全 文 ：第 １２卷第 １期
２０１４年 １月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ １２ Ｎｏ １
Ｊａｎ ２０１４
ｄｏｉ：１０ ３９６９ ／ ｊ ｉｓｓｎ １６７２－３６７８ ２０１４ ０１ ００９
收稿日期：２０１３－１０－１７
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２０１１ＣＢ７０７４０４）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１１ＢＡＤ２２Ｂ０２）；中科院科研装备
研制项目（ＹＺ２０１１３８）；青岛市科技计划基础研究项目（１３⁃１⁃４⁃１９６⁃ｊｃｈ）
作者简介：刘亚君（１９８３—），女，山东青岛人，博士，副研究员，研究方向：厌氧梭菌代谢工程改造及纤维小体结构与功能研究；崔 球（联系
人），研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｃｕｉｑｉｕ＠ ｑｉｂｅｂｔ ａｃ ｃｎ
典型产纤维小体梭菌的遗传改造及其在纤维素
乙醇中的应用研究进展
刘亚君，崔古贞，洪 伟，张 杰，崔 球
（中国科学院 青岛生物能源与过程研究所，青岛 ２６６１０１）
摘 要：以解纤维梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）和热纤梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）为代表的产纤维小体梭菌可
以直接完成从木质纤维素原料到乙醇的生物转化，是用于通过整合生物加工技术生产纤维素乙醇的优良候选菌
株。 然而，这些产纤维小体梭菌的纤维素降解效率及乙醇产量尚不能满足工业化生产的要求，其遗传改造技术的
不成熟严重制约了通过定向代谢工程改造提高生产性能的进程。 针对这些典型的产纤维小体菌株，各国科学家近
年来在基于二类内含子的嗜中温及嗜高温遗传改造平台建立方面取得了较大突破，并通过靶向代谢工程改造，显
著提高纤维素乙醇的产量。 笔者对这些前期研究工作以及国内外相关研究成果进行系统的总结，并对构建的遗传
改造工具的应用前景进行展望。
关键词：纤维小体；纤维素降解；乙醇；代谢工程；二类内含子
中图分类号：Ｑ９３５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０１－００５５－０８
Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ
ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＬＩＵ Ｙａｊｕｎ，ＣＵＩ Ｇｕｚｈｅｎ，ＨＯＮＧ Ｗｅｉ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉｅ，ＣＵＩ Ｑｉｕ
（Ｑｉｎｇｄａｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ ａｎｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ａｒｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈａｔ
ｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅｙ ａｒｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ
ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓ ｔｏｏ ｌｏｗ ｔｏ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｃｋ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｏｌｓ ｉｎｈｉｂｉｔｓ
ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｉｍｅｄ ａｔ ｈｉｇｈｅｒ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｃｅｎｔｌｙ，ｇｒｏｕｐ ＩＩ ｉｎｔｒｏｎ⁃ｂａｓｅｄ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ｏｒ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅｓｅ
ｔｙｐｉｃａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ Ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｗｏｒｋ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ａｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ
ｆｕｒｔｈｅｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｏｌｓ ｉｓ ｐｒｏｓｐｅｃｔｅｄ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ；ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ；ｅｔｈａｎｏｌ；ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ｇｒｏｕｐ ＩＩ ｉｎｔｒｏｎ
随着经济的高速发展，能源紧缺以及环境污染
已成为世界范围内日益严峻和亟待解决的问题，我
国也面临着相同的挑战。 木质纤维素等生物质能
源原料供应丰富且环境友好，是唯一可大规模再生
且全面替代石化原料的资源［１－２］。 因此，大力发展
纤维素基能源及化工品的生产对缓解国家能源供
需矛盾、减少化石能源消耗、保护生态环境具有重
要意义，是加快发展循环经济、保障国家能源安全
的一项重要战略任务［３－６］。
整合生物加工（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ＣＢＰ）
技术是从纤维素原料到乙醇的一锅法生产策略，能够
极大简化其生产工艺，降低成本［３］。 通过 ＣＢＰ 生产
乙醇，需要生产菌株同时具备纤维素酶生产、纤维素
水解和下游产物发酵等能力，以解纤维梭菌
（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）和热纤梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）为代表的产纤维小体厌氧梭菌初步具
备以上特征，可以直接完成从木质纤维素原料到乙醇
的生物转化，因此是可用于 ＣＢＰ 纤维素乙醇生产的
优良候选菌株［７－８］，在工业应用中具有巨大的潜力。
然而，野生型产纤维小体梭菌的纤维素乙醇产
率普遍较低，还不能满足工业化规模生产的要
求［９］，需要在合成生物学及系统生物学技术的指引
下进行大量的遗传工程改造。 这些厌氧革兰氏阳
性菌的遗传改造技术目前尚不成熟，操作复杂、局
限性大，难以实现高效、快速、精准的定向代谢工程
改造。 基于上述问题，包括笔者所在研究团队在内
的国内外研究学者系统开发并完善了基于二类内
含子的嗜中温及嗜高温遗传改造平台，可以快速高
效实现靶向基因敲除、敲入和可控表达，并通过开
发的靶向代谢工程改造技术，系统性地应用于产纤
维小体梭菌的代谢工程改造中，实现了纤维素乙醇
产量的显著提高［１０－１１］。 本文中笔者全面综述以热
纤梭菌和解纤维梭菌为代表的产纤维小体梭菌遗
传改造平台的建立及其在纤维素乙醇生产应用方
面的研究工作，包括 ＤＮＡ 转化技术、报告基因系统
及外源蛋白表达技术、靶向基因敲除等遗传工具平
台方面的进展以及靶向代谢工程改造和代谢瓶颈
分析等纤维素乙醇应用方面的内容。
１ 嗜中温梭菌 Ｃ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ 的研
究进展
１ １ 遗传操作工具的开发和改良
１ １ １ 转化方法
解纤维梭菌的外源 ＤＮＡ导入方法在 ２０００ 年就
有报道，后又发展出基于电转化的 ＤＮＡ 导入方法，
其遗传转化流程主要包括细胞培养、离心和洗涤、
高压脉冲电场转化、电转化后的复苏及平板计数
（图 １）。 然而，解纤维梭菌的转化效率一直处于较
低水平，约为 １０２个 ／ μｇＤＮＡ［１２－１３］，难以满足基于同
源重组的遗传改造的需要。 为提高转化效率，笔者
所在实验室研究人员对其遗传转化条件进行了系
统性优化，首先对电转化脉冲的电场强度、电阻、电
容、电转化缓冲液和电转杯直径等因素进行了优
化，发现利用常规电转化仪，电转化条件为 ２ ０００ Ｖ、
１ ０００ Ω、２５ μＦ、０ ４ ｃｍ的电转杯时可以获得较好的
转化效率，比前人报导提高了约 ３ 倍（３ ０×１０２个 ／
μｇ ＤＮＡ） ［１４］；通过继续利用氨苄青霉素、异烟肼、苏
氨酸及甘氨酸等细胞壁弱化剂对 Ｈ１０ 的感受态细
胞进行孵育处理，实现了转化效率的进一步提高。
结果表明，当使用 １０ ｍｇ ／ ｍＬ 的甘氨酸时，转化效率
可以再提高一个数量级［１０］；最后，通过进一步研发
新型的基因导入装置 ＭＴ０１ ３ｋＶ，使转化效率提高
到 ５ ３×１０４个 ／ μｇ ＤＮＡ［１５］，可以基本满足同源重组
实验的要求。
图 １ 解纤维梭菌遗传转化流程［１４］
Ｆｉｇ １ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ［１４］
１ １ ２ 外源蛋白的表达及报告系统
解纤维梭菌中外源蛋白的表达已通过转化表
达质粒得以实现［１６－１７］，但相关研究仍较少，这可能
与表达体系不稳定或表达蛋白检测手段不完善有
关。 绿色荧光蛋白是监测基因表达、蛋白定位、蛋
白功能及相互作用的强有力工具，但其发色团的形
６５ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
图 ２ ＭＴ０１ ３ｋＶ系统电脉冲参数［１４］
Ｆｉｇ ２ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｃｕｓｔｏｍ ＭＴ０１⁃３ｋＶ ｓｙｓｔｅｍ［１４］
成需要 Ｏ２的参与，并不适用于厌氧环境［１８
－１９］。
ＰｐＦｂＦＰｓ 来 源 于 恶 臭 假 单 胞 菌 （ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ），是依赖于黄素单核苷酸发光的厌氧荧光蛋
白，可用于建立厌氧微生物中荧光蛋白报告系
统［２０－２１］。 笔者所在实验室研究人员根据解纤维梭
菌的密码子偏爱性优化设计及合成了 ＰｐＦｂＦｐｍ 基
因，将 ＰｐＦｂＦｐｍ基因置于丙酮丁醇梭菌硫激酶基因
启动子和转录终止子之间，用 Ｐｓｔ Ｉ 和 Ｎａｒ Ｉ 双酶切
后与经同样双酶切的 ｐＩＭＰ１ 质粒连接，构建了厌氧
荧光蛋白表达质粒 ｐＭＴＣ６，并通过质粒转化，实现
了荧光蛋白在 Ｈ１０胞内的表达（图 ３） ［１０，１４］。
图 ３ ＰｐＦｂＦｐｍ表达质粒 ｐＭＴＣ６的构建
及 Ｈ１０菌株的胞内荧光检测［１４］
Ｆｉｇ ３ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＴＣ６ ａｎｄ
ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｐＦｂＦＰｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ
Ｈ１０ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｍａｇｉｎｇ［１４］
１ １ ３ 基于 ＣｌｏｓＴｒｏｎ的靶向敲除方法
ＣｌｏｓＴｒｏｎ是一种基于乳酸乳球菌来源的二类内
含子 Ｌｌ ｌｔｒＢ 构建的基因敲除系统。 利用 ＣｌｏｓＴｒｏｎ
方法进行基因靶向敲除主要包括 ｔａｒｇｅｔｒｏｎ 质粒构
建、质粒转化、抗生素筛选转化子及 ＰＣＲ验证 ｉｎｔｒｏｎ
插入等步骤。 与同源重组的方法相比，ＣｌｏｓＴｒｏｎ 方法
具有高效快速的优势，并已有在线工具 （ ｈｔｔｐ： ／ ／
ｃｌｏｓｔｒｏｎ ｃｏｍ ／ ）支持 ｔａｒｇｅｔｒｏｎ 的设计，因此在梭菌中
已经被广泛应用［２２－２４］。 已知的解纤维梭菌的靶向敲
除主要也是采用这一技术［１７，２５－２７］。 然而，这种方法在
解纤维梭菌中的应用还有如操作过程复杂、突变株筛
选过程耗时长等不足，为此，笔者所在实验室研究人
员对 ＣｌｏｓＴｒｏｎ系统进行了系统的优化升级［１０，１５，１７］。
图 ４ 基因 ｃｃｅｌ２８６６的靶向敲除与鉴定
Ｆｉｇ ４ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｃｅｌ２８６６ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ
１ １ ３ １ 非甲基化质粒转化系统的构建
已知 Ｈ１０中具有限制性修饰酶 ＭｓｐＩ 的表达基
因 ｃｃｅｌ２８６６，ＭｓｐＩ能降解外源 ＤＮＡ 实现细菌的自我
保护，因此，用于转化的外源 ＤＮＡ 必须进行预甲基
化以克服这一防御机制，从而使得遗传改造过程复
杂化。 为了实现不需预甲基化的遗传操作，简化操
作步骤并减低成本，笔者所在实验室研究人员构建
７５ 第 １期 刘亚君等：典型产纤维小体梭菌的遗传改造及其在纤维素乙醇中的应用研究进展
了基于 ｐＳＹ６的 ｔａｒｇｅｔｒｏｎ质粒ｐＳＹ６ ｍｓｐＩ（图 ４（ａ））
用于基因 ｃｃｅｌ２８６６ 的靶向失活。 将该质粒转化到
Ｈ１０细胞中，通过红霉素筛选，获得阳性转化子，通
过菌落 ＰＣＲ验证，验证 ｔａｒｇｅｔｒｏｎ 在靶位点的插入及
ｃｃｅｌ２８６６的敲除（图 ４（ｂ）），随机挑取了 ４８ 个菌落，
均显示为阳性菌落，内含子插入的效率为 １００％。
进一步通过 ＭｓｐＩ酶活性检测发现，突变株细胞提取
物丧失了限制性内切酶活性，不能降解非甲基化的
质粒（图 ４（ｃ））。 通过平板计数法检测甲基化和非
甲基化的 ｐＳＹ６ 质粒分别转化野生型和 ｃｃｅｌ２８６６ 突
变型菌株的转化效率，进一步证实，利用突变菌株
能够获得非甲基化质粒的转化子，且转化效率同野
生型菌株转化预甲基化质粒的效率相似。 由此，获
得了无需预甲基化操作的遗传操作系统，大大简化
了基因工程改造的步骤［１０］。
１ １ ３ ２ 基于 ｐｙｒＦ筛选系统的连续靶向敲除方法
的构建
要实现解纤维梭菌的多基因连续操作，需要对
前一步获得的工程菌株进行质粒丢失，否则无法进
行后续实验。 但是，目前在解纤维梭菌中能够使用
的质粒的丢失效率非常低，每代的丢失率大约是
４ ７×１０－３ ［１２］，因此，利用上述开发的遗传操作工具
对 Ｃ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ进行基因工程改造仍存在一个瓶
颈，即如何有效地实现质粒的丢失。 为解决这一问
题，笔者实验室构建了基于 ｐｙｒＦ 的双向筛选系统。
基因 ｐｙｒＦ编码乳清核苷酸 ５ 磷酸脱羧酶，是嘧啶
生物合成的关键基因，同时也是抗代谢物 ５ 氟乳清
酸（５⁃ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ ａｃｉｄ，５ ＦＯＡ）的靶位点，可以作为
有效的选择压力促进质粒的丢失［２８－２９］。
Ｃｕｉ等［１５］首先通过同源重组的策略获得了 Ｈ１０
的 ｐｙｒＦ 突变株，作为底盘细胞进行下游操作；然后
将 ＣｌｏｓＴｒｏｎ 系统中的 ｔａｒｇｅｔｒｏｎ 质粒系统进行改造，
加入 ｐｙｒＦ的表达框，并用其在底盘细胞中进行其他
靶基因的敲除；在确定获得相应突变株后，将其接
种到含有 ＦＯＡ 的培养基中。 由于质粒上含有 ｐｙｒＦ
的表达框，ＦＯＡ 的筛选压力就会促进质粒的丢失。
最终，当突变株无法在添加有红霉素抗生素的培养
基中生长时，就获得了质粒丢失的菌株，并可以采
用同样的策略进行下一轮的基因操作，从而实现了
基因的连续敲除。
１ ２ 通过基因工程改造提高乙醇产量
厌氧纤维素降解菌中，纤维素底物经过水解形
成可溶性单糖或寡糖，在进入胞内经过糖酵解途径
形成丙酮酸，再经过丙酮酸这一关键中间产物，进
行乙醇合成途径，因此，要提高乙醇产量可以通过
切断丙酮酸到乙酸、乳酸的合成途径，并且同时增
强微生物催化丙酮酸合成乙醇的代谢途径，从而源
于糖酵解的代谢流尽可能多的导向乙醇合成的方
向，从而使得乙醇产量大幅度提高（图 ５）。
１—胞外纤维素降解；２—丙酮酸黄素氧化还原酶；
３—铁氧化还原蛋白依赖的氢酶；４—黄素 ＮＡＤ＋（Ｈ）氧化还原酶；
５—乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）；６—乙醛脱氢酶；７—乙酸激酶；
８—磷酸转乙酰基酶 （ＰＴＡ）；９—乙醇脱氢酶；Ａ—丙酮酸脱羧酶；
Ｂ—乙醇脱氢酶；方框表示代谢途径不存在
图 ５ 厌氧梭菌纤维素乙醇代谢工程改造设计方案
Ｆｉｇ ５ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｌａｎ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ
ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ
Ｇｕｅｄｏｎ等［１６］将来自运动发酵单胞菌的“丙酮
酸 乙醛 乙醇”代谢途径引入到 Ｃ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ 中，
从而使乙醇产量提高了 ５３％。 Ｌｉ 等［２６］ 实现了
Ｃ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ中乳酸脱氢酶 Ｌｄｈ 基因（ｃｃｅｌ２４８５）和
苹果酸脱氢酶基因（ｃｃｅｌ０１３７）的敲除，从而切断了从
丙酮酸到乳酸转化途径，使乙醇产量提高了 ８ ５ 倍。
然而，解纤维梭菌的乙酸产量也较高。 因此要进一步
提高其乙醇产量，还需要对乙酸合成途径进行阻断。
乙酸合成的最后一步则由乙酸激酶 Ａｃｋ
（ｃｃｅｌ２１３６） 催化，因此，Ｃｕｉ 等［１０］同时构建了突变株
Ｈ１０Δｌｄｈ和 Ｈ１０Δａｃｋ，并利用已建立的遗传操作平台
中的非甲基化系统，构建了突变株 Ｈ１０ΔｍｓｐＩΔｌｄｈ 和
Ｈ１０ΔｍｓｐＩΔａｃｋ，分别实现 ｃｃｅｌ２４８５和 ｃｃｅｌ２１３６的靶向
８５ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
敲除，并对其生长状态和发酵产物进行了系统分
析［１０］，发现 ｍｓｐＩ基因的敲除使得乙酸和乳酸的产量
比野生型分别提高了 ３８ ２％和 １４ ８％，但是乙醇的产
量下降了 ３６ ５％，说明 ｍｓｐＩ 基因的失活影响了细胞
内代谢流的变化，因此，Ｈ１０ΔｍｓｐＩ不适用于作为乙醇
合成代谢工程改造的出发菌株。 比较 Ｈ１０Δｌｄｈ 和
Ｈ１０Δａｃｋ与野生菌 Ｈ１０发现，ＬＤＨ或者 ＡＣＫ的敲除
都可以显著提高乙醇的产量，比野生型乙醇产率分别
提升了 ３０％及 ５０％ ［１０］。 这说明，在今后工作中应整
合两种代谢工程改造策略，并结合发酵方法的优化，
以实现 Ｈ１０的乙醇产量的进一步提高。
２ 嗜高温梭菌 Ｃ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ 的研究
进展
２ １ 遗传改造平台的建立
热纤梭菌 Ｃ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ 等高温厌氧纤维素降
解菌具有纤维素降解效率高、发酵过程污染几率小等
独特的优点，是作为木质纤维素 ＣＢＰ 糖化的优选目
标微生物。 然而，热纤梭菌是嗜热革兰氏阳性厌氧
菌，遗传操作手段缺乏，相关技术主要掌握在多特蒙
德大学 Ｌｙｎｄ实验室［３０－３２］，这大大阻碍了热纤梭菌在
纤维素乙醇中应用的研究。 近年来，笔者所在实验室
研究人员通过一系列的硬件和软件的开发，逐步建立
及完善了针对这一嗜热微生物的遗传改造工具箱，能
够实现与现有技术相比更加高通量高效的遗传操作。
２ １ １ 外源 ＤＮＡ的导入方法
Ｌｙｎｄ实验室在 ２００４ 年就首次报道了热纤梭菌
的电转化方法，然而一直难以重复［３３］。 为了解决这
一难题，笔者在遗传转化软硬件方面进行了一系列
研究，开发了新型基因导入装置 ＭＴ０１ ３ｋＶ，并对
电转化条件进行系统的优化，包括细胞生长时期、
电转缓冲液组分、细胞壁弱化剂、电转化频率、脉冲
数、电压、占空比等多个参数的优化，最终建立了较
高效的热纤梭菌电转化方法（ＯＤ６００约为 ０ ８，１ ５
ｋＶ，５０ μｓ １ 次脉冲，１０％占空比，５０ 个脉冲），同时
对质粒骨架进行优化，采用来源于地热芽胞杆菌的
质粒复制子，最终将转化效率提高到 １０５个 ／ μｇ
ＤＮＡ，可以满足后续的外源表达及靶基因敲除等遗
传操作的需要。
２ １ ２ 外源蛋白的表达及报告系统
热纤梭菌中外源蛋白的表达鲜有报道，目前只实
现了内源蛋白 ＣｉｐＡ和 Ｂｇｌ在热纤梭菌胞内的可检测
表达［３１，３４］。 这可能是由于厌氧微生物代谢水平低，
不能支持蛋白的大量表达，或热纤梭菌中存在特殊的
防御机制，阻止外源蛋白的表达。 为实现热纤梭菌外
源蛋白的可检测表达，并同时建立可靠的报告系统，
笔者构建了厌氧荧光蛋白 ＰｐＦｂＦｐｍ 的表达载体
ｐＨＴＭ００３，并转化至 Ｃ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＤＳＭ１３１３ 细胞
中，实现了厌氧荧光蛋白的表达（图 ６）。
１、２—ｐＨＴＭ００３转化子在可见光源和荧光光源下的照片；３、４—空质粒转化子在可见光源和荧光光源下的照片
图 ６ ＰｐＦｂＦｐｍ在热纤梭菌中的表达
Ｆｉｇ ６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰｐＦｂＦｐｍ ｉｎ Ｃ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ
２ １ ３ 基因敲除方法
２ １ ３ １ 随机突变技术
Ｚｖｅｒｌｏｖ等［３５］通过甲基磺酸乙酯对热纤梭菌
野生菌株进行诱变，筛选到 ６ 株具有新型 ＩＳ３ 家族
的转座子 ＩＳ１４４７ 的热纤梭菌突变株。 然而这种随
机的转座突变技术需要建立突变体库并针对研究
目的进行筛选。 这种方法通常受限于筛选手段且
需要较大工作量，因此不能满足热纤梭菌高通量
的系统代谢工程改造的需要。
２ １ ３ ２ 同源重组技术
同源重组技术依赖于同源臂与基因组上靶基
因序列的配对和交换，具有准确性高的优势，因此
９５ 第 １期 刘亚君等：典型产纤维小体梭菌的遗传改造及其在纤维素乙醇中的应用研究进展
图 ７ Ｃ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＤＳＭ１３１３中基因 ｐｙｒＦ敲除的
原理示意及 ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ ７ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒＦ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ
Ｃ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ＤＳＭ１３１３ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎｄ
ｔｈｅ ＰＣＲ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ
已经应用到热纤梭菌的靶基因敲除和敲入中（图 ７
（ａ）），然而，该方法成功率较低。 从转化方法建立
到现在近 １０年的时间里，只得到了 ５ 种基因（ ｌｄｈ、
ｐｔａ、ｐｙｒＦ、ｃｉｐＡ 和 ｃｅｌ４８Ｓ）敲除的突变株［３０，３６－３８］。 此
外，通过同源重组的方法对基因组靶位点的基因进
行敲除或敲入需要引入抗生素抗性基因等筛选标
记，且筛选标记会整合到基因组，不能循环使用，这
严重限制了遗传改造的深度。 Ｈｅａｐ 等［３９］改进了同
源重组方法，通过引入反向筛选标记实现了对筛选
标记进行循环使用，但操作步骤仍较复杂。
２ １ ３ ３ 基于嗜热 ｔａｒｇｅｔｒｏｎ基因打靶技术
为了实现热纤梭菌高效快速的靶向基因敲除，笔
者所在实验室与德克萨斯大学奥斯汀分校 Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ
实验室合作，开发了基于耐热的二类内含子系统的嗜
热 微 生 物 定 向 改 造 技 术 Ｔｈｅｒｍｏｔａｒｇｅｔｒｏｎ［１１］。
Ｔｈｅｒｍｏｔａｒｇｅｔｒｏｎ 技 术 是 源 于 １ 株 嗜 热 蓝 细 菌
Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ 的二类内含子 （图 ８
（ａ））构建的高效、便捷的多基因靶向敲除系统。 该
耐热内含子在热纤梭菌基因组中具有较高的插入效
率（６７％ ～ １００％），这可能是由于高温条件促使了
ＤＮＡ的解链，使得内含子 ＲＮＡ 更易识别 ＤＮＡ 靶位
点，提高了靶向敲除的效率［１１］。 利用该技术，笔者成
功实现了 ｐｙｒＦ的 ｉｎｔｒｏｎ插入失活，从而构建了相应的
突变菌株（图 ８（ｂ））。 研究人员利用该技术进一步对
热纤梭菌纤维小体的重要脚架蛋白进行失活，共获得
了 ８个突变株，用于分析不同脚架及脚架上的模块在
纤维素降解过程中的作用。
图 ８ Ｔ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ中 Ｔｅｌ３ｃ二类内含子及反转录酶
Ｆｉｇ ８ Ｔ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＴｅＩ３ｃ ｇｒｏｕｐ ＩＩ ｉｎｔｒｏｎ ＲＮＡ ａｎｄ ＴｅＩ４ｃ ＲＴ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｔａｒｇｅｔｒｏｎ
０６ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
２ ２ 乙醇合成代谢工程改造
Ａｒｇｒｏｓ 等［３６］利用同源重组的方法将热纤梭菌
中的乳酸脱氢酶和磷酸乙酰转移酶进行敲除（图
５），获得了双突变株 ΔｌｄｈΔｐｔａ，并通过与非纤维素
降解菌的混养发酵得到 ３８ ｇ ／ Ｌ的乙醇产量，这是目
前利用热纤梭菌所能获得的最高乙醇产量。 笔者
所在实验室研究人员利用 Ｔｈｅｒｍｏｔａｒｇｅｔｒｏｎ 的方法，
也获得了 ２株单突变株（Δｌｄｈ，Δｐｔａ）和 １ 株双突变
株（ΔｌｄｈΔｐｔａ），并对其进行发酵分析，发现 Δｌｄｈ（乳
酸脱氢酶突变株），Δｐｔａ（磷酸乙酰转移酶突变株）
及双突变株 ΔｌｄｈΔｐｔａ（乳酸脱氢酶与磷酸乙酰转移
酶双突变株）的乙醇产量分别比野生型（ＷＴ）增加
了 ３７％、４２％和 ５６％［１１］。 此外，利用核磁共振的代
谢物组学分析方法发现 Δｐｔａ 与 ΔｌｄｈΔｐｔａ 菌株中丙
酮酸极其显著地积累，这一结果与文献中的报道一
致［３６］。 这一现象说明丙酮酸到乙醇的代谢是整个
乙醇生产的瓶颈。 因此，要进一步提高热纤梭菌的
乙醇产量，就需要对这一代谢途径进行进一步的改
造和强化。
３ 结 论
以解纤维梭菌和热纤梭菌为代表的中温或高
温产纤维小体微生物能够实现木质纤维素底物到
生物乙醇的直接转化，在木质纤维素 ＣＢＰ 应用中具
有巨大的潜力。 目前所开发的针对中温及高温梭
菌的遗传改造平台使得对这些候选菌株进行系统
的代谢工程改造成为可能，从而有望克服其现有的
抗逆性低、碳谱窄或乙醇产量低等缺陷，以适应工
业化生产的需要。 因此，开发可靠的遗传改造平台
具有广泛的应用价值，将有力地推动产纤维小体梭
菌在木质纤维素生物转化的工业生产中的应用。
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１６ 第 １期 刘亚君等：典型产纤维小体梭菌的遗传改造及其在纤维素乙醇中的应用研究进展
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（责任编辑 管珺）
２６ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷