全 文 ：! 第 " 卷第 # 期
#$$% 年 % 月
生 物 加 工 过 程
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809 #$$%
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聚苯乙烯树脂固定化 <=海因酶的初步研究
贾红华;，倪! 芳;，万永敏;，#，韦! 萍;!
（;>南京工业大学! 制药与生命科学学院，南京 #;$$$?；#>南京工业大学! 材料科学与工程学院，南京 #;$$$?）
摘! 要：<=海因酶广泛用于 <=氨基酸的制备研究和生产中，目前已有许多固定化 <=海因酶及含 <=海因酶细胞的研
究报道。尝试了不同功能基团的聚苯乙烯树脂进行 <=海因酶的固定化，结果表明功能基为伯氨基和仲氨基效果较
好，并选取聚苯乙烯树脂 度 @ A7 B AC、温度 #% D、固化时间 ;# ’。所得固定化酶的最适作用温度 :% D，最适作用 4E为 FG %，且作用温度及
适宜 4E较广，!A为游离酶的 ;G F 倍，且储存稳定性、操作稳定性较好。:% D下半衰期为 ;; H。
关键词：聚苯乙烯树脂；固定化；<=海因酶
中图分类号：IF;:> #! ! ! ! 文献标识码：J! ! ! ! 文章编号：;@K# L "@KF（#$$%）$# L $$:; L $:
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80) 9$5(&：4-19+W9/*)* /*+()；(AA-Z(1([0W(-)；<=’9H0)W-()0+*
! ! <=海因酶是一类催化水解 %=取代海因及其海
因衍生物的内酰胺键的酶，广泛用于 <=氨基酸的制
备研究和生产中［;="］。目前已有许多不溶性或可溶
性聚苯乙烯树脂广泛用于 <=海因酶及含 <=海因酶
细胞的固定化的报道［:=F］。R-Y*11 CP［?］等以 <.-1(W*
J%@F 固定化 <=海因酶催化反应制备 N=氨甲酰=<=
苯甘氨酸产率可达 ?K]，固定化酶重复使用 %$ 次
产率仍可达 ?%]。J/5./( 83 等［;$］报道由 "#$%&
&%$’(&)#*中提纯的粗酶液以戊二醛为交联剂共价结
合于多孔玻璃氨基硅烷衍生物上，该法制备的固定
! 收稿日期：#$$%=$%=;$
基金项目：国家 ?K" 项目（#$$"&3K;@$$$:）和国家自然科学重点基金项目（#$""@$;$）资助
作者简介：贾红华（;?K?=），男，博士生，研究方向：酶工程。
联系人：倪! 芳，X*1：$#%=F"%FK""$万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $ 卷第 # 期
化酶活力收率为 %&’，批次反应连续进行 ( 次，酶
活保持稳定。
离子交换树脂是一类不溶也不熔且具有三维空
间网状骨架结构亲水性的功能高分子。连接在树脂
骨架上的功能基，可通过吸附、共价键、离子键、配位
键、交联、微胶囊等形式以及其他手段将酶固定在树
脂上，构成固定化酶。酶与树脂结合后活性较稳定，
各种树脂经过功能基改性都可以更好地与酶结合，
如：胺改为螯合基团；重氮化；或将二乙基胺基（)*+
,*）引入各种树脂后，可以提高树脂固定化酶的效
率，该法常用的树脂有：)-./012,"、,3、,4、5+$&、5+
$4；,6728/012 9:+%、;2<=01 >?+3#、3"、3( 等；通过碳
化二亚胺把酶连接到带氨基或羧基的树脂上；戊二
醛等双功能基化合物可以以交联的形式将酶固定在
树脂上。本文利用不同功能基团的树脂来进行 )+
海因酶的固定化研究，考察固定化酶的固定化条件
及其酶学性质。
!" 材料与方法
@A @! 实验材料
@A @A @! 药! 品
苄基海因和 B+氨甲酰+)，;+苯丙氨酸标准品自
制，其他试剂均为分析纯。
@A @A #! 菌! 种
洋葱伯克霍尔德氏菌 C5+&#（!"#$%&’()#*+ ,)-),*+
C5+&#），由南京工业大学制药与生命科学学院微生
物筛选中心提供。
@A @A $! 培养基
葡萄糖 #’，蛋白胨 &A %’，玉米浆，#A %’，B=D/
&A $’，EF# ?G" &A #’，>H5G" &A &#%’，D.D/#
&A &&%’，诱导剂 &A @%’，IF 4A %。
@A #! 实验方法
@A #A @! 菌种发酵产酶方法
配置发酵培养基 $ ;，装入一容积为 % ; 的机械
搅拌罐中，@#@ J、&A @ >?=下灭菌 #& 60K。待冷却后
接入种子，然后在 $#A % J、%%& 8 L 60K 通风培养。待
发酵完成后，培养基离心，获得菌泥，保存于冰箱中。
@A #A #! 酶液提取
将离心收集到的菌体用 %& 66./ L ; M80N+FD/、
IF (A & 缓冲液洗涤 # 次，加入菌体湿重 $ O " 倍体
积的上述缓冲液悬浮菌体，于冰浴中用超声波细胞
破碎仪间歇处理 P 60K（"&& Q），@" &&& 8 L 60K离心
$& 60K，取上清得粗酶液。然后采用 "&’ O4&’饱
和度的硫酸铵分级沉淀，在细胞破碎上清液中边搅
拌边加入固体（BF"）# 5G"粉末至 "%’饱和度，室温
放置 # R，@& &&& 8 L 60K离心 #& 60K，弃沉淀，上清液
中继续加入固体（BF"）#5G"至 4&’饱和度，搅拌 $&
60K后，于 " J放置数小时或过夜，@& &&& 8 L 60K 离
心 #& 60K，收集沉淀。大约有 %&’的活力得到回
收，酶被提纯了约 4 倍。最后将硫酸铵沉淀用 #&
66./ L ; 180N+FD/ IF (A & 的缓冲液悬浮，利用&
EM,M>2SI/.828 @&&（,628NR=6 ?R=86=T0=）将酶液进
行疏水柱（F0?82IM> @3 L @&，,628NR=6 ?R=86=T0=）层
析，收集合适洗脱峰的洗脱液。
@A #A #! 海因酶的固定化方法
在固定化操作之前，先将聚苯乙烯阴离子树脂
采用标准方法处理［@@］，然后称取一定量树脂，加入
一定浓度的戊二醛溶液，活化一定时间后，洗去戊二
醛，再加入一定量的海因酶酶溶液，反应一定时间。
用蒸馏水洗去未固定的酶，即制得固定化酶。
@A $! 分析方法
@A $A @! 游离酶活力的测定方法
酶活测定采用毛细管电泳法（? L ,T2 % &&&，U2TV+
6=K）［@#］。在试管中加入 @ 6;的酶作用液（含 # H L ;
苄基海因的氨水+氯化铵 IF (A % 缓冲液）和 # 6; 酶
液，总体积为 $ 6;，$( J反应 @& 60K，然后加入 &A #%
6; @&’三氯乙酸终止反应，用毛细管电泳测定产物
的变化。酶活力定义为在上述条件下，@ 60K 内生成
@ 66./ B+氨甲酰+)+丙氨酸所需酶量为一个酶活单
位。
@A $A #! 固定化酶活力的测定方法
称取 @ H固定化酶（湿）置于 %& 6; 三角瓶中，
加入 " 6;经 $( J预热的底物溶液（含 # H L ; 苄基
海因的氨水+氯化铵 IF (A % 缓冲液），$( J反应 @&
60K，然后加入 &A #% 6; @&’三氯乙酸终止反应，用
毛细管电泳测定产物的变化并计算酶活性。固定化
酶的活性回收率（’）为固定化酶总活性和固定化
中加入酶液总活性与上清液酶活之差的比值。
@A $A $! 蛋白浓度测定
蛋白质浓度测定采用 U8=WX.8W 法［@$］，以牛血清
白蛋白作为标准。
#" 结果与讨论
#A @! 不同聚苯乙烯树脂固定化 )+海因酶比较
采用不同氨基基团的聚苯乙烯树脂对 )+海因
酶进行固定化实验，以固定化酶的酶活回收率为考
察标准，结果见表 @。分析几种大孔聚苯乙烯树脂万方数据
! "##$ 年 $ 月 贾红华等：聚苯乙烯树脂固定化 %&海因酶的初步研究 · ’(! ·
可知，功能基为伯氨基和仲氨基的聚苯乙烯树脂固
定化酶的活力回收率较高。特别是以聚苯乙烯树脂
%)" 为原料制备的固定化酶，酶活回收率较高，且该
聚苯乙烯树脂价格低廉，固定化酶制备与再生较为
容易等特点，具有应用价值。因此以下实验采用
%)" 为聚苯乙烯树脂，来进行离子交换树脂固定化
%&海因酶的研究。
表 *! 不同聚苯乙烯树脂固定化 %&海因酶比较
+,-./ *! 011/23 41 5,67489 2,667/6 4: 3;/ ,237573< 41 %&;<=,:347:,9/
树脂类型 功能基 全交换量
酶活回收率 >
?
%#*@ 季氨基 （!）’’A # *$A (
%)" 伯氨基 （!）’’A B ’(A "
%B# 伯氨基 （!）’CA $ *C
%B" 仲氨基 （!）’(A $ "#A *
%’$ 仲氨基 （!）’$A C *’
%*$ 叔氨基 （!）’CA $ **A $
%** 叔氨基 （!）’’A B *"
%#* 季氨基 （!）’(A $ **
"A "! 固定化条件的优化
"A "A *! 温度对固定化效果的影响
温度是影响酶与聚苯乙烯树脂发生固定化反应
的一个重要因素，温度过低，酶固定化量少，固定效
率低，温度过高酶失活加快。取处理过的聚苯乙烯
树脂（每份 * D），加入酶液（B ED > EF）$ EF，分别在
不同温度下固定化 *C ;，测固定化酶的相对活力。
从图 * 可以看出，固定化温度在 "$ G时制得的固定
化酶酶活回收率最高。
图 *! 温度对固定化效果的影响
H7DA *! 011/23 41 3/EI/6,386/ 4: 7EE4-7.7J,374: 41 %&;<=,:347:&
,9/ ,2375737/9
"A "A "! 固定化时间对固定化效果的影响
取处理过的聚苯乙烯树脂，其它固定化条件不
变，分别取不同固定化时间，结果见图 "。随着固定
化时间的增加，固定化酶活力增加。固定化 *" ;，制
得的固定化酶活力活力回收率已达最高值
（’(A "?），时间延长酶活力回收率不再增加。缩短
固定化时间具有实际应用意义，因此选择固定化时
间为 *" ;。
图 "! 时间对 %&海因酶固定化的影响
H7DA "! 011/23 41 37E/ 4: 7EE4-7.7J,374: 41 %&;<=,:347:,9/
"A "A (! 酶质量浓度对固定化效果的影响
取 C 份处理过的聚苯乙烯树脂分别加入不同浓
度的酶液 $ EF，其它条件不变，测定固定化酶相对
活力，结果如下（图 (）。随着酶浓度的增加，固定化
酶活力增加，当酶质量浓度为 C ED > EF，聚苯乙烯树
脂固定量已趋于饱和，所得的固定化酶活力不再增
加，从经济角度考虑已无增加酶量的必要，选此浓度
为最佳。
图 (! 蛋白浓度对 %&海因酶固定化的影响
H7DA (! 011/23 41 24:2/:36,374: 41 I643/7: 4: 7EE4-7.7J,374: 41 %&
;<=,:347:,9/
"A (! 固定化 %&海因酶性质的确定
"A (A *! 温度对固定化酶的活性的影响
在海因酶法制备 K&氨甲酰&%&苯丙氨酸体系
中，由于底物苄基海因溶解度较低，且随着反应的进
行，需要底物中的 F&苄基海因不断自发消旋为 %&苄万方数据
! · ""! · 生物加工过程 第 # 卷第 $ 期
基海因，使反应进行完全。在较高的温度下进行酶
解反应，有利于提高底物的溶解度、加快消旋速度和
反应速度，因此提高酶反应温度具有实际的应用意
义。在不同温度下测定固定化海因酶转化苄基海因
的活性，从图 " 可以看出，固定化海因酶最适温度为
"% &，而游离酶为 #’ &，酶经固定化后作用苄基海
因底物的最适温度提高。
—&—固定化酶；—(—游离酶
图 "! 温度对固定化酶活性的影响
()*+ "! ,--./0 1- 0.23.45064. 17 08. 5/0)9)0).: 1- 08. -4.. 57; )2<
21=)>)?.; !<8@;5701)75:.
$+ #+ $! 3A对固定化酶的活性的影响
3A也是影响 B<苄基海因消旋速率的一个重要
因素，3A值越高，消旋越快。在不同 3A 条件下，测
定固定化酶的酶活性，如图 % 表明，固定化酶的最适
3A为 ’+ %，而游离酶最适 3A为 ’+ C，且在 3A D+ % E
F 范围内，其活性保持稳定，它的最适 3A 范围变宽
使这种固定化酶具有较好的应用前景。
—&—固定化酶；—(—游离酶
图 %! 3A对酶促反应的影响
()*+ %! ,--./0 1- 3A 17 08. 5/0)9)0).: 1- 08. -4.. 57; )221=)>)?.;
!<8@;5701)75:.
$+ #+ #! 固定化 G<海因酶的储存稳定性
将固定化 G<海因酶密封保存于带玻璃塞的三
角瓶内，在 " &下贮存 HC ;，定时测定固定化 G<海
因酶酶活。从表 $ 的结果可以看出，" &贮存 #C ;
酶活力基本不变；保存 HC ;，酶活损失 I#J，酶经固
定化后具有较好的储存稳定性。
表 $! 固定化 G<海因酶的储存稳定性
K5=>. $! L0145*. :05=)>)0@ 1- 57; )221=)>)?.; G<8@;5701)75:. 50 " &
固定化酶储存时间 M ; C #C ICC
相对活力 M J ICC FD ’D
$+ #+ "! 固定化 G<海因酶的操作稳定性
操作稳定性是衡量固定化酶实用价值的主要指
标。以 " * M B苄基海因为底物进行批次操作，结果
如表 # 所示。反应 % ; 后，相对活力仍为原来的
D’+ %J，表明其操作稳定性较好，以 " * M B苄基海因
为底物，"% &下进行连续操作实验，测得其半衰期
为 II ;。由以上可以看出以聚苯乙烯树脂为载体制
备的固定化酶，其酶活性有所提高，但实验过程中发
现其稳定性并不是十分理想，可能是聚苯乙烯微孔
结构中的残留的戊二醛造成酶分子变性失活或者是
所提取的酶液为粗酶内含杂蛋白对固定化酶的操作
稳定性产生了一定的影响。
表 #! 固定化 G<海因酶的操作稳定性
K5=>. #! N./@/>)7* .O3.4)2.70 -14 )221=)>)?.; G<8@;5701)75:.
反应时间 M ; % II
固定化酶相对活力 M J D’+ % %C+ H
$+ #+ %! 固定化海因酶的米氏常数
配制不同浓度的底物溶液，于 "% &、3A ’+ % 时
测定固定化酶以及游离酶的活力，即相对反应初速
度，用 B)7.P.59.4可以看出，固定化酶的 "2值是游离酶的 I+ ’ 倍，说
明酶经固定化后底物扩散的作用影响不大。但 #25O
值有所增大。
表 "! 游离和固定化 G<海因酶的动力学参数
K5=>. "! K8. R)7.0)/ 35452.0.4: 1- -4.. 57; )221=)>)?.; G<8@<
;5701)75:.
"2 M（221> M B） #25O M（221> M B·2)7）
游离酶 I"+ F’% C+ HCC
固定化酶 $D+ C#C I+ I’D
（下转第 %D 页）
万方数据
! "##$ 年 $ 月 吴永宏等：核酸酶 %& 催化水解热变性 ’()的研究 · $*! ·
学研究结果表明核酸酶 %& 催化米氏常数 !+ ,
$- .&. / &# 0" 1 2 3。
参考文献：
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"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
"*#O"*$C
（上接第 TT 页）
!" 结" 论
本文尝试了不同功能基团的聚苯乙烯树脂进行
’O海因酶的固定化，结果表明氨基树脂功能基为伯
氨基和仲氨基效果较好。从酶活回收率，固定化酶
的使用寿命，聚苯乙烯树脂价格等方面综合考虑，认
为采用聚苯乙烯树脂 ’S" 所制备的固定化酶具有
应用价值。采用该树脂制备固定化酶的最优条件
是：酶质量浓度 X +1 2 +3、温度 "$ ]、时间 &" A。所
得固定化酶的最适作用温度 T$ ]，最适作用 IB 为
.- $，且作用温度及适宜作用 IB 较广，!+为游离酶
的 &- . 倍，且储存稳定性、操作稳定性较好。T$ ]
下进行连续反应，其半衰期为 && E。
参考文献：
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