全 文 ：第 １１ 卷第 ４ 期
２０１３ 年 ７ 月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ４
Ｊｕｌ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０４． ０１２
收稿日期：２０１２ － ０４ － １７
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（博士生导师类）（２０１０３２２１１１０００６）；国家高技术研究发展计划（８６３ 计划）（２０１２ＡＡ０２１５０３）
作者简介：徐 铮（１９８６—），男，江苏镇江人，博士研究生，研究方向：工业生物催化；徐 虹（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｕｈ＠ ｎｊｕｔ ｅｄｕ ｃｎ
生物法生产 Ｄ 塔格糖的研究进展
徐 铮，李贵祥，李 莎，徐 虹
（南京工业大学 食品与轻工学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 ２１１８００）
摘 要：Ｄ 塔格糖具有多种独特的生理特性与功能，近年来已被发达国家开发作为具有高经济附加值的功能性甜
味剂进行销售。 Ｄ 塔格糖的商业化生产长期以来依赖化学催化法，随着 ２０ 世纪 ９０ 年代利用 Ｌ 阿拉伯糖异构酶
（简称 Ｌ ＡＩ酶）催化 Ｄ 半乳糖制备 Ｄ 塔格糖技术的兴起，生物法生产 Ｄ 塔格糖成为了新的发展趋势。 结合笔
者所在课题组近年来的研究成果，就 Ｄ 塔格糖生物法生产工艺的研究现状和前景进行综述与展望。
关键词：Ｄ 塔格糖；功能性甜味剂；Ｌ 阿拉伯糖异构酶
中图分类号：Ｑ７５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０４ － ００６４ － ０８
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ⁃ｔａｇａｔｏｓｅ
ＸＵ Ｚｈｅｎｇ，ＬＩ Ｇｕｉｘｉａｎｇ，ＬＩ Ｓｈａ，ＸＵ Ｈｏｎｇ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄ⁃ｔａｇａｔｏｓｅ ｈａｓ ｎｕｍｅｒｏｕｓ ｕｎｉｑｕｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ，ｔｈｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ ｈａｖｅ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ ｉｔ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｇｈ ａｄｄｅｄ ｖａｌｕｅ． Ｆｏｒ ａ ｌｏｎｇ
ｔｉｍｅ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ⁃ｔａｇａｔｏｓｅ ｒｅｌｉｅｄ ｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃａｔａｌｙｓｉｓ． Ｉｎ ｔｈｅ １９９０′ ｓ，ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂｙ ｕｓｉｎｇ
Ｌ⁃ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ａｓ ａ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ，ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ ｔｈｅ ｉｓｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｄ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｉｎｔｏ Ｄ⁃ｔａｇａｔｏｓｅ ｗａｓ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｔｈｅ ｂｉｏ⁃ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ⁃ｔａｇａｔｏｓｅ ｈａｓ ｂｅｃｏｍｅ ｔｈｅ ｎｅｗ ｔｒｅｎｄ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｒｅｇａｒｄｉｎｇ ｔｏ ｏｕｒ
ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｔｈｅ ｂｉｏ⁃ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ⁃ｔａｇａｔｏｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄ⁃ｔａｇａｔｏｓｅ；ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ；Ｌ⁃ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ
Ｄ 塔格糖（Ｄ⁃ｔａｇａｔｏｓｅ）是一种六碳酮糖，它是
Ｄ 半乳糖的异构物。 纯天然的 Ｄ 塔格糖不易寻觅，
仅发现于乔木（Ｓｔｅｒｃｕｌｉａ ｓｅｔｉｇｅｒａ）分泌的树胶中；灭菌
后的牛奶、热可可、奶酪和芝士等也含有微量的Ｄ 塔
格糖。 由于食用 Ｄ 塔格糖后，人体小肠仅能吸收约
２０％，因此它基本不产生热量也不会引起血糖波动；
另一方面，Ｄ 塔格糖可以预防龋齿生成，还能够被肠
道中的微生物利用从而促进某些益生菌的生长［１］。
近年来，随着生活水平的提高以及肥胖、糖尿病等疾
病的普遍化，将 Ｄ 塔格糖作为功能性甜味剂以取代
蔗糖的呼声日益高涨，这引起了人们对 Ｄ 塔格糖的
高度关注。
Ｂｅａｄｌｅ等［２］于 １９９１ 年发明了利用 Ｃａ（ＯＨ） ２异
构 Ｄ 半乳糖生产 Ｄ 塔格糖的工艺，其中 Ｄ 半乳
糖可以通过水解乳糖或者更为廉价的乳清（制作乳
制品产生的废料）得到，工艺成本能被市场接受。
然而，这种方法需要使用大量的强酸对反应液进行
中和，易造成废水污染；而且反应的副产物较多，对
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下游分离造成了困难。 Ｃｈｅｅｔｈａｍ 等［３］发现 Ｌ 阿拉
伯糖异构酶（ Ｌ⁃ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，简称 Ｌ ＡＩ 酶，
ＥＣ ５ ３ １ ４）能够催化 Ｄ 半乳糖生成 Ｄ 塔格糖；
此后的 ２０ 年间，通过对不同种类的微生物进行产酶
筛选、外源表达和性质表征，学者们已经找到了多
种适合 Ｄ 塔格糖工业化生产的 Ｌ ＡＩ 酶；且发现
主要具有对 Ｄ 半乳糖的转化率高、酶的热稳定性
好、酶的最适催化 ｐＨ 偏向于适合工业化生产的酸
性条件（ｐＨ在 ５ ０ ～ ６ ０ 之间）等特点［４］。
另一方面，利用分子生物学手段对野生型的
Ｌ ＡＩ酶进行基因工程改造也可以有效地提升野生
酶的工业化应用潜质；主要体现在通过计算机分子
模拟技术建立 Ｌ ＡＩ酶的结构模型和利用理性设计
可对酶的重要氨基酸残基进行改造。 在催化工艺
方面，固定化细胞 ／酶的批次转化技术取得了成效；
但底物转化率低、反应周期长、酶活性的半衰期短
等难题仍是该项技术的瓶颈。 此外，开发安全性更
高的食品级 Ｌ ＡＩ酶外源表达宿主以取代重组大肠
杆菌的任务迫在眉睫。 目前，美国 Ｓｐｈｅｒｉｘ公司正将
Ｄ 塔格糖作为Ⅱ型糖尿病的治疗药物进行三期临
床试验［５］，一旦试验成功，Ｄ 塔格糖将在生物医药
领域获得广阔的前景，也必将对生物法生产工艺产
生更加迫切的需求。 笔者结合所在课题组近年来
在 Ｌ ＡＩ酶以及 Ｄ 塔格糖生物法生产工艺方面的
研究成果，对 Ｌ ＡＩ酶的筛选和应用、基因工程改造
研究以及固定化技术的应用等方面进行综述，以期
为Ｄ 塔格糖等新型功能性甜味剂的绿色生产提供
参考。
１ Ｌ ＡＩ酶的来源与性质研究
目前已知的 Ｌ ＡＩ酶都是从原核微生物中通过
克隆和外源表达得到的，包括枯草芽胞杆菌［６］、植
物乳杆菌［７］、嗜酸热细菌［８］、嗜热脂肪芽胞杆菌［９］
和海栖热袍菌［１０］等（表 １）。
表 １ 不同微生物来源的 Ｌ ＡＩ酶的酶学性质比较
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｌ ＡＩｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
来源微生物 最适反应温度 ／ ℃
最适反应
ｐＨ 金属离子及用量
对 Ｄ 半乳糖的
催化效率 ／
（ｍｍｏｌ·Ｌ － １·ｍｉｎ － １）
文献
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． ＡＮＡ － ３ １５ ～ ３５ ５ ５ ～ ６ ５ Ｍｎ２ ＋ （０ ６∗） 未报道 ［１１］
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒ． １６８ ３２ ７ ５ Ｍｎ２ ＋ （１ ０） 未测出 ［６］
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ２３Ｋ ３０ ～ ４０ ５ ０ ～ ７ ０ Ｍｎ２ ＋ （０ ８）、Ｍｇ２ ＋ （０ ８） １０ ３０ ［１２］
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ ５０ ７ ５ ～ ８ ０ 无金属离子需求 ０ ４０ ［９］
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０ ５０ ７ ５ Ｍｎ２ ＋ （１ ０）、Ｃｏ２ ＋ （１ ０） 未报道 ［１３］
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＣ８ ６０ ７ ５ Ｍｎ２ ＋ （１ ０）、Ｃｏ２ ＋ （０ ５） １ ６０ ［７］
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＣＧＭＣＣ２９２１ ６５ ６ ５ Ｍｎ２ ＋ （１ ０）、Ｃｏ２ ＋ （２ ０） ９ ０２ ［１４］
Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ６５ ６ ０ ～ ６ ５ Ｍｎ２ ＋ （１ ０）、Ｃｏ２ ＋ （１ ０）、Ｍｇ２ ＋ （１ ０） ３ ３０ ［８］
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ７０ ７ ０ ～ ７ ５ Ｍｎ２ ＋ （１ ０） ４ ３０ ［９］
Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｓ ＡＴＣＣ４３０６８ ７５ ７ ５ Ｍｎ２ ＋ （１ ０）、Ｃｏ２ ＋ （０ ５） ９ ３０ ［１５］
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＵＳ１００ ８０ ７ ５ ～ ８ ０ 无金属离子需求 ８ ４８ ［１６］
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ９０ ７ ５ Ｍｎ２ ＋ （５ ０）、Ｃｏ２ ＋ （１ ０） ８ ５０ ［１０］
Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ ９５ ９ ５ ～ １０ ５ Ｎｉ２ ＋ ５ １６（９ ４７ａ） ［１７］
注：ａ表示在含有硼酸的条件下；括号中数据为金属离子的用量（ｍｏｌ ／ Ｌ）。
由表 １ 可知：可能是由于这些微生物的生存环
境迥异，在长期的自然进化后造成不同来源的
Ｌ ＡＩ酶的催化性质也有明显的区别。
１）Ｄ 半乳糖异构反应的最适温度不同，从
１５ ～ ９５ ℃均有报道。 其中 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． ＡＮＡ⁃３ 和
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ２３Ｋ 来源的 Ｌ ＡＩ 酶能够在 ４ ℃
的低温下进行稳定的催化［１１ － １２］，而 Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ
ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ Ｌ ＡＩ 酶则可以在 ９５ ℃的极端温度下
仍保持酶活性［１７］。 总的来说，根据最适反应温度的
不同可以将 Ｌ ＡＩ 酶区分为三类： 常温型
（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ）Ｌ ＡＩ 酶、嗜热型（ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ） Ｌ ＡＩ
酶和超嗜热型（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ） Ｌ ＡＩ 酶；它们的
最适反应温度分别是小于 ６０ ℃、６０ ～ ８０ ℃之间和
８０ ～ ９５ ℃之间［１８］。 其中嗜热型被认为更适合于
５６ 第 ４ 期 徐 铮等：生物法生产 Ｄ 塔格糖的研究进展
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Ｄ 塔格糖的工业化生产，主要原因是 Ｄ 半乳糖至
Ｄ 塔格糖的异构反应所需的吉布斯自由能较高
（４ ９６ ｋＪ ／ ｍｏｌ），因此需要一个相对高的催化温度才
能获得较高的转化率，但过高的温度反而会导致褐
变反应发生，给产品品质造成影响，因此多数学者
认为 ６０ ～ ７０ ℃的反应温度最为合适［１，４］。
２）最适反应 ｐＨ 不同，从 ５ ０ 至 １０ ５ 均有报
道。 其中多数 Ｌ ＡＩ酶的最适催化 ｐＨ在 ７ ５ ～ ８ ５
之间，但工业生产要求其最适催化 ｐＨ 在偏酸性范
围内，从而可避免碱性反应条件带来的非特异性副
反应，并能与乳糖水解所需的酸性 ｐＨ 相一致，避免
重复调节，简化生产工艺［１，４］。
３）对金属离子的需求不同。 多数 Ｌ ＡＩ酶发挥
酶活性以及保持热稳定性都需要金属离子的参与，
其中以 Ｍｎ２ ＋ 、Ｃｏ２ ＋ ２ 种离子最为常见。 但 Ｃｏ２ ＋不
能用于食品工业中，所以高度依赖 Ｃｏ２ ＋的 Ｌ ＡＩ 酶
在工业化应用中存在比较大的局限性［１０］。 有趣的
是，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ 与 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＵＳ１００ 这 ２ 种来源的 Ｌ ＡＩ 酶经过 ＥＤＴＡ处理后酶
活力未见下降，可能的原因是这 ２ 种酶不依赖金属
离子；或酶的活性中心与金属离子的结合能力很
强，金属离子不易脱离［１６］。
４） 底物特异性有显著差别。 例如 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ和 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ 来源的 Ｌ ＡＩ 酶只具
有催化 Ｌ 阿拉伯糖的能力［６，１３］，不能催化 Ｄ 半乳
糖，这在 Ｌ ＡＩ酶家族中是十分特殊的；它们将成为
研究 Ｌ ＡＩ酶底物选择性的合适对象。
５）对 Ｄ 半乳糖的催化效率不同。 几乎所有的
Ｌ ＡＩ酶对 Ｌ 阿拉伯糖的催化效率（ｋｃａｔ ／ Ｋｍ值）都远
高于 Ｄ 半乳糖，因此 Ｌ ＡＩ 酶对 Ｄ 半乳糖的催化
效率普遍偏低。 但 Ｃｈｅｎｇ 等［１５］ 发现 Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ
ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｓ ＡＴＣＣ４３０６８来源的 Ｌ ＡＩ酶对 Ｄ 半乳糖
具有相对较高的催化效率 （ ｋｃａｔ ／ Ｋｍ ＝ ９ ３ ｍｍｏｌ ／
（Ｌ·ｍｉｎ））。 Ｒｈｉｍｉ 等［１２］于 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ２３Ｋ 菌
株中得到了可在低温和酸性环境下催化 Ｄ 半乳糖
的 Ｌ ＡＩ 酶，它对 Ｄ 半乳糖的 ｋｃａｔ ／ Ｋｍ值达到 １０ ３
ｍｍｏｌ ／ （Ｌ·ｍｉｎ），为目前文献报道的最高值。
对于 Ｄ 塔格糖的工业化生产而言，如果能筛选
到一种嗜热、耐酸性环境、无额外金属离子需求且对
Ｄ 半乳糖催化效率高的 Ｌ ＡＩ酶将非常有利于工艺
的进步。 笔者所在课题组从传统泡菜中筛选到 １ 株
产 Ｌ ＡＩ酶的发酵乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）菌
株［１９ － ２０］，该菌株所含的 Ｌ ＡＩ 酶编码基因经外源表
达后发现重组 Ｌ ＡＩ酶催化Ｄ 半乳糖的最适温度为
６５ ℃、最 适 ｐＨ 为 ６ ５， 催 化 效 率 达 到 ９ ０２
ｍｍｏｌ ／ （Ｌ·ｍｉｎ），体现出一定的工业化应用潜质［１４，２１］。
２ Ｌ ＡＩ酶的基因工程改造
鉴于目前用于 Ｄ 塔格糖生产的 Ｌ ＡＩ 酶在酶
学性质上都存在着可以提升的空间，因此人们力图从
分子水平上对其进行合理的改造。 ２００６ 年大肠杆菌
来源的 Ｌ ＡＩ酶晶体结构得到成功解析（ＰＤＢ数据库
登录号：２ＡＪＴ ／ ２ＨＸＧ），这为 Ｌ ＡＩ酶的基因工程改造
奠定了结构生物学基础［２２］。 近年来定向进化技术和
以计算机同源建模为指导的基因定点突变技术成为
Ｌ ＡＩ酶改造的有效手段。 作为工业应用的重要指
标：酶活力、最适反应温度、最适反应 ｐＨ以及底物选
择性的改造得到了较多的关注（表 ２）。
表 ２ 对 Ｌ ＡＩ酶关键氨基酸残基的突变结果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ Ｌ⁃ＡＩｓ
氨基酸残基 对 Ｌ ＡＩ酶酶学性质的影响 来源微生物 文献
Ｌ２６９ 最适反应 ｐＨ Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ［８］
Ｑ２６８ 最适反应 ｐＨ Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＵＳ１００ ［２３］
Ｔ２６８ ｐＨ稳定性 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． ＡＮＡ⁃３ ［１１］
Ｎ１７５ 最适反应温度 Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＵＳ１００ ［２３］
Ｆ２７９ 底物选择性 Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＵＳ１００ ［２４］
Ｄ３０８、Ｆ３２９、Ｅ３５１、Ｈ４４６ 酶活力 Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＵＳ１００ ［２４］
Ｙ３３３ 底物亲和性 Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ［２５］
Ｍ３２２、Ｓ３９３、Ｖ４０８ 酶活力 Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ［２６］
Ｖ４０８ 最适反应 ｐＨ、酶活力 Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ［２７］
Ｎ４７５ 酶活力 Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ［２７］
Ｗ１６４、Ｎ４７５、Ｃ４５０ 酶活力、底物亲和性 Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ［２８］
Ｌ２０ 酶活力 Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｓ ＡＴＣＣ４３０６８ ［２９］
６６ 生 物 加 工 过 程 第 １１ 卷
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对于关键氨基酸残基作用的研究主要集中于
嗜热脂肪芽胞杆菌来源的 Ｌ ＡＩ酶。 Ｒｈｉｍｉ等［２３］通
过对 Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＵＳ１００ Ｌ ＡＩ 酶空间结构
的模拟研究，定点突变了该酶的第 １７５ 号氨基酸，突
变体（Ｎ１７５Ｈ）因此获得了一个较野生酶更宽的最
适反应温度域（５０ ～ ６５ ℃），相比最适反应温度较高
的野生酶（８０ ℃），突变体有利于避免生产中的褐变
副反应。 Ｏｈ 等［２７］以易错 ＰＣＲ 的结果为基础进一
步进行定点突变研究，发现 Ｇ． ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｌ
ＡＩ酶第 ４０８ 位氨基酸由中性氨基酸变为极性或碱
性氨基酸时，突变株的最适反应 ｐＨ 有显著降低（由
８ ５ 降为 ７ ５）。 推测是因为该位置靠近 Ｌ ＡＩ酶的
活性中心，因此氨基酸极性的变化可能导致催化中
心微环境的电荷分布发生改变，因而增强了 Ｌ ＡＩ
酶在酸性条件下催化底物的能力。 Ｏｈ 等［２８］通过对
Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ｌ ＡＩ 酶的多个重要氨基酸残
基进行定点突变，发现第 １６４ 位氨基酸的苯环和第
４７５ 位氨基酸的侧链大小对 Ｌ ＡＩ 酶催化 Ｄ 半乳
糖的能力有较大影响，其双点突变株 Ｃ４５０Ｓ
Ｎ４７５Ｋ对 Ｄ 半乳糖的催化效率提高了 ５ 倍，对 Ｄ
半乳糖的转化率由 ４６％ 提升到 ５８％ 。 ２０１０ 年，
Ｐｒａｂｈｕ 等［２５］利用同源建模分析了 Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
Ｌ ＡＩ酶催化中心和其附近的氨基酸残基，并选择性
地将其中的多个位点进行定点突变，结果表明突变体
（Ｙ３３３Ａ）催化 Ｌ 阿拉伯糖的能力完全丧失。 笔者认
为催化活性中心的关键氨基酸残基与底物之间的距
离决定了催化能力，因此，催化中心附近的保守氨基
酸残基对于 Ｌ ＡＩ酶的底物特异性具有重要的意义。
这为 Ｌ ＡＩ酶的底物特异性改造提供了思路。
３ 利用固定化技术生产 Ｄ 塔格糖
作为迄今最有效的 Ｄ 塔格糖生物法生产方
法，固定化细胞 ／酶生产 Ｄ 塔格糖的技术得到了较
为深入的研究，已建立了多种生产工艺（表 ３）。
表 ３ 固定化细胞 ／酶通过 Ｄ 半乳糖生产 Ｄ 塔格糖的技术比较
Ｔａｂｌｅ ３ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｄ⁃ｔａｇａｔｏｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌｓ ｏｒ ｅｎｚｙｍｅｓ
生产工艺 操作温度 ／℃
操作 ｐＨ ρ（底物） ／
（ｇ·Ｌ － １）
转化率 ／
％
产率 ／
（ｇ·Ｌ － １·ｈ － １） 文献
固定化嗜热型 Ｌ ＡＩ酶（Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ来源） ６０ ８ ０ ３００ ａ４８ （７２ ｈ） ５４ ０ ［３０］
固定化嗜热型 Ｌ ＡＩ酶（Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ来源） ６５ ８ ０ ５００１００
ａ４６ （２４ ｈ）
ａ５０ （１６８ ｈ）
９ ６０
１３ ３ ［３１］
固定化嗜热型 Ｌ ＡＩ酶（Ｔａｎ． ｍａｔｈｒａｎｉｉ来源） ６５ ６ ９ ３００ ４２ （４８ ｈ） ２ ６３ ［３２］
固定化超嗜热型 Ｌ ＡＩ酶（Ｔ． ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ来源） ７０ ７ ５ ３００ ｂ４６ （１２０ ｈ） １ １５ ［３３］
固定化重组 Ｅ． ｃｏｌｉ细胞
（含 Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｌ ＡＩ酶编码基因） ６０ ７ ０ ３００
ａ１９ ５ （３５ ｈ） ２ ９０ ［３４］
固定化重组 Ｅ． ｃｏｌｉ细胞
（含 Ｔ． ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ Ｌ ＡＩ酶编码基因） ７０ ７ ０
１８０
９０
ａ２７ （１２ ｈ）
ａ４２ （１２ ｈ）
３ ９７
３ １５ ［３５］
固定化重组 Ｅ． ｃｏｌｉ细胞
（含 Ｌ． ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ Ｌ ＡＩ酶编码基因） ６５ ６ ５ １００
ｃ６０ ６ （２４ ｈ） ２ ５３ ［３６］
注：ａ表示利用填充床生物反应器，ｂ表示 ｐＨ控制策略，ｃ表示添加硼酸；括号中数据为达到相应转化率所需酶的转化时间。
３ １ 利用固定化细胞技术生产 Ｄ 塔格糖
利用海藻酸钠固定重组 Ｅ． ｃｏｌｉ 细胞生产 Ｄ 塔
格糖的方法很早就进入了学者们的视野，该法操作
性强、可靠性高、工艺成本低廉，具有产业化应用的
潜力。 一般来说，诱导表达后的重组 Ｅ． ｃｏｌｉ 细胞经
过海藻酸钠包埋和 ＣａＣｌ２处理后即可用于 Ｄ 半乳
糖的催化。 Ｈｏｎｇ等［３５］建立了一种稳定而又廉价的
海藻酸钠固定重组 Ｅ． ｃｏｌｉ细胞生产 Ｄ 塔格糖的技
术，它具有 ４３ ｄ的酶活性半衰期；转化液杂质少，经
离子交换柱分离后即可得到高纯度 （ ＞ ９９％ ） 的
Ｄ 塔格糖。 但利用大肠杆菌作为 Ｄ 塔格糖的生
产菌株具有安全隐患；因此，结合食品级微生物，开
发一种更加安全的固定化细胞生产技术可成为未
来的研究方向。 笔者对食品级的发酵乳杆菌
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＣＧＭＣＣ２９２１ 菌株采用海藻
酸钠包埋和戊二醛交联的方法制作固定化细胞生
７６ 第 ４ 期 徐 铮等：生物法生产 Ｄ 塔格糖的研究进展
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产 Ｄ 塔格糖；在添加硼酸的条件下，Ｄ 半乳糖至
Ｄ 塔格糖的转化率可以达到 ６０％ ，产率达到
１１ １ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），在 ８ 个转化批次（共计 １９２ ｈ）内未
见转化率有明显的下降［３７］。 然而，要想在成本上达
到工业化生产的要求，必须对生产菌株进行高密度
培养以及高效表达的深入研究。
３ ２ 利用固定化酶技术生产 Ｄ 塔格糖
固定化酶技术生产 Ｄ 塔格糖可以得到很高的
生产强度，但需要繁琐的酶纯化过程。 Ｋｉｍ 等［３１］利
用海藻酸钠包埋嗜热型 Ｌ ＡＩ 酶生产 Ｄ 塔格糖，
产率达到 １３ ３ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 Ｒｙｕ 等［３０］ 将纯化后的
Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｌ ＡＩ酶经海藻酸钠包埋，通过
生物反应填充床（ｐａｃｋｅｄ⁃ｂｅｄ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）进行 Ｄ 塔
格糖的生产，在考察了反应床的最适高径比等因素
后成功得到 ５４ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）的生产强度，为目前有文献
报道的最高值。 Ｊｕｎｇ等［３４］认为，利用固定化酶技术
之所以可以得到很高的 Ｄ 塔格糖产率，是因为纯
化后的 Ｌ ＡＩ酶经固定化后没有其他宿主蛋白的干
扰，生物催化可以以最理想的反应趋势进行；而固
定化细胞内含有大量的宿主蛋白质，这些蛋白质的
存在具有相当大的空间位阻作用，导致使用固定化
细胞时 Ｄ 塔格糖的产率相对低很多。 此外，固定
化 Ｌ ＡＩ酶技术还可以有效改善 Ｌ ＡＩ 酶的性质；
Ｌｉａｎｇ等［３８］利用海藻酸钠包埋 Ｔａｎ． ｍａｔｈｒａｎｉｉ 来源
的 Ｌ ＡＩ酶，包埋后固定化酶的最适反应温度有显
著的提高（由 ６０ ℃提高至 ７５ ℃），而且在 ｐＨ ５ ５ ～
８ ０ 的范围内可以保持 ８０％以上的酶活力，这些数
据都大大优于游离酶。 Ｊｅｂｏｒｓ等［３９］首次利用 Ｎｏｒｉａ ／
ＮｏｒｉａＰＧ高分子材料固定化 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ Ｌ ＡＩ
酶， 该酶在高温和低 ｐＨ 条件下的稳定性相比于游
离酶均得到提高。
４ 通过改变化学反应平衡提高 Ｄ 塔
格糖的产量
在 Ｌ ＡＩ 酶异构 Ｄ 半乳糖的反应过程中，某
些和产物 Ｄ 塔格糖亲和力高的物质（如硼酸）能与
之配位化合而使其脱离反应，导致溶液中的产物减
少，化学平衡向产物生成的方向进行。 Ｌｉｍ 等［４０］首
次通过使用硼酸，利用纯化后的嗜热型 Ｌ ＡＩ 酶将
Ｄ 半乳糖至 Ｄ 塔格糖的转化率提高至 ７７ ４％ ，这
是利用 Ｌ ＡＩ酶制备 Ｄ 塔格糖所获得的最高转化
率。 所形成的 Ｄ 塔格糖 硼酸配位化合物溶于甲
醇后，其中的硼酸可以通过蒸发的形式除去，不会
影响产品纯度，因此，该法具有很大的应用前景。 进
一步研究证明，在含有硼酸的条件下，Ｌ ＡＩ 酶对底
物的催化效率显著提高。 Ｌｉ 等［１７］报道 Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ
ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ Ｌ ＡＩ酶在加入硼酸的情况下对 Ｄ 半乳
糖的催化效率（ｋｃａｔ ／ Ｋｍ）由 ５ １６ ｍｍｏｌ ／ （Ｌ·ｍｉｎ）提高
至 ９ ４７ ｍｍｏｌ ／ （Ｌ·ｍｉｎ），提升幅度达到 ８３ ５％。
５ 通过 Ｌ ＡＩ 酶与商品化酶的共同
作用生产含有 Ｄ 塔格糖的稀有糖
混合物
乳糖在水解过程中会产生等摩尔的葡萄糖与
Ｄ 半乳糖，其中葡萄糖不参与 Ｄ 塔格糖的生成，
从而可以被用来生产其他稀有糖。 Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ 等［３２］
最早报道以乳糖为原料，利用固定化嗜热 Ｌ ＡＩ酶、
β 半乳糖苷酶和商品化葡萄糖异构酶生产包含有
Ｄ 塔格糖和果糖的混合糖浆，达到充分利用葡萄糖
来提高产品附加值的目的。 Ｒｈｉｍｉ 等［４１］用海藻酸
钠包埋共表达有嗜热型 Ｌ ＡＩ酶和葡萄糖异构酶的
基因工程菌，以乳糖水解物为原料利用生物填充床
连续批次生产 Ｄ 塔格糖和果糖获得成功；但混合
糖浆中各组分的分离仍需要下游技术的研究支撑，
目前仅停留在探索阶段。
６ Ｄ 塔格糖的分离纯化研究
建立高效的 Ｄ 塔格糖分离提取工艺是下游技
术的研究目标。 利用有机溶剂萃取可以分离转化
液中的 Ｄ 塔格糖，许贵强等［４２］用苯基硼酸 季铵盐
离子溶剂萃取分离 Ｄ 塔格糖，萃取率为 ６５ ７％ ，回
收率达到 ９２ ３％ 。 但考虑到有机溶剂体系存在着
食品安全隐患与环境污染问题，因此，该法可能不
适宜大规模运用。 由于 Ｄ 塔格糖与 Ｄ 半乳糖属
于不同的醛酮糖形式，因此可以通过离子交换树脂
进行分离。 黄闻霞等［４３］利用 Ｃａ２ ＋型离子交换树脂
对化学法合成的 Ｄ 塔格糖进行纯化，得到纯度
９８％的 Ｄ 塔格糖，回收率达到 ８３％ ；脱盐后的 Ｄ
塔格糖经乙醇结晶后即可得到 Ｄ 塔格糖纯品。 这
种方法操作简单，可行性高。
７ 生物法生产 Ｄ 塔格糖的操作方法
与设备需求
Ｄ 塔格糖的生物法生产主要以乳清作为原料，
利用膜分离设备去除蛋白质、盐分等杂质并进行浓
缩，以固定化的乳糖酶水解浓缩液得到含有 Ｄ 半
８６ 生 物 加 工 过 程 第 １１ 卷
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乳糖与葡萄糖的混合物，再通过微生物（例如酿酒
酵母）发酵可以将其中的葡萄糖转化为乙醇并蒸馏
除去。 剩余的 Ｄ 半乳糖经过固定化的 Ｌ ＡＩ 酶
（或含有 Ｌ ＡＩ 酶的基因工程菌）转化为 Ｄ 塔格
糖，利用阳离子交换柱可以将未得到完全转化的
Ｄ 半乳糖分离回收。 将只含有 Ｄ 塔格糖的转化
液蒸发浓缩即可以进行产品结晶与干燥。 全过程
所涉及的设备包括膜过滤装置、发酵罐、离心机（或
板框式压滤机）、蒸馏设备、离子交换树脂、结晶设
备和干燥器等。 以美国卡夫食品有限公司的 Ｄ 塔
格糖生物法生产工艺为例［４４］，具体的操作方法与设
备使用如图 １ 所示。
图 １ 生物法生产 Ｄ 塔格糖的操作流程图（修改自 Ｉｂｒａｈｉｍ等［４４］ ）
Ｆｉｇ． １ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｄ⁃ｔａｇａｔｏｓｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
８ 生物法生产 Ｄ 塔格糖存在的问题
与发展前景
作为一种绿色低碳的生产技术，Ｄ 塔格糖的生
物法生产工艺仍然不能取代现有的化学催化法，主
要原因有以下几点：
１）工艺成本高。 就目前的技术而言，用固定化
Ｌ ＡＩ酶生产 Ｄ 塔格糖所得产率最高，但酶纯化过
程需要精密的纯化设备和复杂的过程控制，维护与
人工费用高昂，技术门槛偏高。 用固定化重组
Ｅ． ｃｏｌｉ细胞生产 Ｄ 塔格糖操作简便、方法成熟，缺
点是产率偏低，而且 Ｅ． ｃｏｌｉ 宿主在食品安全性上存
在隐患，但这种方法仍是最有产业化前景的。
２）生物法制备 Ｄ 塔格糖的反应周期偏长。 使
用批次转化生产 Ｄ 塔格糖的耗时一般在 ２４ ｈ ／批
次，甚至长达 １６８ ｈ ／批次，全程需要维持高温环境。
这与简单的化学催化法相比，能耗和反应周期都没
有优势。 用常温型 Ｌ ＡＩ酶生产 Ｄ 塔格糖虽在能
耗上相对廉价，但限于转化率太低（２０％ ～ ３０％ ），
实际应用价值不大。
３）缺乏对食品级 Ｌ ＡＩ酶表达宿主的开发和利
用。 由于 Ｄ 塔格糖在未来的主要应用方向是食品
和药品领域，因此，必须开发食品级（例如 ＧＲＡＳ 认
证）的微生物作为生物催化载体，潜在的候选对象
包括枯草芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母等。
Ｋｉｍ等［４５］将 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． Ｌ ＡＩ酶表达于有 ＧＲＡＳ
认证的微生物宿主中生产 Ｄ 塔格糖，但产率不详。
值得一提的是，Ｒｈｉｍｉ 等［４６］将 Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＵＳ１００ Ｌ ＡＩ 酶表达于益生菌 Ｌ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ 和
Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ菌株，新菌株能够在发酵牛奶的过程
中产生 Ｄ 塔格糖，使得制得的酸奶既保持了风味，
又降低了热量。
４）对 Ｌ ＡＩ酶催化机制的了解不足，难以有效
提高酶的催化性质。 由于 Ｌ ＡＩ酶的结构数据非常
９６ 第 ４ 期 徐 铮等：生物法生产 Ｄ 塔格糖的研究进展
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有限，很难利用结构生物学进行催化机制的解析和
酶工程改造的尝试；作为一种更加精确的手段，蛋
白质结晶技术对于 Ｌ ＡＩ酶底物催化过程的研究具
有重要作用，因此 Ｌ ＡＩ 酶的晶体解析将是未来的
重要课题。
当然，作为 Ｄ 塔格糖工业化生产的发展方向，
生物法工艺具有很大的潜力。 相对于化学制备法
而言，生物法的优势包括产物提取的简便性，催化
的高度专一性以及被社会认可的食品安全性。 而
核心技术的发展蓝图也已彰显，就是寻找一种能够
高效生产 Ｄ 塔格糖的 Ｌ ＡＩ 酶，建立一种高效生
产 Ｄ 塔格糖的廉价和安全的生产工艺。 相信随着
相关研究的不断深入，利用 Ｌ ＡＩ 酶制备 Ｄ 塔格
糖的生物法工艺能够走向成熟。
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ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ ＡＮＡ⁃３ ｉｓ
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ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｏｏｄ ｇｒａｄｅ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ２３Ｋ ｉｓ
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ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＵＳ１００ Ｌ⁃ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
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ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
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０７ 生 物 加 工 过 程 第 １１ 卷
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１７ 第 ４ 期 徐 铮等：生物法生产 Ｄ 塔格糖的研究进展
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