全 文 ：!"海因酶与 #"海因酶的序列及结构比较研究
许 伟$，%，严 明$，许 琳$!
（$ &南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 %$’’’( ；% &盐城工学院 化学工程系，盐城 %%)’’*）
摘 要：运用生物信息学的研究方法，从序列及结构上对 !型及 #型海因酶进行了初步的比较。研究了两种类型
的海因酶在序列、骨架结构及活性中心的区别，并探讨了产生这些差异的理论基础，为海因酶进一步的理论及应用
研究提供一定的指导。
关键词：!"海因酶；#"海因酶；序列；结构
中图分类号：+,$) 文献标识码：- 文章编号：$./% 0 *./,（%’’)）’) 0 ’’$/ 0 ’1
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LB:L F=>5 6: K=G5 BKN5ALK KQAE BK NEBFGBA5QL6AB>，?==C 6:CQKLFHU P: LE6K NBN5F V6=6:?=FGBL6AK G5LE=CK W5F5 QK5C
L= KLQCH LE5 C6??5F5:A5K =? K5XQ5:A5K B:C KLFQALQF5K V5LW55: !"EHCB:L=6:BK5 B:C #"EHCB:L=6:BK5U ME5 C6??5F"
5:A5K V5LW55: LW= LHN5K =? EHCB:L=6:BK5 W5F5 A=:A>QC5C LEF=Q;E A=GNBF6K=: =? LE56F K5XQ5:A5K，KLFQALQF5K B:C
BAL6J5 K6L5KU ME6K NBN5F W6>> NF=J6C5 LE5=FH VBK6K ?=F ?QFLE5F F5K5BFAE =: LE5 EHCB:L=6:BK5KU
9*. :"&-+：!"EHCB:L=6:BK5；#"EHCB:L=6:BK5；K5XQ5:A5；KLFQALQF5
海因酶能够水解海因、1’"取代海因及海因衍生
物的内酰胺键，生成光学活性的氨基甲酰氨基酸，后
者在 8"氨甲酰水解酶的作用下，可以生成光学纯的
氨基酸。根据海因酶的底物特异性或产物光学活性
的不同，可以将其分为 !型和 #型海因酶。作为生
产 !型和 #型氨基酸的关键酶，其在工业上具有广
泛而重要的应用价值。海因酶法制备光学纯氨基酸
的反应过程如图 $所示。
国内对海因酶的研究多集中于产酶菌的筛选及
氨基酸生产工艺的优化。但近年来，也逐渐开始关
注其酶学性质、基因表达及蛋白结构等基础性研究。
黄红辉［$］等纯化了 !"#$%&’&()" *$+,%) 中的海因酶，
并对酶学性质进行研究。袁静明［%］等测定了海因酶
的基因序列。李志强［*］等利用从 !"#$%&’&()" *$+,%)
中得到的海因酶基因所构建成的工程菌比野生菌的
酶活力提高了 , 倍。许桢［)］等通过 @=QLE5F: 杂交，
部分文库构建和筛选，对 -$./0&1%#.,) 海因酶的基因
进行了克隆测序和表达。%’’%年末，中科院上海生
命科学研究院与美国 YQL;5FK 3:6J5FK6LH联合测定了
-$./0&1%#.,) *,2/#++,, 中海因酶的晶体结构［1］，是国内
! 收稿日期：%’’)"’("*’
基金项目：国家 (/*项目（项目编号 %’’*作者简介：许伟（$(/."），女，博士研究生，主要研究方向为酶工程。
联系人：严明，’%1 0 ,*1,/.(1
第 %卷第 )期
%’’)年 $$月
生 物 加 工 过 程
=? Z6=NF=A5KK O:;6:55F6:;
8=J& %’’)
·$/·
万方数据
海因酶研究的重大进展。国外，以海因酶结构和功
能的相关研究最为活跃，并已经成为海因酶的研究
热点和发展方向。本文充分利用生物数据库中的大
量资源，运用生物信息学的研究手段和方法，对不同
菌种来源的 !型及 "型海因酶从序列、结构及活性
中心 #个方面进行了比较研究，来探讨具有不同立
体选择性的两类海因酶的序列及结构特点，讨论其
序列和结构的保守性与其功能的关系，为今后海因
酶的理论及应用研究提供参考。
图 $ 海因法生产光学纯氨基酸
%&’($ )*+,-./&+0 +1 +2/&.34 35&0+ 3.&,6 78 98,30/+&036: 5:/9+,
! 材料与方法
本文中所讨论的海因酶序列及晶体结构数据分
别取自 ;<&66=)*+/ > ?*@AB! 和 )"B 数据库。序列比
对利用 C4-6/34D$(E# 软件（":6 F&’’&06，@-*+2:30
A+4:.-43* B&+4+’8 !37+*3/+*8，F:&,:47:*’，G:*5308）。
蛋白质结构分析采用 H36A+4 IJ(K，它是目前应用最
广泛的观看分子三维立体结构的免费软件，作者为
G43L+MN:44.+5:公司（世界第一大制药公司）研发中
心的科学家 H+’:* ;384:。非特别说明，参数选用软
件默认值。
" 结果与讨论
J($ 海因酶的多序列比对
在 ;<&66=)*+/ > ?*@AB!数据库中，对 !=海因酶及
"=海因酶的序列进行搜索。得到 J条 !=海因酶的序
列及 $O 条 "=海因酶的序列。用 C4-6/34D$(E# 软件
对这些来自土壤杆菌、节杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、
布鲁氏菌、皮氏伯克霍尔德氏菌、恶臭假单胞菌，
链霉菌等多种微生物中的 !型和 "型海因酶进行
多序列比对。序列比对结果如图 J所示，图 #给出
了海因酶序列两两比对的同一性分值。多序列比对
表明，不同菌种来源的海因酶序列同一性 P #JQ。
同一菌属的海因酶相似性较高，如 R与 B，S与 T，U
与 V之间的同一性分值都大于 WX。通过 ;<&66=)*+/ >
?*@AB!数据库搜索，还可以发现 "=海因酶来源于
多种微生物，而 !=海因酶却只存在于节杆菌属。值
得一提的是，来自节杆菌属 C、@ 的 !=海因酶序列同
一性分值为 EY，而二者与同属节杆菌属的 "=海因酶
（"）之间的分值却只有 #Y，两种酶功能上的差异在
其氨基酸序列上得到了充分体现。虽然皮氏伯克霍
尔德氏菌（Z）属于假单胞菌的一种，但其与恶臭假
单胞菌（U，V）的同源性较低，分值仅为 OX 左右，而
与土壤杆菌的同源性很高，分值高于 WX，这也是值
得注意的现象。
·$E· 生物加工过程 第 J卷第 O期
万方数据
!：!"#$%&’()#*+, -. "；#：!"#$%&’()#*+, (+,)/&’*)0-；$：!#(1#$%&’()# &+#)-’)0-；%：!#(1#$%&’()# ’#2-(&33$.$*)()-；&：!#(1#$%&’()# -. "；’：4&’*33+-
-()&#$(1)#,$.1*3+-；(：4#&52#1*6$%*+, 7&.$0*’+,；)：4#&52#1*6$%*+, 7&.$0*’+,；*：4#+’)33& ,)3*()0-*-；+：4#+’)33& -+*-；,：4+#81$35)#*& .*’8)((*9
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图 2 不同微生物来源海因酶的序列比对（其中来自 $、&的为 -3海因酶，其它全部为 %3海因酶）
’45"2 .678497: ;:<6:=>: ?745=@:=8 AB CDE?=8A4=?;:; BFA@ E4BB:F:=8 @4>FAAF5?=4;@;（;:<6:=>:; BFA@ $ ?=E & ?F: -3CDE?=8A4=?;:，A8C:F; ?F: %3
CDE?=8A4=?;:）
2"2 结构分析
迄今为止，已经测定了来自热链芽孢杆菌
（ >1)#,+- -. "）［G］、嗜热脂肪芽孢杆菌（ 4&’*33+-
-()&#$(1)#,$.1*3+-）［H］、皮 氏 伯 克 霍 而 德 氏 菌
（4+#81$35)#*& .*’8)((**）［I］和节杆菌（ !#(1#$%&’()# &+9
#)-’)0-）［J］中的海因酶的晶体结构。通过对海因酶的
三维结构进行分析可以得出，海因酶一般为二聚体
或四聚体，并且都是金属依赖酶，亚基中都结合了两
个 K=2 L。海因酶单亚基由两个结构域构成，一个是
!结构域，它是由 /3端 IM N GM个残基以及 $3端 GM N
JM个残基组成的折叠桶（9;:6EAO?FF:7）；另一个是由
PMM多个残基构成的"Q!筒状结构域—海因酶的催
化区域。
2MMR年 SS月 许 伟等：-3海因酶与 %3海因酶的序列及结构比较研究 ·ST·
万方数据
图 ! 海因酶序列比对的同一性"
#$%&! ’()*+$+, -. /,(0*+-$*01)
2&2&3 两种类型海因酶单亚基的结构骨架比较
运用结构分析软件对 45海因酶及 65海因酶的
骨架结构进行叠合，发现两种类型的海因酶在整体
结构上很相似。在两种类型的海因酶中二级结构的
保守性很强。只是在某些二级结构的连接处存在较
大偏移，图 7中以 45海因酶（389:）为基准，将 65海
因酶（3;#8）结构中相对变动较大的 <处 =-->（?：残
基 <@5!275!!!、F：残基 3G353GE、#：残基 A25AA）用深灰色标
出。结构分析表明，这六处 =-->主要位于海因酶的
催化区域附近。有可能这些结构上细微的差别与海
因酶的底物特异性有着密切的关系。当底物进入酶
的活性中心时，这些 =-->的变动可以增加海因酶结
构的柔性，致使活性中心能够结合不同手性的底物
分子。
2&2&2 两种类型海因酶活性中心结构的比较
海因酶的活性中心有一个特殊的氨基酸———羧
基化的赖氨酸，其羧基上的两个氧原子分别与两个
H*2 I配位。这在已知结构的海因酶中完全保守。因
此，我们运用结构分析软件，分别将 389:及 3;#8
活性中心的两个 H*2 I、9JK以及 LFM3残基上的 C!
进行手动叠合，以此为基础来考察两类酶活性中心
图 7 45海因酶（N6B ’6：389:，黑色）与 65海因酶（N6B ’6：
3;#8，浅灰色）结构骨架比较，深灰色标出了 3;#8相
对于 389:变动较大的几处 =-->（?，B，C，6，F，#）
#$%&7 C-O>0P$1-* -. 1+PQJ+QP) R0JSR-*) .P-O =5/,(0*+-$*01)（N6B
’6：389:，R=0JS）0*( (5/,(0*+-$*01)（N6B ’6：3;#8，=$%/+5
%P),）0*( +/) (0PS5%P), =-->1（?，B，C，6，F，#）$*($J0+) +/)
O0T-P ($..)P)*J) -* 3;#8 J-O>0P)( U$+/ 389:
的结构差别。以 H*3为中心，选择半径为 @ V E *O的
空间范围，两类海因酶的活性中心如图 7所示。其
中 65海因酶（N6B ’6：3;#8）用黑色表示，而 45海因
酶（N6B ’6：389:）用灰色表示。由图中可以看出，
海因酶的活性中心结构具有较高的保守性，围绕在
两个 H*2 I周围的保守残基主要有 7个 W$1，3个 ?1>，
·2@· 生物加工过程 第 2卷第 7期
万方数据
!个 "#$（%末端羧基化的赖氨酸）和 !个 &’(。这种
情况与多序列比对的结果一致。因此，可以推测这
些残基可能直接或间接地参与底物在活性中心的结
合或催化反应。在 )*+ , 外围，有部分残基区别较
大，其中在 -.海因酶中的 /01!23、456!27、406+89、
&’(+79 等残基，在 :.海因酶中相应的位置由
;1、?16!27、@(’+82、:1A+78B等残基所占据。这些
残基可能对海因酶不同的立体选择性做出了贡献。
图 2 -.海因酶（/-C D-：!%EF，黑色）与 :.海因酶（/-C D-：
!F"G，灰色）活性中心结构比较
EHIJ2 KLMN’6HOL* LB ’#!%EF，R(’#S）’*Q :.05Q’*! 结论与展望
光学纯氨基酸在医药、食品等领域扮演着越来
越重要的角色。海因酶作为其生产过程中的一个关
键酶，也逐渐成为国内外科研工作者关注的对象。
利用生物信息学技术来研究酶的基础理论，探究其
序列、结构、功能之间的关系，也成为了非常重要的
研究手段。本文运用多序列比对及结构分析软件，
比较分析了 :.海因酶与 -.海因酶在序列、骨架结构
及活性中心的异同点。并进一步探讨了两类海因酶
具有不同的立体选择性的理论基础，为其理论及应
用研究提供参考。本实验室对海因酶进行了长期较
系统的研究，目前正在开展一系列关于海因酶的基
础研究工作。随着海因酶基础理论研究的不断深
入，势必有力推动其工业化的进程。
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+33=年 !!月 许 伟等：:.海因酶与 -.海因酶的序列及结构比较研究 ·+!·
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