全 文 :!11
"!
5
#
2013
$
9
%
&
(
)
*
+
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.11No.5
Sep.2013
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2013.05.004
!"#$
:2012-10-19
%&(
:
: ¢½à89
(K513201011);
: à&¾>fö<¡
(KY2013558B)
)*+,
:
¿?À
(1986—),
Á
,
>?ÂcA
,
°6BC&
,
BCDE
:
Ç&ÿ!
;
~Ãx
(
JKA
),
BCL
,Email:jwwang@
sudaeducn
ª«ÚÛÜÝ¢£Þ²ßàá
jkl
1,
mno
2,
pqr
3,
stu
1
(1.
]vB2 w23
,
]v
215123;2.
]vB2 xyz{|d}~23
,
]v
215123;
3.
V^X123
F89
,
650205)
=
>
:
\ÎÏ2·xÐÑÒ
,
XÓV
20mg/L6
Ô§ÕÖ
(6 BA)
®
01mg/L2,4
×ØÙ§
(2,4 D)
3
B5
¥¦§ÚÛÜÝÞßà
;
50g/L
3
¬WXÓV
10mg/L6 BA
®
005mg/L2,4 D
3
B5
v
Ò¥¦§Úáâã䥦Òå
。
X
25~27℃
Y
,
ÅÆæç襦
(120~130r/min)18d
é
,
êëìUW
®íîïªW]^G_`
(1617g/L、9569μg/gÉW)。X¥¦ð12ñN,ò¥¦§ÄÓV100μmol/Ló
ôpõö
(MeJA),
7
6d
()
,
êëÄíîïªW]
23573μg/gÉW。
?@A
:
;
ãäêë
;
íîï
;
óôpõö
BCDEF
:Q8131
GHIJK
:A
GLMF
:1672-3678(2013)05-0016-05
ResveratrolproductioninsuspensioncelculturesofVitisvinifera
LONGXiaofeng1,ZHENGLiping2,ZHAOPeifei3,WANGJianwen1
(1.ColegeofPharmaceuticalSciences,SoochowUniversity,Suzhou215123,China;
2.JintanglangSchoolofArchitectureandUrbanEnvironment,SoochowUniversity,Suzhou215123,China;
3.InstituteofHorticulturalCrops,YunnanAcademyofAgriculturalSciences,Kunming650205,China)
Abstract:ThecaliwereinducedfrompeelofVitisviniferacv.KyohoonB5mediumsupplementedwith
20mg/L6BAand01mg/L2,4D.Thesuspensionculturesystemwasthenestablishedwithinitial
calusinoculationof50g/LinliquidB5mediumwith10mg/L6BAand005mg/L2,4Dfor
resveratrolproduction.After18dshakercultivation(120130r/min)at2527℃ underdarkness,the
biomassandresveratrolproductionintheculturereachedpeaklevelsof1617g/Land9569μg/gDW.
Theresveratrolproductioninthecelsreached23573μg/gDW after6dtreatmentwithmethyl
jasmonateat100μmol/Ltothe12dsuspensioncultures.
Keywords:Vitisvinifera;suspensioncels;resveratrol;methyljasmonate
ØÄŪ
(resveratrol,
]s
Res),
OPQ1XÆ
²ÈÉTqÇȲèFÓ
,
¡5jÂ
、
ÉÊ
、
ÄÅq*¼
[1],
WXß,TËÌÛ
[2]、
Ë
Í
[3]、
ˤF
[4]
[ÎÏÐÑ
[5]
q&¹Jf
。
OÖtØÄŪT ¡*F;
[6],
ó¾ï&
iT1ú£ÑÒÓ
、
&áh±TQ$
,
Æ
ÁÛẼXØ¢T1ÛýK
。
Ô5I
q
[7]
BC¾÷
:
ÕÖø×¼ØÄŪT1Ûz
׺´çÇ*¼T1Û
,
ÜOÏ*èæ&i
y,á}&Cúß)
,
ÆÁèæÕÖØýõç
ÂÙ«&
。
2
,
j*ÕÖK¼Ú(Ç;¥Ä?OÖ
×*øÕ¼}&Cú1ÛTXØDÕH
P
。
#*jèæK¼Ú(¥Ä~XØ
ùµØÄŪTñ_
,
»°Ûæ
[8]、
ÜÝèÀ
[9]、
Þ
xß
[10]
q
。
àáxþâ
(methyljasmonate,MeJA)
OߣXØT&¥Ä?
,
õãùµ*è浶
[äçå=çá}&CúÓ¢
,
7ËèQ&
Ó¢34¥ÄèQ}&CúTÓ¢
[11-12]。
÷XBC¶¦ö
MeJA
~,³èæ¼ÑuÝ
\×ØTµY
,
ùµÆ²áæn¦T&Ó¢
[13],
ÜOj ¡èæK¼
,
X\
MeJA
¨£
¥ÄçèØÄŪ&TuUßS
,
eoO
`é´
MeJA
¥Ä
¸¹pïTê
,
ó¥Ä
á¨pï´Â}&CúT&WXV
¡TQ$
。
ýþÒôµ¶ÕÖø×T¥Ä
,
#*
Þßâ8(´ÕÖø×¥ÄTQ$
,
êýê
QÛ
,
~#56KTèæ ¡ÕÖK
。
p#*mn ¡èæý&ip#
、
Ú(ý
MeJA
´èæ&iáØÄŪñ_ÛTQ$
,
êùµèæ¼ØÄŪñ_T®Ô
MeJA
á
¸¹pï
,
~#£èæÕÖ&ØÄŪÖ+
ÿ!á¹é7m
。
1
N6OPQ
11
N6
111
Ò¨©ª©.¾ï&iëìTíJ
«Q£+
。
112
¡4?
ØÄŪ;q«
、
àáxþâ
(MeJA)
î
sigma
HI
。6
ï8ðñ
(6 BA)、2,4
7ò¤
8
(2,4 D)、
7þ8¿ó
(DMSO)、
þª
、
©ôqz
£µõé:3}
。
113
¡aË]^
SW CJ 1FD
¬ö)¨O
(
©öF]^X
GHI
)、MLS 3780
×ëâãÛ÷
(
d*BøH
I
)、HZQ X100
¬®ùúÕÖû
(
,-üµýþ
aÝÿ
)、Agilent
{ÝKg
(
9:
Agilent
HI
)
q
。
12
RSPQ
121
ÕÖø×TÕ¥ÄËÕÖ
t»ÑÓTíJT¢!ôö£Ç*
,
`z"
30min,
75%
TÊæçg
45s,
»Û`
#"
3
}
,
®|
01% HgCl2{¼çg12min,»
Û`z"
5
}
,
®7$ô%
,
»ôÛ¢
05cm ×
05cm
T?
。
"»»ÛTíJôÇ*
®&ò1X
B5、20mg/L6 BA、01mg/L2,4
D、30g/L
ÂÀ
、7g/L
(pH57)
TÕÖ8¼µ
¶ªCÕÖ
,
(ÕÖø×T¥ÄÙ
、
&iíN
。
ÕÖ(Òâ8á})ÕÖ
2
QD
,
â8ÕÖ
(£
16h/d,
â8
2000lx
*+
,
ÕÖ
£
25~27℃。
ȻCͅ
30d
TÕÖø×Cj>
,TCÕÖ8
(
1
B5、10mg/L6 BA
á
005
mg/L2,4 D)
,
,
-C
5
}
。
ot
15、25
á
4g
ÈÉ.Â
、
fízPá&i^TÕÖø×ñ
|[X
50mL
{ÕÖ8
(
1
B5、10mg/L6 BA
á
005mg/L2,4 D)
T
150mL
B}¼
120~
130r/min
~ùú)ÕÖ
。
122
¡èæ&i%JT
ÕÖø×êQÂ{ÕÖ87{
3d
cR
3
èæ
。
~àèæ ¡ÕÖ{
,
à/|Ý{01
,
2Ì23K4$ÕÖ8
,
$ù`5"èæ
3
}
,
_
3Kò»K{
,
7\Â
50℃
6uò®§Û
,
s
u§Û
。
123
àáxþâT¥Ä¸¹
MeJA
DMSO
½
,
7>¢
100μmol/mLË
{
,
~
022μmTKñ*K4Û。o»Ë{Âè
æÕÖTýpïÚ(£ÕÖ{¼
,
7>£
50、100
á
200μmol/LTÕÖ{,´ 8ø(|qñT
DMSO。
124
ØÄŪTÖtË
»6uTèæB¢èk
,
st
01g,
(þª
10
mL,
8Öt
1h,
8
2
}
,
y15min,
t,{
2*
045μmXWKKñ*K7µ¶×Ø{Ý
(HPLC)
。
´¯*+9Ûjòâá)µ
¶
,
~òóÖtTâá`½
。
ØÄŪD
Õ78x:
[14]。
{Ý(
:
Agilent
HC C18,
Ý©ô `§
";
,
µ5Û
20μL,
10mL/min;
Úi
307nm。
2
efOgh
21
âãtälåæ
~>,TíJô£Ç*oj})
áâ8(¥ÄÀÕÖø×
,
7µ¶ªC
、
C ¡ÕÖ
,
Èô»µ
1
á¼
1
½¾
。
Áµ
1
71
!
5
# ¿?Àq
:
èæ ¡ÕÖ&ØÄŪ
~¿À
:
â8(TÀÕpïß_
,
ÄÀÕÙß
×
,
o£
18d、94%
*+
。
ój})(¥Ä
ÀTÕÖø×É<Ç
,
§r·
、
&i
^
,
½
56T ¡èæK£ÇØ
,
zP
、
K
、
=>
,
è
æ ¡~L¯èæá?èæYTº5j
,
qRÔ
Ó ¡ÕÖ
(
¼
1(a)~1(c))。
â8(¥ÄÀ
TÕÖøףǶ
,
2*è}CÕÖ®£ÇØ
、
.Â
、
¾u
,
kXß?TÊFø×Y
,
2*
¡ÕÖ7èæÉÇÊ
,
ý156 ¡èæK
(
¼
1(d)~1(f))。
Á~,Èôþ
:
â8(
ÕÖXÂÕÖø×T¥Ä
,
ó)ÕÖ(TÕ
Öø×ÎX ¡èæKT56
。
_
1
ç袣rª«fÉâãtäåælsY
Table1 Efectsofcultureunderlightordarkness
inthecalusinduction
â8
(
ÀÕpï
/
d
ÀÕÙ
/
% ÕÖø׺d
¡è
æºd
})
23 878
<Ç
、
ÂÃ
、
· ÇØ
â8
18 940
ÇØ
、
.Â
、
u ÇÊ
})¥Ä
28d
TÕÖø×
(a)、
CÕÖ
15d
TÕÖø×
(b)
á ¡ÕÖ
10d
Tèæ
(c);
â8¥Ä
28d
TÕÖø×
(d)、
CÕÖ
15d
TÕÖø×
(e)
á ¡ÕÖ
10d
Tèæ
(f)
C
1
ª«fÉâãtälåæ
、
éꢣbÜÝ¢£
Fig.1 CalusinductionfrompeelofVitisvinifera,subcultureandsuspensionculture
22
ÜÝÚÛ¢£Ð¡vlëì
jµ¶èæT ¡ÕÖ*+¼
,
ÁÂèæWX
?Øç
,
ÏÐêQÛTf>Oèæõ^ ¡
ÕÖTP¯\óϦ
。
ýþýªäêQÛ»
ÕÖø×êQÂ{ÕÖ8¼
,
¡èæT&
i%J
,
Èô»¼
2
½¾
。
Á¼
2
þ
:
èæêQÛ
*)
,
@~AÕÖø×T ¡ÕÖ
,
èæ&iy
,
,
1ÊF
;
êQÛ*×
,
èæ´ÕÖ8¼ÖTB
CV
,
èæ&iö#_
,
1D
。
ÏÐ
,
®ÔêQ
Û£
50g/L。
23
ª«ÚÛlÞÙ¹ßàá±Ç
¼
3
¾èæj{ÕÖ¼&iáØÄÅ
ªÓ¢d%J
,
EÓ
“
,^,
”
T
S
º&iö#
。
Á¼
3
þ
:
ÕÖT
6d,
èæ&iy,
,
XT
C
2
íîСvrª«ÜÝÚÛÞÙlsY
Fig.2 ProliferationofVitisviniferacelsin
diferentoriginalinoculationsizes
%#
,6d
H7
,
&Ûà;i
,
°£´6&i
#
,
j!
18
Çèæ&ÛY£®
,
Y
1617g/L;
81
&
(
)
*
+
!
11
"
H7èæµ|K#
,
#$ÕÖ8¼À²áPFG
Ö¢Tçè
,
èæß&iü,
,
&Û8*^
_K
;
7#èæÀ÷HD÷
,
"(,ÕÖ{#
~Tù
,
èæß½;(
,
&ÛIXÅ
。
èæ&iTö#£
21d,
j´¯ÕÖö#¼
,
ØÄ
Ū1ÛÉ÷P¯dTúF*+
。
#$ÕÖp
ïT;(
,
èæ&Û;(ú,
,
ØÄŪT1Û
±ä;(
。
èæ&i£!
18
ÇpTØÄŪ1Û
Y£®
,9569μg/gu§Û,Û£155mg/L。
j#7TÕÖ*+¼
,
ØÄŪT1ÛÅ
。
C
3
ª«ÚÛÞÙ¹ßàáïðlÕÖñn[ò
Fig.3 Timecoursesforgrowthandresveratrol
accumulationincelculturesofVitisvinifera
24 MeJA
rª«ÚÛlÞÙ¹ßàá²vlsY
241 MeJA
´èæ&iØÄŪñ_
TQ$
ý
T
MeJA
jèæÕÖ!
12
Ç(|Õ
Ö8¼
,
ÕÖ7
18d
cRèæ
,
Èô»¼
4
½¾
。
Á¼
4
þ
:
ß)
MeJA
´ ¡èæ&
ÛTQ$ý"
,
#$
TV×
,
èæT&Û
X½Å
,
U
MeJA
£
200μmol/Lp,èæ&
ÛO´8T
80%。
ý
MeJA
eõùµèæ
kØÄŪTñ_
,
£
100
á
200μmol/LT
MeJA
"ùµØÄŪTñ_
,
þT1Û
,
23573μg/gu§Û。ÏÐ,MeJAT®¯¥Ä
£
100μmol/L。~,Èô&,MeJATÚ(´
èæ¼ØÄŪT1ÛWXùµ¨
,
ó´èæ
&iWXa>¨
,
ÑQa>¨ËÚ(T
É
TÝ。
242 MeJA
Ú(pï´èæ&iáØÄŪ
ñ_TQ$
£Íb®¯T
MeJA
Ú(pï
,
ýþÂèæÕ
Ö!
0、3、6、9、12
á
15
Ç7(|
£
100μmol/L
MeJA,
!
18
ÇpcRèæ
,
Èô»¼
5
½¾
。
Á¼
5
C
4 MeJA
®rª«ÚÛÞÙb
ßàáïðlsY
Fig.4 EfectsofdiferentconcentrationsofMeJAon
growthandresveratrolaccumulationincel
culturesofVitisvinifera
þ
:
ÕÖ!
0、3
Çp(|
100μmol/LMeJA,èæ
ÊF÷ V
,
èæ&Ûa>
,
o£
167
á
657g/L,
ØÄŪ_ñÛøß)
。
j
!
12
á
15
Ç(|
MeJA
´èæT&iTQ$ß
?
,
ój!
12
ÇÚ(
MeJA
ß+
rÖ×ØÄ
Ūñ_
,
èæ¼ØÄŪ1Û£
23573μg/gu
§Û
,
¡ÕÖØÄŪÛ×Y
338mg/L。
ÏÐ
,MeJA
T®¯Ú(pï£!
12
Ç
。
C
5 MeJA
óôÕÖrª«ÚÛÞÙ
¹ßàáïðlsY
Fig.5 EfectsoftheadditiontimeofMeJAoncel
biomassandresveratrolaccumulation
3
e
h
~íJô£Ç*
,
#*´Þ})Ëâ8
(T¥ÄÕÖ
,
82*è}êËCÕÖ
,
Á
£Í&iJ
、
ØÄŪ1Û×TYÕÖø×
,
¾
÷)ÕÖTÕÖø×ÎÔÓ ¡ÕÖ
,
ÈÓªäê
QÛTê®+56KT ¡ÕÖK
。
ý
T
MeJA
´ ¡èæT&iXPTa>¨
,
j!
12
Ç(|
MeJA
pèæ&ia>ß?
,
èæ
91
!
5
# ¿?Àq
:
èæ ¡ÕÖ&ØÄŪ
¼ØÄŪ1ÛY£®×
23573μg/gu§Û;ÕÖ
K¼ØÄŪÛY£
338mg/L。
ýþ»µP
üÅKØÄŪT&Ó¢34á¥Äÿ!
,
Ü
&àÿ!´Ó¢34¼T\óÎqµ¶µYL
M
,
#*&=ça&ÿ!TÅK
,
£ØÄŪ&
ÿ!&Ö+8dá7m
。
GH
:
[1] KodanA,KumdaH,SakaiF.Simultaneousexpressionofstilbene
synthasegenesinJapaneseredpine(Pinusdensiflora)seedlings
[J].JWoodSci,2001,47(1):5862.
[2] PezetR,GindroK,ViretO,etal.Efectsofresveratrol,viniferins
andpterostilbeneonPlasmoparaviticolazoosporemobilityand
diseasedevelopment[J].Vitis,2004,43(2):145148.
[3] AggarwalB B,BhardwajA,AggarwalR S,etal.Roleof
resveratrolinpreventionandtherapyofcancer:preclinicaland
clinicalstudies[J].AnticancerRes,2004,24(5A):27832840.
[4] FrankelEN,WaterhouseAL.InhibitionofhumanLDLoxidation
byresveratrol[J].Lancet,1993,341:11031104.
[5] BradamanteS,BarenghiL,VilaA.Cardiovascularprotective
efectsofresveratrol[J].CardiovasculDrugRev,2004,22(3):
169188.
[6]
¼
~R
.
ËʼØÄŪTBCµj
[J].
t
*àu
,1999,19(5):144148.
[7]
Ô5I
,
Nj
,
:O
.
èæÕÖ&ØÄŪTBC
[J].
PQQlààu
:
/à¶
,2009,35(3):274277.
[8] BruR,SelésS,CasadoVelaJ,etal.Modifiedcyclodextrinsare
chemicalydefinedglucaninducersofdefenseresponsesin
grapevinecelcultures[J].JAgriculFoodChem,2006,54(1):
6571.
[9] AzizA,PoinssotB,DaieX,etal.Laminarinelicitsdefense
responsesingrapevineandinducesprotectionagainstBotrytis
cinereaandPlasmoparaviticola[J].MolPlantMicrobeInteract,
2003,16(12):11181128.
[10] TassoniA,FornaleS,FranceschetiM,etal.JasmonatesandNa
orthovanadatepromoteresveratrolproductioninVitisviniferacv.
Barberacelcultures[J].NewPhytol,2005,166(3):895905.
[11] WangBJ,ZhangX Q,SunLW,etal.Efectofmethyl
jasmonateonsuspensioncelsgrowthandhyperforinproductionof
Hypericum perforatum L.[J].PlantPhysiol,2008,44(4):
669672.
[12]
~àz
,
Râ
,
ÇST
,
q
.
àáxþâ´U7Ví©¼U
7Ȳ¢ñ_áðñTQ$
[J].
¼:¼ÆY
,2007,32
(4):300302.
[13] BelhadJA,TelefN,SaigneC,etal.Efectofmethyljasmonatein
combinationwith carbohydrateson geneexpression ofPR
proteins,stilbeneandanthocyaninaccumulationingrapevinecel
cultures[J].PlantPhysiolBiochem,2008,46(4):493499.
[14] JeandetP,BreuilA C,AdrianM,etal.HPLCanalysisof
grapevinephytoalexinscouplingphotodiodearaydetectionand
fluorometry[J].AnalChem,1997,69(24):51725177.
02
&
(
)
*
+
!
11
"