮＥＭＰＡ）的分子机制。 通过将立体电子效应的构象约束条件引入计算机分子对接中，在 Ａｕｔｏｄｏｃｋ
４􀆰 ２ 软件中筛选到不同烷基链长的（Ｒ，Ｓ）⁃ＮＥＭＰＡ与 ＢＣＬ 活性口袋合适的反应型构象，对实验数据进行了合理解
释；基于能量最优、空间互补原则，预测了 Ｖａｌ２６６ 和 Ｌｅｕ２８７ 为调控 ＢＣＬ 对映体选择性的关键氨基酸位点，为定点
突变提高 ＢＣＬ的对映体选择性提供了理论指导。
关键词：洋葱假单胞菌；对映体选择性；Ｎ （２ 甲基 ６ 乙基苯基）丙氨酸；脂肪酶；分子对接
中图分类号：Ｑ７１　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０４ － ００４９ － ０６
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ⁃Ｎ⁃（２⁃ｅｔｈｙｌ⁃６⁃ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ａｌａｎｉｎｅ
ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｌｉｐａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｏｃｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ
ＬＩＮ Ｍｉｎｇ１，２，ＪＩＡＮＧ Ｌｉｎｇ１，２，ＨＵ Ｙｉ２，ＺＨＡＮＧ Ｙａｎｇ２，ＬＩＵ Ｗｅｉｍｉｎｇ２
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｌｉｐａｓｅ （ＢＣＬ） ｔｏｗａｒｄｓ Ｎ⁃（２⁃ｅｔｈｙｌ⁃６⁃
ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ） ａｌａｎｉｎｅ （ＮＥＭＰＡ） ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｒａｃｅｍｉｃ ｅｓｔｅｒｓ ｉｎ ｅｓｔｅｒ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｆｉｒｓｔｌｙ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｏｃｋｉｎｇ． Ｈｅｒｅｉｎ， ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｏｃｋｉｎｇ （ ＭＤ ） ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗａｓ
ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｓｔｅｒｅｏ⁃ｓｅｎｓｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｏ ｉｎｖｏｌｖｅ ｔｈｅ ｓｔｅｒｅｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｔｈｅｏｒｙ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ
ｔｏ ｆｉｎｄ ｐｒｏｂａｂｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ （Ｒ，Ｓ）⁃ＮＥＭＰＡ ｅｓｔｅｒｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｌｋｙｌ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈｓ ｉｎｓｉｄｅ ｔｈｅ
ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃａｖｉｔｙ，ｔｈｕｓ ｒａｔｉｏｎａｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ ａｔ ａｎ ａｔｏｍｉｃ ｌｅｖｅｌ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ
ｅｎｅｒｇｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐａｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ， ｗｅ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｚｅ ｔｈａｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ
ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｅｉｔｈｅｒ Ｖａｌ２６６ ｏｒ Ｌｅｕ２８７ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ｔｈｅ ＢＣＬ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ； ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ； Ｎ⁃（ ２⁃ｅｔｈｙｌ⁃６⁃ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ ） ａｌａｎｉｎｅ； ｌｉｐａｓｅ；
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｏｃｋｉｎｇ
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　 　 洋葱假单胞菌脂肪酶 （ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ
ｌｉｐａｓｅ，ＢＣＬ）具有较高的对映体选择性和宽广的底
物谱，被广泛应用于酶催化外消旋酯的不对称水
解以制备手性酸、手性伯醇、手性仲醇等光学纯化
学品［１ － ６］ ，其催化反应机制已有用动力学计算、结
构数据分析和计算机模拟等理论和方法加以阐
释［６ － ７］ 。 目前，基于过渡态理论，采用分子力学
（ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ＭＭ ） 和 分 子 动 力 学
（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃ，ＭＤ）方法的计算机模拟，通过
构建四面体中间态底物（ ｔｅｔｒａｈｅｄｒａｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ，
ＴＨＩ）模型模拟酶促反应过程中形成的过渡态活化
络合物，已被成功应用于酶促反应机制的解析［８］ 。
然而，处于能量最低状态的四面体中间态底物不
能解释不同对映体稳定构象态是如何克服高的能
垒进行相互转变的问题，因为后者是一个典型的
热力学控制过程，涉及量子力学理论范畴。 针对
这一局限性，国内外学者开展了深入研究，提出了
若干解决方案［４ － ５，８ － ９］ 。 如，开发基于量子力学理
论的分子模拟，采用量子力学从头计算的方法，但
计算量大，需要耗费大量的时间、财力和物力，并
且对计算环境也有较高的要求。
Ｌａｔｔｅｓ等［３ － ４］根据“立体电子原理”提出了“立
体敏感效应（ｓｔｅｒｅｏ⁃ｓｅｎｓｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）”，将热力学
控制条件转变为对 ＴＨＩ 三维结构的几何学限制参
数，酶的对映体选择性主要取决于形成过渡态底物
时的构象要求以及酶活性位点和底物取代基间的
空间位阻。 基于这一理论，酶和底物只有生成扭曲
构象 （ ｇａｕｃｈｅ⁃ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ） 而非反式构象 （ ａｎｔｉ⁃
ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）的 ＴＨＩ，才会使反应沿着一个低活化能
途径进行。 该理论已被动力学和热力学分析所验
证，并应用于指导脂肪酶催化仲醇的不对称动力学
拆分反应［５，１０］。
Ｎ （２ 甲基 ６ 乙基苯基）丙氨酸 （Ｎ⁃（２⁃
ｅｔｈｙｌ⁃６⁃ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ，ＮＥＭＰＡ）是合成除草剂异丙甲
草胺的重要中间体，由单一手性的 Ｓ 构型 ＥＭＰＡ出
发，可以合成具有除草活性的 Ｓ 构型的异丙甲草
胺［１１］。 最近，郑良玉教授等成功开发了一种“两步
水解法”制备高光学纯的 Ｒ⁃和 Ｓ⁃ＮＥＭＰＡ （ｅ􀆰 ｅ􀆰 ｐ≥
９８％ ）方法［１２］。 本研究选取 ＢＣＬ 选择性酯水解拆
分制备光学纯 ＮＥＭＰＡ 为目标反应，首次将立体敏
感效应的构象约束条件引入到高效、简单、快速的
分子对接中，通过建立酶和配体 ＢＣＬ 与 （ Ｒ， Ｓ）⁃
ＮＥＭＰＡ的分子对接模型，预测酶和配体的构象结
合，探明酶和底物空间对接的分子识别机制，从分
子水平为 ＢＣＬ 不对称水解制备 Ｒ⁃ＮＥＭＰＡ 提供依
据，并预测调控 ＢＣＬ对映体选择性的关键氨基酸位
点，为下一步定点突变实验提高 ＢＣＬ的对映体选择
性提供理论指导。
１ａ—Ｒ ＝ ＣＨ３；２ａ—Ｒ ＝ Ｃ２Ｈ５；３ａ—Ｒ ＝ ｎ⁃Ｃ３Ｈ７；　 ４ａ—Ｒ ＝ ｎ⁃Ｃ４Ｈ９；５ａ—Ｒ ＝ ｎ⁃Ｃ５Ｈ１１；６ａ—Ｒ ＝ ｎ⁃Ｃ６Ｈ１３；７ａ—Ｒ ＝ ｎ⁃Ｃ８Ｈ１７
图 １　 ＢＣＬ选择性水解外消旋的 ＮＥＭＰＡ烷基酯
Ｆｉｇ． １　 Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｃｅｍｉｃ ａｌｋｙｌ ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ ＮＥＭＰＡ ｕｓｉｎｇ ＢＣＬ
１　 实验方法
１􀆰 １　 受体脂肪酶结构的制备
脂肪酶 ＢＣＬ的 ＰＤＢ 文件由蛋白质结构数据库
（ｈｔｔｐ： ／ ｗｗｗ􀆰 ｒｃｓｂ􀆰 ｏｒｇ ／ ）获取，对应的 ＰＤＢ 结构为
３ｌｉｐ。 ＰＤＢ文件的制备流程如下：将 ＰＤＢ 文件导入
Ｃｈｉｍｅｒａ软件，删除 ＰＤＢ文件中的水分子，提取蛋白
质配体；通过 ＤｏｃｋＰｒｅＰ组件添加省略的氢原子和原
子部分电荷；将催化位点的组氨酸质子化使其所带
电荷为 ＋１，丝氨酸羟基上的氢原子被手动除去，并用
基于 ＧＡＵＳＳＩＡＮ０３ 的 ＲＥＳＰ （ ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）重新计算残基电荷为 － ｌ［１３］。 保存结构为
ｐｄｂｑｔ格式，以备后续对接。
１􀆰 ２　 配体分子的制备
过渡态（ＴＨＩ）底物的结构由 Ｃｈｅｍｏｆｆｉｃｅ ３Ｄ 软
件来构建。 在构建过渡态底物结构时，需要将酯的
羰基 Ｃ原子类型修改成 ３⁃Ｃ（ＳＰ３ 杂化），酰基 Ｏ 原
子的类型修改成 ２⁃Ｏ（ＳＰ２ 杂化），然后定义 Ｃ—Ｏ之
０５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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间的化学键类型为单键，并且删除 Ｃ 原子上多余的
Ｈ原子，加 Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ⁃Ｈｕｃｋｅｌ电荷之后分子总电荷为
－１。 构建成功后转化为 ３Ｄ 结构，在 Ｃｈｅｍｏｆｆｉｃｅ ３Ｄ
中对过渡态底物结构进行能量最小化，通过计算原
子部分电荷得到分子总电荷为 － １，保存结构为
ｐｄｂｑｔ格式，以备后续对接［１４］。
图 ２　 底物和酶对接形成的四面体过渡态示意图（Ｌ表示大分子取代基，Ｍ表示小分子取代基）
Ｆｉｇ． ２　 Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｄｏｃｋｅｄ ｉｎ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｉｔｅ ｏｆ ＴＨＩ
１􀆰 ３　 Ａｕｔｏｄｏｃｋ ４􀆰 ２ 的力场参数修改
为实现与 ＢＣＬ 活性口袋部位的成功对接，手
性底物必须形成特定的四面体过渡态构象，即反
应型构象［１５］ 。 如图 ２ 所示，在反应型构象中，手性
底物的 ２ 个取代基（ Ｌ、Ｍ 表示）分别落在 ＢＣＬ 活
性口袋的空腔中。 为此，受体酶分子活性中心的
丝氨酸 ＯＧ和配体分子羰基碳（ＣＴ）的键长需小于
０􀆰 １５ ｎｍ；同时，受体酶分子和中间态酯分子的 ３
个必需氢键须完全形成（氢键 １ 形成于催化组氨
酸和底物的醇部分氧之间，氢键 ２ 和 ３ 则形成于氧
负离子和氧负离子洞残基之间）。 然而在实际对
接操作中发现，Ａｕｔｏｄｏｃｋ ４􀆰 ２ 的原始力场参数不能
满足上述两个约束条件。 因此，需对 ＯＧ 和 ＣＴ 的
范德华阱深（范德华半径 ｖｄｗ，范德华势能 ε）参数
做相应修改［１６］ ，以免配体分子 ＣＴ 相邻的基团对
丝氨酸 ＯＧ造成较大的空间位阻（如图 ３）。 最终，
本研究将丝氨酸 ＯＧ 原子的范德华参数改为：
ε ＝ ７０ ｋｃａｌ，半径 σ ＝ ０􀆰 １５ ｎｍ，原子类型改为非氢
键形成类型；所有配体 ＣＴ 原子的 ε 为 ３０ ｋｃａｌ，半
径 σ为 ０􀆰 １５ ｎｍ；同时，Ｏ１ 和 Ｏ２ 氢键的 ε 值设置
为 ３０ ｋｃａｌ。
１􀆰 ４　 分子对接操作
使用 Ａｕｔｏｄｏｃｋ ４􀆰 ２ 进行半柔性对接。 允许对接
过程中配体小分子构象发生一定程度的变化，但受
体酶分子是刚性的。 在对接前设置 ５０ × ６０ × ５０ 大
图 ３　 丝氨酸 ＯＧ和配体分子 ＣＴ形成的空间位阻示意
Ｆｉｇ． ３　 Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｒｅｏ⁃ｈｉｎｄｒａｎｃｅ
ｂｅｔｗｅｅｎ Ｓｅｒ⁃ＯＧ ａｎｄ ＣＴ
小的搜索网格（分辨率为 ０􀆰 ０３７ ５ ｎｍ），盒子中心为
催化中心的丝氨酸 ＯＧ 原子。 通过 Ｌａｍａｋｉａｎ 遗传
算法得到产物在受体中的 ５０ 个最优的对接构象。
分析对接结果，查看底物分子与受体蛋白之间的结
合打分以及成键情况，筛选同时满足 ３ 个条件的反
应型构象：①丝氨酸 ＯＧ和配体分子羰基碳（ＣＴ）的
键长需小于 ０􀆰 １５ ｎｍ；②受体酶分子和中间态酯分
子的 ３ 个必需氢键须完全形成；③受体酶分子和中
间态酯分子只有生成扭曲构象。
分子对接程序采用 Ａｕｔｏｄｏｃｋ ４􀆰 ２ 默认的半经验
自由能公式，即对接自由能（ΔＧｄｏｃｋｉｎｇ）通过范德华
力、氢键、静电力和去溶剂化作用力及扭力加和得
到（由公式（１）计算）。
ΔＧｄｏｃｋｉｎｇ ＝ ΔＧｖｄｗ ＋ ΔＧｈｂ ＋ ΔＧｅｌｅｃ ＋ ΔＧｄｅｓｏｌｖ ＋ ΔＧｔｏｒ （１）
１５　 第 ４ 期　 林　 明等：基于分子对接的洋葱假单胞菌脂肪酶催化制备 Ｒ Ｎ （２ 甲基 ６ 乙基苯基）丙氨酸的分子机制
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２　 结果与讨论
２􀆰 １　 ＢＣＬ的活性位点
与其他的脂肪酶一样，ＢＣＬ 对催化作用影响最
大的部位是活性口袋，包括催化三联体中心和底物
结合腔，呈现出上宽下窄的漏斗形状（图 ４）。 催化
三联体在活性口袋底部，由 Ａｓｐ２６４、Ｈｉｓ２８６、Ｓｅｒ８７
组成了一个电荷传递系统，支持酶过渡态中氧负离
子稳定性的氢键共有 ３ 个：一个是与 Ｈｉｓ２８６ 形成，
另外两个是与构成氧负离子洞的 Ｌｅｕ１７ 和 Ｇｌｎ８８ 形
成。 底物结合腔包括一个与底物酰基部位结合的
疏水性口袋区域（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｏｃｋｅｔ，ＨＡ）和一个与
底物醇基部位结合的亲水性口袋区域（ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ
ｐｏｃｋｅｔ，ＨＨ）。 醇基结合部位较窄，对底物的立体选
择性较强，相对而言酰基部分的底物选择性就较
弱。 与其他的脂肪酶相比，ＢＣＬ 的立体结构中其活
性部位“负氧离子空洞”的可利用空间非常有限，因
此表现出较强的立体选择性。
２􀆰 ２　 反应型构象的选择
参照文献［１７］，将 ＢＣＬ催化水解制备光学纯的
ＮＥＭＰＡ实验数据归纳于表 １。 不同烷基链长的（Ｒ，
Ｓ）⁃ＮＥＭＰＡ与 ＢＣＬ活性位点进行对接，每种 ＴＨＩ均
图 ４　 ＢＣＬ催化活性口袋示意
Ｆｉｇ． ４　 Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃａｖｉｔｙ ｏｆ ＢＣＬ ｉｎ
ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ
会形成若干正确的相对位置和合适的取向。 由表 １
可知：随着醇基链长的不断延伸，尤其当从 Ｃ４ 链延
长到 Ｃ５ 链时，ＢＣＬ 催化酯水解的 Ｅ 值急剧下降。
结果表明，碳链基团的增长会同步干扰 ＢＣＬ 催化酯
水解生成 Ｒ型和 Ｓ型光学纯的 ＮＥＭＰＡ的对映体选
择性。 为从分子水平阐明这一变化机制，本研究将
采用立体电子理论指导的分子对接方法，分别对
（Ｒ） － １ａ、（Ｓ） － １ａ、（Ｒ） － ５ａ 和（Ｓ） － ５ａ 这 ４ 个配
体与 ＢＣＬ形成的 ＴＨＩ进行比较和讨论。
表 １　 ＢＣＬ催化酯水解（Ｒ，Ｓ） －１ａ ～ ７ａ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｓｔｅｒｓ ｏｆ （Ｒ，Ｓ） －１ａ ～ ７ａ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＢＣＬ
底物 底物侧链（Ｒ） 反应时间 ／ ｈ 转化率 ／ ％ ｅ． ｅ． ｐ ／ ％ Ｅ值 构象
（Ｒ，Ｓ） １ａ ＣＨ３ ６０ ４８􀆰 ２ ９９􀆰 ０ ＞ １００ Ｒ
（Ｒ，Ｓ） ２ａ Ｃ２Ｈ５ ６０ ４５􀆰 ８ ９９􀆰 ０ ＞ １００ Ｒ
（Ｒ，Ｓ） ３ａ ｎ⁃Ｃ３Ｈ７ ９６ ４２􀆰 ５ ９９􀆰 ０ ＞ １００ Ｒ
（Ｒ，Ｓ） ４ａ ｎ⁃Ｃ４Ｈ９ ９６ ２８􀆰 ６ ９９􀆰 ０ ＞ １００ Ｒ
（Ｒ，Ｓ） ５ａ ｎ⁃Ｃ５Ｈ１１ １２０ ２４􀆰 １ ９０􀆰 ５ ２６􀆰 ５ Ｒ
（Ｒ，Ｓ） ６ａ ｎ⁃Ｃ６Ｈ１３ １２０ ９􀆰 ８ ８４􀆰 ６ １３􀆰 １ Ｒ
（Ｒ，Ｓ） ７ａ ｎ⁃Ｃ８Ｈ１７ １２０ １􀆰 ０ ８０􀆰 ０ ９􀆰 １ Ｒ
　 　 由于每对对映体底物包含 Ｒ ／ Ｓ 两种构型，而在
形成 ＴＨＩ 结构时，羰基碳原子形成第二个手性中
心，因此每对对映体底物共形成 ４ 种 ＴＨＩ 构象。 当
对（Ｒ） １ａ和（Ｓ） １ａ 与受体酶分子活性位点形成
的这 ４ 种构象的分子对接结果进行分析和筛选时发
现，非对映异构体之间的立体选择性产生了明显差
异（图 ５）。 由图 ５ 可知，由于（Ｒ） １ａ 和（Ｓ） １ａ 的
醇基碳链较短，与活性口袋的亲水性口袋区域的接
触空间较大，位阻可忽略不计，此时决定酶分子对
映体选择性的主要为 ＴＨＩ 的酰基结合部位。 其中，
（Ｒ） １ａ中第一个手性中心的 ＣＨ３指向疏水性口袋
区域，这样既增强了配体与酶分子的结合作用力，
使配体与酶充分结合，又不会引起过多的空间位
阻。 而（Ｓ） １ａ 中的 ＣＨ３取代基完全暴露在空腔中
（从活性口袋底部指向上方），同样未增大空间位
阻；虽然配体和酶接触不够充分，Ｓｅｒ８７ ＯＧ和配体
分子羰基碳（ＣＴ）的键长略长（仍小于规定的 ０􀆰 １５
ｎｍ）。 因此，基于传统的能量最低、空间位阻的对接
２５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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原则，无法区分酶与（Ｒ） １ａ和（Ｓ） １ａ 的对映体选
择性孰优孰劣。 然而，比较两者打分结果靠前的低
能构象时发现，（Ｒ） １ａ 与酶构成的 ＴＨＩ 形成了扭
曲式反应型构象，而在（Ｓ） － １ａ中未能找到，表明羰
基碳原子更倾向于形成 Ｒ 构型，这与实验结果完全
符合（表 １）。
图 ５　 ＴＨＩ在酶活性中心的叠加构象示意
Ｆｉｇ． ５　 Ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ＴＨＩｓ ｏｆ （Ｒ） １ａ （ａ） ａｎｄ （Ｓ） １ａ （ｂ） ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎｓｉｄｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ＢＣＬ
　 　 分别与（Ｒ） １ａ、（Ｓ） １ａ 相比，（Ｒ） ５ａ、（Ｓ）
５ａ与受体酶分子形成的 ＴＨＩ 构象变化差异并不显
著，以苯环为主的酰基部分位于酶分子的疏水性口
袋区域，而醇基部分的碳链连接于酶分子的亲水性
口袋区域。 图 ６ 为（Ｒ） ５ａ与受体酶形成的 ＴＨＩ 构
象。 为了使 Ｓｅｒ８７⁃ＯＧ和配体分子羰基碳（ＣＴ）间形
成合适的键长以使底物接近酶分子的活性位点，在
必要部位相互契合，发生相互作用，醇基的碳链构
型必须重新排列。 这必将造成碳链构象折叠程度
的加深，引起对接自由能的增加。 随着碳链的增
长，配体分子无法与酶充分结合而形成低能构象，
导致 ＴＨＩ 的能量大于酶和底物的能量之和，使得
Ｒ ／ Ｓ ２ 种构型的 ＴＨＩ 的对接自由能都变为正值（见
表 ２），造成水解反应不能正常进行。
图 ６　 ＴＨＩ在酶活性中心的叠加构象示意（（Ｒ） ⁃５ａ）
Ｆｉｇ． ６　 Ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ＴＨＩｓ ｏｆ （Ｒ） ⁃５ａ
ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎｓｉｄｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ＢＣＬ
由图 ６ 可知：在（Ｒ） － ５ａ 与 ＢＣＬ 的对接过程
中，配体分子中苯环侧链 Ｃ２ Ｈ５基团和酶分子的
Ｖａｌ２６６ 残基以及醇基末端 ＣＨ３和酶分子的 Ｌｅｕ２８７
残基相隔距离太近，容易造成相互碰撞，增加空间
位阻，并造成 ＴＨＩ形成非反应型的反式构象。 事实
上，已有文献报道这 ２ 个氨基酸残基对于 ＢＣＬ 的立
体选择性起到决定性的作用［２，１８］，这为接下来对
ＢＣＬ进行定点突变分子改造指明了方向。
表 ２　 不同酶 底物复合体的对接自由能
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｄｏｃｋｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ＢＣＬ ａｎｄ ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ
（Ｒ ａｎｄ Ｓ） ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ
底物
ΔＧ对接（Ｒ） － ＴＨＩ ／
（ｋＪ·ｍｏｌ － １）
ΔＧ对接（Ｓ） － ＴＨＩ ／
（ｋＪ·ｍｏｌ － １）
（Ｒ，Ｓ） １ａ － ３􀆰 ５ － ３􀆰 ４
（Ｒ，Ｓ） ２ａ － ２􀆰 ８ － ２􀆰 ７
（Ｒ，Ｓ） ３ａ － ２􀆰 ０ － １􀆰 ８
（Ｒ，Ｓ） ４ａ － １􀆰 ６ － １􀆰 ３
（Ｒ，Ｓ） ５ａ ０􀆰 ６ ０􀆰 ６
（Ｒ，Ｓ） ６ａ ０􀆰 ９ １􀆰 ０
（Ｒ，Ｓ） ７ａ １􀆰 ９ １􀆰 ７
３　 结　 论
将立体电子效应的构象约束条件引入计算机
分子对接中，成功运用于对 ＢＣＬ不对称酯水解制备
对映体纯 ＮＥＭＰＡ 的机制解析。 分子对接实验表
明，配体分子 Ｒ构型与酶构成的 ＴＨＩ 能形成扭曲式
反应型构象，使反应沿着一个低活化能途径进行，
３５　 第 ４ 期　 林　 明等：基于分子对接的洋葱假单胞菌脂肪酶催化制备 Ｒ Ｎ （２ 甲基 ６ 乙基苯基）丙氨酸的分子机制
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这与实验结果完全符合；当醇基碳链延长超过 ４ 个
Ｃ时，配体分子 Ｒ ／ Ｓ 构型均无法与酶充分结合而形
成低能构象，造成水解反应不能正常进行。 同时，
基于空间位阻效应，通过分子对接预测了 Ｖａｌ２６６ 和
Ｌｅｕ２８７ 这 ２ 个氨基酸残基影响 ＢＣＬ的立体选择性。
与其他计算机模拟方法相比，该分子对接流程简
单、快速，能对实验现象做出较合理解释，将给理性
设计酶分子改造提供新的可行方案。 然而，由于
Ａｕｔｏｄｏｃｋ分子对接软件采用的是半柔性对接方法，
并未考虑大分子结构的变化，尤其是催化中心口袋
的氨基酸状态的变化，使得上述方法在预测的精准
度方面大打折扣，有必要在今后的研究中引入分子
动力学 ／量子力学方法加以完善。
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４５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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