全 文 ：用 !"#$%%&’ ’&()$%$’ !"#!菌株谷氨酰转肽酶催化合成$#苄基#谷胱甘肽
贺 忠，荀志金 !
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 %&’’’(）
摘 要：$#苄基#谷胱甘肽是合成谷胱甘肽的一种重要前体化合物。以 )#谷氨酰胺为供体，$#苄基#半胱氨酰甘氨酸
为受体，用 !"#$%%&’ ’&()$%$’!"#%的!#谷氨酰转肽酶催化进行转肽反应，合成得到$#苄基#谷胱甘肽。该化合物进行了
质谱及核磁共振分析，并得到了初步鉴定。
关键词：$#苄基半胱氨酰甘氨酸；!#谷氨酰转肽酶；$#苄基谷胱甘肽
中图分类号：*+++, -. 文献标识码：/ 文章编号：&01% 2 .013（%’’4）’4 2 ’’+1 2 ’4
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&(3( 年，5=DB8=V9 WPGC;C= 等人利用基因工程菌
* - #+%$W#&%菌株发酵所产的!#谷氨酰转肽酶合成 了包括$#苄基 2 谷胱甘肽［&］在内的多种!#谷氨酰
基化合物［%，.］。其中，以 )#谷氨酰胺为!#谷氨酰基
的供体，$#苄基 2半胱氨酰甘氨酸二肽为!#谷氨酰 基受体，在!#谷氨酰转肽酶的催化下，发生!#谷氨 酰基的转移反应，获得了$#苄基#谷胱甘肽。其反应
方程式见图 &。该方法有望开辟一条半合成法制备
谷胱甘肽的新路线。
利用 !"#$%%&’ ’&()$%$’ !"#%菌株的!#谷氨酰 转肽酶为催化剂，以 )#谷氨酰胺作为!#谷氨酰基供 体，$#苄基#半胱氨酰甘氨酸作为!#谷氨酰基受体，
进行酶促转肽反应合成 $#苄基#谷胱甘肽，在国内外 还未见有相同的研究报道。应用酶法催化的转肽反 应，可以省去化学催化所必需的"#氨基保护和脱保 护等的工序，从而大大简化反应过程，有利于提高产 物收率［4，+］。本文进行了酶法转肽合成$#苄基#谷胱
甘肽的实验研究，并对产物进行了初步鉴定。
! 收稿日期：%’’4#&&#&’
基金项目：江苏省高技术项目（XY%’’&’4%）
作者简介：贺 忠（&(1( 2），男，硕士研究生，从事小肽合成的研究。
第 %卷第 4期
%’’4年 &&月
生 物 加 工 过 程
M8=:BJB Z9PF:C@ 9A X=9QF9?BJJ 6:;=:BBF=:;
!9I[ %’’4
·+1·
万方数据
图 ! 酶催化合成 "#苄基#谷胱甘肽反应
$%&’! ()* *+,-./0%1 2-+0)*2%2 3*/10%4+ 45 "#6*+,-7#&780/0)%4+* ! 实验材料与实验方法 !’! 仪器与试剂 !’!’! 菌种 !"#$%%&’ ’&()$%$’ 9:#;菌株［<］为江苏省工业生物
技术重点实验室所保藏，为徐虹教授筛选并鉴定。
!’!’; 培养基
斜面培养基：蛋白胨 !=，牛肉膏 >’?=，氯化钠
>’?=，琼脂 ;=，@A B’>。
种子培养基：谷氨酸 ;=，玉米浆 !=，蛋白胨
>’?=，C;ADEF >’;=，G&"EF >’>;?=，@A B’>。
发酵培养基：葡萄糖 !’?=，蛋白胨 >’?=，玉米
浆 ;=，G&"EF·BA;E >’>!=，C;ADEF >’!=，@A B’?。
!’!’H 试剂
考马斯亮蓝 I#;?>、硫酸铵、牛血清白蛋白均为
分析纯，!J谷氨酰对硝基苯胺、9#甘氨酰甘氨酸、对
硝基苯胺、K J谷氨酰胺均为生化试剂，以上试剂均
由上海化学试剂公司生产，"#苄基#半胱氨酰甘氨酸
和!#谷氨酰转肽酶为实验室自制。
!’!’F 实验仪器
紫外分光光度计 B?;GL（上海精密科学仪器有
限公司）；$DKL 制备液相色谱仪（ MNC(N 公司）； OPLCGN9 LEQK(PR 型高效液相色谱仪，"S"(PG IEKT !<< 型紫外检测器；("UB>>> 质谱仪（美国$%++%&/+公司）；V9EWN#H>>型核磁共振波谱仪（美国
W/3%/+公司）。
!’; 实验方法
!’;’! !#谷氨酰转肽酶的初步纯化
在 ? K发酵罐中按照 B>=装液量加入发酵培养
基，按 ;= 的种子量接入种子液，于 H;’? X、
;>> 3 Y .%+，培养 F> )。然后，离心除去菌体，收集上
清液，在磁力搅拌条件下，缓慢加入固体硫酸铵至
<>=饱和度，F X过夜后离心，收集上清液，继续加
入固体硫酸铵于上清液中至饱和度 Z>=，F X过夜
后离心，收集沉淀，用 ?> ..47 Y K，@A [’>的 (3%2#AL7
缓冲液溶解沉淀，并透析，得到粗酶液。
!’;’; !#谷氨酰肽酶的检测
! \; \; \! 酶活定义［B］
酶活力测定方法为：以 >’[ .K、!>> ..47 Y K 9#
甘氨酰甘氨酸为受体；>’[ .K、>’? ..47 Y K!J谷氨
酰对硝基苯胺为供体，加入稀释 ;?倍的酶溶液 >’F
.K，在 ;’F .K，?> ..47 Y K @A [’> (3%2#AL7缓冲液中
HB X下保温 H> .%+，取上清液，利用 B?;型紫外分光
光度计测定 F!> +. 下的吸光值，空白操作以 >’[
.K、>’? ..47 Y K!J谷氨酰对硝基苯胺取代 >’[ .K、
!>> ..47 Y K 9#甘氨酰甘氨酸。!个!#谷氨酰肽酶酶
活力单位（8+%0）定义为：在上述实验条件下，每 .%+
生成 !".47对硝基苯胺所需的酶量为一个酶活力
单位。
! \; \; \; 比酶活
!#谷氨酰肽酶比酶活定义为：粗酶液中每 .&蛋
白所具有的转肽酶活力。蛋白质含量的测定：O3/]#
543]检测法［[］，标准蛋白为牛血清白蛋白。
!’;’H 酶催化合成 " J苄基 J谷胱甘肽
在 ?> .K三角瓶中加入 "#苄基#半胱氨酰甘氨酸
二肽 >’!HF &，K#谷氨酰胺 >’>BF &，去离子水 !> .K，二
次硫酸铵盐析的!#谷氨酰转肽酶 ! Q，混合均匀后，用
? .47 Y K 9/EA调节 @A至 [’>，搅拌均匀后反应 !> )，
反应温度为 F> X。在其它条件不变的前提下，改变
K#谷氨酰胺与 "#苄基#半胱氨酰甘氨酸二肽的摩尔比
·?[· 生物加工过程 第 ;卷第 F期
万方数据
为 !"#$!、%$!、%"#$!、&$!进行转肽实验。
!"%"’ 产物的分离纯化
反应液经 ("%%!)水相滤膜过滤后，利用硅胶
薄层制备色谱和制备液相色谱系统分离纯化，得到
高纯度产物。薄层制备色谱的分离条件为：固定相
为硅胶 *+%#’，流动相为正丁醇 $冰醋酸$水（’ $!$ !，
体积比）。制备液相色谱分离条件为：色谱柱为麦科
菲柱（反相 ,!-），检测波长为 %#’ .)，流动相为 /：
("%0三氟乙酸，1：甲醇，梯度洗脱 #01 2 &(01；流
速：- )3 4 )5.。
!"%"# 产物定量分析方法
利用 673,法对产物进行定量分析，分析条件
为：色谱柱：汉邦科技，3589:;<=9>: ,!-；流动相：甲醇：
("!0三氟乙酸水溶液（! $?）；检测波长：%#’ .)；流 速：("# )3 4 )5.。 精确称取 ("-! )@ 已纯化的产物，用双重蒸馏 水溶解定容为 !( )3，("%%!)水相滤膜过滤，备用。 精密吸取溶液 %"#、#、!(、%(、’(!3按上述 673,色 谱条件依次进样。测定线性方程和线性范围。 !"%"A 产物的鉴定 对产物进行质谱分析及二级离子（! " # 为 &?A） 质谱分析。对产物进行核磁共振氢谱分析。 ! B% BA B! 质谱分析方法 电喷雾电压：’"# CD；加热毛细管温度：!E# F； 扫描范围：! " # !(( 2 #((。 ! B% BA B% 核磁共振氢谱分析方法 !6谱工作频率：&(( G6H；采样时间：% <；脉冲宽 度：&!<；延迟时间：E <。 ! 结果与讨论 %"! "I谷氨酰转肽酶的初步纯化 采用$%&’(()* *)+,’(’* JKI%菌株发酵产酶，经两次
硫酸铵盐析后，酶活大为提高，所得结果如表 !所示。
表 ! "I谷氨酰转肽酶的初步纯化
LMNO> ! 7P:5Q58MR5;. ;Q"I@OPRM)SOR:M.<=>=R5TM<>
比活力 4（U4 )@）
游离酶液 ("AA
一次硫酸铵盐析上清液（饱和度 A(0） !"##
二次硫酸铵盐析沉淀（饱和度 ?(0） %"’-
%"% 反应物摩尔比对反应的影响
3I谷氨酰胺与 VI苄基I半胱氨酰甘氨酸二肽的不
同摩尔比，对反应转化率有较大的影响，其结果见表 %。
表 % 反应物摩尔比对反应的影响
LMNO> % WQQ>8R ;Q );O> :MR5; ;Q :>M8RM.R ;. R9> S5>OT ;Q R9> >.HSI
)MR58 :>M8R5;.
反应物摩尔比 反应转化率（0）
!：! ’"%!
!"#：! #"&%
%：! A"?E
%"#：! #"!’
&：! ’"&&
由表 %可以看出，3I谷氨酰胺与 VI苄基I半胱氨
酰甘氨酸二肽的最佳摩尔比为 % $!。
%"& 产物的分离纯化
产物经过薄层制备色谱和制备液相色谱纯化，
得到高纯度（??0）产品，见图 %。
图 % 产物的 673,谱图
+5@B% ,9:;)MR;@:M) ;Q R9> =:;TP8R
%"’ 线性方程和线性范围
液相色谱定量分析条件见 !"%"#，在本实验条
件下，产物色谱峰与杂质色谱法可以达到基线分离。
以峰面积积分值（ -）对取样量（.，!@）进行回归统
计，回归方程为：- X ("&!-. Y ’("--#，/ X ("?!?#，
线形范围 ("(’ 2 &"%’!@。
%"# 产物的鉴定
% B# B! 质谱分析结果（图 &）
图 & 样品的质谱图
+5@B& GM<< <=>8R:;)>R:S ;Q R9>
%((’年 !!月 贺 忠等：用 $%&’(()* *)+,’(’* JKI%菌株谷氨酰转肽酶催化合成 VI苄基I谷胱甘肽 ·#?· 万方数据 从图 ! 可知，在 ! " #!"#$% 处出现了很强的负
离子峰，为分子离子峰 & ’ %。因此该物质的分子量
为 !"(，与 )*苄基*谷胱甘肽的分子量相一致。为了
进一步鉴定该物质的分子组成，对该负离子做二级
质谱检测，检测结果如图 +所示。
图 + 样品的二级质谱图
,-./+ )01234567 8599 9:01;6280;67 2< ;=0 958:>0
&)（! " #）：!(?$@（%?，&*A*ABC），B(%$"（!?，&*
D#AE*DAB*)*BA），BE!$"（ %@@，&*D#AE*DAB*)*ABC* BA），B@"$"（%+，&*D#AE*DAB*)*ABC*BA*DCB），%(?$" （!@$E，&*D#AE*DAB*)*ABC*!A*DCB*DAB*FAB），%+B$" （B%，ACCD*DA（FAB）*DAB*DAB*DCFA*BA），%B($?，
（%+，ACCD*DA（FAB）*DAB*DAB*DC*BA）。
通过二级质谱特征碎片峰分析可知，该物质的
分子结构与 )*苄基*谷胱甘肽的分子结构相一致，并
在高质量区域，主要质谱峰均有较合理的解释，从而
进一步推知该物质是 )*苄基*谷胱甘肽。
B /E /B 核磁共振分析结果特征峰分析
产物%AF&G!（HBC）：B$%+( +（BA，8，*DAB*）， B$+"B (（BA，8，*DAB*），B$?@" @，B$"#" "（BA，4，4，*)*
DAB*DA*），!$?%B +（ BA，9，D#AE*DAB*)*），!$?%B +
（%A，*DA（FAB）*），!$"E% ?（BA，9，*FA*DAB*DCCA）， +$+B? %（ %A，8，*FA*DA*DC*），($!"+ #（ EA，8， D#AE*）。 其中，*)*DAB*DA*中亚甲基上的两个氢受到苄 基苯环的影响，而裂分为两个二重峰。D#AE*DAB*)* 中的亚甲基与*DA（FAB）*中次甲基的化学位移基本 相同，因此，两个峰重叠在一起。根据核磁共振谱图 初步分析，产物分子结构与 )*苄基*谷胱甘肽的结构 相符。从而可以初步确定得到的产物为 ) ’苄基 ’ 谷胱甘肽。 ! 结论 实验表明，以 ) ’苄基 ’半胱氨酰甘氨酸为"* 谷氨酰基受体，I ’谷氨酰胺作为"*谷氨酰基供体， 在$%&’(()* *)+,’(’* FJ*B的"*谷氨酰转肽酶的催化下
可以合成 ) ’苄基 ’谷胱甘肽。应用 $%&’(()* *)+,’(’* FJ*B的"*谷氨酰转肽酶催化合成 ) ’苄基 ’ 谷胱 甘肽，目前产物收率仍较低，需要通过基因工程手段 提高"*谷氨酰转肽酶的酶活和转肽反应的选择性， 这将有待于进一步研究。 感谢：本文核磁共振波谱分析是由南京大学魏 金华老师提供，并衷心感谢他给予对谱图分析的指 导。 参考文献： ［%］ A-40=-K2 LM85.5-，N5K59=- O1=-.2，A-407MK- )MPMK-，0; 5>$ )73;=09-9
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;=0"*.>M;587>;6539:0:;-4590 6051;-23 <26 .>M;5;=-230 973;=09-9［ U］$U2M635> 2< V-2;01=32>2.7，%"?"（"）：%B"*%!?$
［+］ A-407MK- )MPMK-，)=M39MK0 >PMK5，F2TMK5PM &-75K5X5，0; 5>$O3P785;-1 :624M1;-23 2< ;=053-30，53“M858-”128:2303; X-;= T51;06-5>"*.>M* ;587>;6539:0:;-4590［U］$ O3P780 534 &-162T-5> N01=32>2.7，B@@B（#）：
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