全 文 ：第 １３卷第 ４期
２０１５年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０４􀆰 ０１２
收稿日期：２０１５－０５－０９
基金项目：国家自然科学基金（３１２６０２１３）；新疆维吾尔自治区高校科研计划科学研究重点项目（ＸＪＥＤＵ２０１２Ｉ３０）；新疆维吾尔自治区教育厅重
点实验室开放基金项目（ＸＪＳＤ２０１３ ０６）
作者简介：付建红（１９７０—），女，河南平舆人，博士，副教授，研究方向：特殊环境生物多样性及其代谢产物活性，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｆｊｈ＿７１９＠ １６３．ｃｏｍ
新疆天山花楸黄酮类物质对酪氨酸酶的抑制机制
付建红１，祁　 瑞２，郑　 静２，周晨婕２，陈清西２
（１． 新疆师范大学 生命科学学院，新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 ８３００５４；
２． 厦门大学 生命科学学院，福建 厦门 ３６１００５）
摘　 要：以新疆天山花楸的茎为材料，采用超声波辅助法提取得到天山花楸黄酮类物质。 以 Ｌ 多巴为底物，运用
酶动力学方法研究黄酮类物质对酪氨酸酶的抑制作用。 结果表明：天山花楸黄酮类物质对酪氨酸酶有较强的抑制
作用，导致酪氨酸酶二酚酶活力下降 ５０％所需的提取物浓度（ＩＣ５０）值为 ０􀆰 ２７ ｍｇ ／ ｍＬ。 对酪氨酸酶的抑制显示可逆
的效应，抑制类型为混合型，对游离酶的抑制常数（ＫＩ）和酶 底物配位化合物的抑制常数（ＫＩＳ）分别为 ０􀆰 ２１８ 和
０􀆰 ３１３ ｍｇ ／ ｍＬ。 １，１ 二苯基 ２ 三硝基苯肼自由基（ＤＰＰＨ·）实验显示天山花楸黄酮类物质具有一定的抗氧化作
用，引起 ＤＰＰＨ·活性下降５０％的黄酮类物质浓度（ＩＣ５０）为 ０􀆰 １８ ｍｇ ／ ｍＬ。 本研究为进一步开发利用天山花楸中的果
蔬保鲜及美白成分提供了理论依据。
关键词：天山花楸；黄酮；酪氨酸酶；抑制机理
中图分类号：Ｑ９４６􀆰 ８　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０４－００６３－０５
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｂｙ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｆｒｏｍ
Ｓｏｒｂｕｓ ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ Ｒｕｐｅｒ ｉｎ Ｘｉｎｊｉａｎｇ
ＦＵ Ｊｉａｎｈｏｎｇ１，ＱＩ Ｒｕｉ２，ＺＨＥＮＧ Ｊｉｎｇ２，ＺＨＯＵ Ｃｈｅｎｊｉｅ２，ＣＨＥＮ Ｑｉｎｇｘｉ２
（１． Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，
Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｌｕｍｑｉ ８３００５４，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ ３６１００５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｗｄｅｒ ｏｆ Ｓｏｒｂｕｓ ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ Ｒｕｐｅｒ ｓｔｅｍｓ ｕｎｄｅｒ ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ
ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｖｅ． Ａｄｏｐｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ，ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ Ｌ⁃ＤＯＰＡ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ｓｏｒｂｕｓ
ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ Ｒｕｐｅｒ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ． Ｉｔｓ ＩＣ５０ ｗａｓ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ａｓ ０􀆰 ２７ ｍｇ ／ ｍＬ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｎｄ ｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ
ｍｉｘｅｄ⁃ｔｙｐｅ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｆｒｅｅ ｅｎｚｙｍｅ ＫＩ ａｎｄ ｗｉｔｈ
ｅｎｚｙｍｅ⁃ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ＫＩＳ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ０􀆰 ２１８ ａｎｄ ０􀆰 ３１３ ｍｇ ／ ｍＬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ＤＰＰＨ
（１，１⁃ｄｉｐｈｅｎｙｌ⁃２⁃ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）ｒａｄｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ｓｏｒｂｕｓ ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ
Ｒｕｐｅｒ ｈａｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｅｘｔｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ５０％
ＤＰＰＨ·ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｌｏｓｓ（ ＩＣ５０）ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｏ ｂｅ ０􀆰 １８ ｍｇ ／ ｍＬ． Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ
ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔｓ ａｎｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｗｈｉｔｅｎｉｎｇ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ
Ｓｏｒｂｕｓ ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ Ｒｕｐｅｒ．
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｏｒｂｕｓ ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ Ｒｕｐｅｒ； ｆｌａｖｏｎｏｉｄ； ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ； ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
　 　 酪氨酸酶（ＥＣ１􀆰 １４􀆰 １８􀆰 １，Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）是一种结
构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶［１］，广泛存在于
微生物和动植物中。 它能够催化单酚羟化成二酚
（单酚酶活性），并把二酚氧化成醌（二酚酶活性）；
醌在非酶促条件下形成反应终产物黑色素［２］。 由
于酪氨酸酶既是生物体内黑色素合成的关键酶，又
与昆虫的伤口愈合与发育［３］，果蔬的褐变［４］有密切
关系，所以抑制酪氨酸酶活性是降低产生的黑色素
量、防止褐变的有效途径之一。 筛选高效、安全的
酪氨酸酶抑制剂，对于果蔬保鲜、皮肤美白和生物
杀虫剂的研制都具有重要意义。 国内外对酪氨酸
酶的研究主要集中在酶的分离纯化、催化机制、活
性调控以及酪氨酸酶基因在生物体内的生理作用
等方面，目前其三维结构仍未得到［１］。 对于该酶抑
制剂的研究，国内外很多学者致力于寻找特异的、
高效的酪氨酸酶抑制剂，研究其抑制作用机制及抑
制剂的应用［５］。
黄酮类化合物广泛存在于植物中，尤其是许多
中药材中含量丰富，属于酚类化合物。 研究表明：
黄酮具有多种药理活性，其中包括抗氧化作用、消
炎作用、抗癌和抗基因诱变作用等［６］。 Ｋｕｂｏ等［７］从
天然植物（茴芹、腰果等）中提取了一系列酪氨酸酶
抑制剂，经检测主要为黄酮类天然产物，测定了它
们对蘑菇酪氨酸酶的效应机制。 Ｘｉｅ 等［８］研究了一
系列黄酮类化合物对酪氨酸酶活力的影响，实验结
果表明：栎精、高良姜精、非瑟酮、３，７，４ –三羟基黄
酮和桑色素等黄酮醇都是酪氨酸酶的竞争性抑制
剂。 天山花楸（Ｓｏｒｂｕｓ ｔｉａｎｓｈａｎｉｃａ Ｒｕｐｒｅｒ）为蔷薇科
花楸属的多年生小乔木或灌木，主产新疆。 天山花
楸是传统的民族药用植物，主治肺结核、哮喘、咳
嗽、胃炎、胃痛、维生素 Ａ 和 Ｃ 缺乏症［９］，主要含有
黄酮类、氰苷类、萜类、有机酸、甾体化合物和多种
酶等，其中黄酮类化合物是其主要活性成分［１０］。 目
前尚未见有关天山花楸提取物抑制酪氨酸酶活力
的报道。 笔者采用超声波辅助法提取天山花楸黄
酮类物质。 以天山花楸黄酮类物质作为效应物，研
究其对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的影响及抑制作
用机制，探讨抑制剂和酶分子间结合作用的分子模
型，以期为天山花楸黄酮类物质在食品、医药及化
妆品等领域的开发和应用提供科学依据。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料与试剂
天山花楸的茎枝采自新疆巴里坤天山山脉南
麓；芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所；蘑
菇酪氨酸酶（比活力为 ６ ６８０ Ｕ ／ ｍｇ）、Ｌ 多巴（Ｌ
ＤＯＰＡ）、二甲亚砜（ＤＭＳＯ）均购自 Ｓｉｇｍａ 公司；其他
试剂均为国产分析纯；使用的蒸馏水为去离子重蒸
水，无特别说明，该文中溶液均为去离子重蒸水
配制。
１􀆰 ２　 主要仪器
ＫＱ５２００Ｅ型超声波清洗器，昆山市超声仪器有
限公司；ＳＨＢ Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科
工贸有限公司；ＥＹＥＬＡ 型旋转蒸发仪，上海爱朗仪
器有限公司；ＤＵ８００ 型分光光度计，美国贝克曼库
尔特有限公司；ＤＫＢ ５０１Ａ 型超级恒温水槽，上海
精宏实验设备有限公司；高速粉碎机，姜堰市银河
仪器厂。
１􀆰 ３　 天山花楸黄酮类物质的提取
将天山花楸枝条洗净、低温干燥后粉碎。 称取
天山花楸枝粉末 ６ ｇ，加入 ３００ ｍＬ 体积分数为 ６０％
的乙醇溶液搅拌均匀，置于超声波清洗器中进行超
声波处理，超声波功率为 ２００ Ｗ，超声温度为 ３０ ℃，
超声时间为 １２０ ｍｉｎ；真空抽滤提取物，滤液用旋转
蒸发仪蒸发浓缩，冷冻干燥后得到天山花楸黄酮提
取物。 将提取物用含体积分数为 ５％ＤＭＳＯ 的磷酸
盐缓冲液溶解，制成 １５ ｍｇ ／ ｍＬ 的提取物溶液，再分
别吸取 ０、２５、５０、７５ 和 １００ μＬ 提取物溶液加入到
３􀆰 ０ ｍＬ酪氨酸酶测活体系中，得到质量浓度分别为
０、０􀆰 １２５、０􀆰 ２５、０􀆰 ３７５ 和 ０􀆰 ５ ｍｇ ／ ｍＬ 的天山花楸黄
酮提取物溶液。
１􀆰 ４　 芦丁标准曲线的绘制
标准曲线的测定参照文献［１１］。 精密称取芦
丁标准品 １３􀆰 ２ ｍｇ，用体积分数为 ６０％乙醇溶液溶
解，配制质量浓度为 ０􀆰 ５２８ ｍｇ ／ ｍＬ 的芦丁标准溶
液。 分别准确吸取芦丁标准溶液 ０、０􀆰 ４、０􀆰 ８、１􀆰 ２、
１􀆰 ６和 ２􀆰 ０ ｍＬ置于 １０ ｍＬ容量瓶内，分别加入 ２􀆰 ０、
１􀆰 ６、１􀆰 ２、０􀆰 ８、０􀆰 ４ 和 ０ ｍＬ 体积分数为 ６０％乙醇溶
液；在此体系中依次分别加入质量分数为 ５％ＮａＮＯ２
溶液 ０􀆰 ５ ｍＬ（摇匀静置 ６ ｍｉｎ）、质量分数为 １０％Ａｌ
（ＮＯ３） ３ 溶液 ０􀆰 ５ ｍＬ（放置 ６ ｍｉｎ）和质量分数为 ４％
４６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８
的 ＮａＯＨ溶液 ４􀆰 ０ ｍＬ，最后用体积分数为 ６０％乙醇
溶液定容，摇匀后静置 １５ ｍｉｎ，于 ５１０ ｎｍ 处测定吸
光（Ａ５１０）度。 用体积分数为 ６０％乙醇溶液作空白参
比液，以芦丁质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标
绘制标准曲线。
１􀆰 ５　 对酪氨酸酶二酚酶活力影响的测定
酪氨酸酶二酚酶活力的测定参照文献［１２］。
以 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 Ｌ ＤＯＰＡ 为底物，在 ０􀆰 ０５ ｍｏｌ ／ Ｌ
磷酸盐缓冲液（ｐＨ＝ ６􀆰 ８）的 ３􀆰 ０ ｍＬ酶测活体系中，
先加入 ０􀆰 １ ｍＬ不同质量浓度的提取物溶液于比色
杯中，再加入 ２􀆰 ８ ｍＬ 底物溶液和 ０􀆰 １ ｍＬ 蘑菇酪氨
酸酶溶液，立刻混匀，在 ３０ ℃恒温条件下测定 Ａ４７５
随时间的增长直线，从直线斜率即可求得二酚酶活
力，产物的消光系数（ε）按 ε＝ ３ ７００ Ｌ ／ （ｍｏｌ·ｃｍ）计
算［１３］。 酶活力单位 （ Ｕ）定义为每分钟催化 Ｌ
ＤＯＰＡ氧化产生 １ μｍｏｌ 产物的酶量。 以相对酶活
力对提取物浓度作图，得到提取物的浓度效应曲线。
相对酶活力按下式计算：
相对酶活力（％）＝ Ｖｓ ／ Ｖｃ×１００
式中， Ｖｃ 为对照组 （不含提取物 ） 的酶活力
（ＯＤ４７５·ｍｉｎ－１），Ｖｓ为样品组（含有不同质量浓度的提
取物）的酶活力（ＯＤ４７５·ｍｉｎ－１）。
１􀆰 ６　 对酪氨酸酶二酚酶活力的抑制机制考察
在酶活力测定体系中，固定底物（Ｌ ＤＯＰＡ）浓
度为 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，加入不同质量浓度的天山花楸黄
酮提取物溶液，改变酪氨酸酶的加入量，测定酶活
力与酶质量浓度的关系，进而测定酶促反应速率与
酶质量浓度的关系。 根据酶促反应速度与酶质量
浓度的相关性判断天山花楸黄酮提取物对酪氨酸
酶二酚酶活力的抑制作用机制。
在测活体系中固定酪氨酸酶的质量浓度，加入
不同质量浓度的天山花楸黄酮提取物溶液，改变底
物（Ｌ ＤＯＰＡ）的浓度，测定不同浓度底物下的酶促
反应初速率，初速率是通过吸光度的改变值求得，
即酶反应初速率＝ １ ０００Ａ４７５ ／ ３􀆰 ７。 通过 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ
Ｂｕｒｋ双倒数作图，比较酶催化反应的动力学参数，
包括表观米氏常数（Ｋｍ）和最大反应速率（ｖｍａｘ）的变
化来判断抑制类型，并以直线斜率和纵轴截距对抑
制剂（提取物）浓度二次作图，求得对游离酶的抑制
常数（ＫＩ）和对酶－底物络合物的抑制常数（ＫＩＳ）。
１􀆰 ７　 体外抗氧化活性的测定
采用 １， １ 二苯基 ２ 三硝基苯肼自由基
（ＤＰＰＨ·）法测定天山花楸黄酮提取物清除自由基
的能力［１４］。 在 ３􀆰 ０ ｍＬ 测活体系中，依次加入 １􀆰 ０
ｍＬ ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ 醋酸缓冲液（ｐＨ５􀆰 ５），１􀆰 ８７ ｍＬ 无水
乙醇，０􀆰 １ ｍＬ ３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的 ＤＰＰＨ·（溶于乙醇），最后
加入 ０􀆰 ０３ ｍＬ 终质量浓度为 ０ ～ ０􀆰 ５２５ ｍｇ ／ ｍＬ 的天
山花楸黄酮提取物溶液，立刻混匀，在 ２５ ℃恒温条
件下反应 ２０ ｍｉｎ，测定 ５１７ ｎｍ处的吸光度值。 以加
入 Ｖｃ为对照，计算 ＤＰＰＨ·的相对活性，计算方法参
照文献［１４］。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 天山花楸黄酮的提取工艺
以吸光度（Ａ）为纵坐标，芦丁质量浓度（ρ）为横
坐标绘制标准曲线， 得到线性回归方程 Ａ ＝
１１􀆰 ４２５ρ－０􀆰 ０１７９，相关系数 Ｒ ＝ ０􀆰 ９９９ ９，表明在
０􀆰 ０２～ ０􀆰 １０ ｍｇ ／ ｍＬ 内吸光度和芦丁质量浓度线性
关系良好。
天山花楸黄酮类物质提取的单因素试验主要
考察提取溶剂乙醇的体积分数、超声时间和料液比
对黄酮得率的影响。 在单因素试验的基础上，运用
正交试验设计优化提取工艺，确定超声波辅助法提
取天山花楸黄酮的最佳提取工艺为 ６ ｇ 天山花楸枝
条粉末，加入体积分数为 ６０％的乙醇溶液 ３００ ｍＬ，
搅拌均匀后进行超声波处理，超声波功率为 ２００ Ｗ，
超声温度 ３０ ℃，超声时间 １２０ ｍｉｎ。 最后用体积分
数为 ６０％的乙醇溶解天山花楸黄酮提取物，于 ５１０
ｎｍ下测定吸光值。 根据回归方程得到天山花楸提
取物中黄酮的质量浓度，黄酮得率为 ２􀆰 ７５％。
２􀆰 ２　 对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的影响
以天山花楸黄酮提取物为效应物，研究它对
蘑菇酪氨酸酶活力的影响。 在以 Ｌ ＤＯＰＡ 为底
物的测活体系中，加入不同质量浓度的天山花楸
黄酮提取物（效应物）溶液，以不加效应物为对照，
测定相对酶活力，结果如图 １ 所示。 由图 １ 可知：
天山花楸黄酮提取物的酶活力下降一半所需的抑
制剂的浓度（ ＩＣ５０）为 ０􀆰 ２７ ｍｇ ／ ｍＬ，对蘑菇酪氨酸
酶二酚酶活力有较强的抑制作用，随着效应物质
量浓度的增大，相对酶活力呈指数下降。
２􀆰 ３　 对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用机制的判断
在固定底物（Ｌ ＤＯＰＡ）浓度的测活体系中，加
入不同质量浓度的天山花楸黄酮提取物溶液，改变酶
的加入量，测定经天山花楸黄酮提取物作用后酪氨酸
酶二酚酶活力与加入酶量之间的关系，结果如图 ２所
示。 由图 ２可知：酶活力对酶量作图得到一组通过原
５６　 第 ４期 付建红等：新疆天山花楸黄酮类物质对酪氨酸酶的抑制机制
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图 １　 天山花楸黄酮提取物对酪氨酸酶二酚酶活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｓｏｒｂｕｓ ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ
Ｒｕｐｅｒ ｓｔｅｍｓ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｉｐｈｅｎｏｌａｓｅ ｏｆ
ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ
直线 ０～４代表天山花楸黄酮提取物的质量浓度分别为 ０、０􀆰 ０８３、
０􀆰 １６７、０􀆰 ２５和 ０􀆰 ３３３ ｍｇ ／ ｍＬ
图 ２　 天山花楸黄酮提取物对酪氨酸酶二酚酶活力
的抑制作用机制
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ
ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ｓｏｒｂｕｓ ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ
Ｒｕｐｅｒ ｏｎ ｄｉｐｈｅｎｏｌａｓｅ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ
点的直线。 随着天山花楸黄酮提取物质量浓度的增
大，直线的斜率逐渐下降，说明天山花楸黄酮提取物对
蘑菇酪氨酸酶的抑制作用属于可逆过程。 也就是说天
山花楸黄酮提取物是通过抑制酶活力而导致催化效率
降低，而不是通过减少有效酶量导致酶活力下降。
２􀆰 ４　 对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制类型和抑制常
数的测定
　 　 在酶活力测定体系中，固定酪氨酸酶的质量浓
度，改变底物 Ｌ ＤＯＰＡ 浓度，测定不同浓度底物对
酶促反应速度的影响，以 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ Ｂｕｒｋ 双倒数
作图法来判断抑制机制类型，结果如图 ３ 所示。 由
图 ３可知：随着天山花楸黄酮提取物质量浓度的增
大，直线的斜率和截距也相应增大，Ｋｍ增大而 ｖｍａｘ减
小，表明效应物既影响酶对底物的亲和力也影响酶
的催化作用。 天山花楸黄酮提取物对酪氨酸酶的
抑制类型表现为混合型，说明该提取物既能与游离
酶（Ｅ）结合，也能与酶 底物配位化合物（ＥＳ）结合，
但抑制作用强度不同。 以双倒数直线的斜率（图 ３
（ｂ））和纵轴截距（图 ３（ｃ））对天山花楸黄酮提取物
质量浓度二次作图，均为直线，分别求出天山花楸
黄酮提取物对游离酶的抑制常数 （ＫＩ ）为 ０􀆰 ２１８
ｍｇ ／ ｍＬ和对酶 底物配位化合物的抑制常数（ＫＩＳ）为
０􀆰 ３１３ ｍｇ ／ ｍＬ。 ＫＩ＜ＫＩＳ，说明天山花楸黄酮提取物对
酪氨酸酶游离酶的抑制作用较对酶 底物配位化合
物的抑制作用强，底物对酶被天山花楸黄酮提取物
的抑制有一定的保护作用。
直线 １～５代表天山花楸黄酮提取物的质量浓度分别为 ０、０􀆰 ０８３、０􀆰 １６７、０􀆰 ２５和 ０􀆰 ３３３ ｍｇ ／ ｍＬ
图 ３　 天山花楸黄酮提取物对酪氨酸酶二酚酶的抑制类型和抑制常数的测定
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｄｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ｓｏｒｂｕｓ
ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ Ｒｕｐｅｒ ｏｎ ｄｉｐｈｅｎｏｌａｓｅ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ
２􀆰 ５　 天山花楸黄酮提取物的体外抗氧化活性
采用 ＤＰＰＨ·法研究天山花楸黄酮提取物清除
自由基的活性。在 ＤＰＰＨ·活性的测定体系中，加入
不同质量浓度的天山花楸黄酮提取物溶液，以不加
６６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
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提取物为对照，测定 ＤＰＰＨ·的相对活性，实验结果
见图 ４。 由图 ４可知：导致 ＤＰＰＨ·活性下降一半的
天山花楸黄酮提取物的质量浓度 （ ＩＣ５０ ）为 ０􀆰 １８
ｍｇ ／ ｍＬ，同时测定了阳性对照 Ｖｃ的 ＩＣ５０为 ０􀆰 ０２１
ｍｇ ／ ｍＬ（图 ５），可见天山花楸黄酮提取物具有一定
的清除 ＤＰＰＨ·的能力。
图 ４　 天山花楸黄酮提取物的抗氧化活性
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ｓｏｒｂｕｓ ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ
Ｒｕｐｅｒ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ
图 ５　 Ｖｃ的抗氧化活性
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ
３　 结论
１）以天山花楸枝条为原料，结合超声波辅助乙
醇方法对天山花楸中的黄酮进行提取，将加入到体
积分数为 ６０％乙醇溶液的天山花楸枝条粉末，搅拌
均匀后进行超声波处理，在超声波功率 ２００ Ｗ，超声
温度 ３０ ℃，超声时间 １２０ ｍｉｎ的工艺条件下黄酮得
率最高。
２）天山花楸黄酮提取物对蘑菇酪氨酸酶有较
强的抑制活性，导致酪氨酸酶二酚酶活力下降 ５０％
所需的提取物浓度（ ＩＣ５０）为 ０􀆰 ２７ ｍｇ ／ ｍＬ。 酶的抑
制动力学研究表明，天山花楸黄酮提取物对酪氨酸
酶二酚酶表现为混合型可逆抑制，即该提取物既通
过与底物Ｌ ＤＯＰＡ竞争蘑菇酪氨酸酶的活性中心
来抑制酶活性，又通过反应产生酶 底物 抑制剂三
元配位化合物（ＥＩＳ）而产生抑制作用。 ＤＰＰＨ·实验
显示天山花楸黄酮提取物具有一定的抗氧化活性，
其对酶的抑制作用机制可能与其抗氧化活性作用
机制相关。
天山花楸作为新疆丰富且尚未充分利用的资
源，若能妥善加以利用，研制新型的酪氨酸酶抑制
剂，则能扩大资源的利用范围，具有较高的实际应
用价值。
参考文献：
［ １ ］ 　 陈清西，宋康康．酪氨酸酶的研究进展［ Ｊ］ ．厦门大学学报：自
然科学版，２００６，４５（４）：７３１⁃７３７．
［ ２ ］ 　 Ｏｓｖａｌｄｏ Ｚ， Ａｎｔｏｎｅｌｌａ Ｂ， Ｐａｔｒｉｚｉａ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒｕｆｆｌｅ⁃ｔｈｉｏ⁃ｆｌａｖｏｕｒｓ
ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｒｕｆｆｌｅ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ［ Ｊ］ ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，
２００３ （２２０）： ８１⁃８８．
［ ３ ］ 　 Ｓáｎｃｈｅｚ Ｆｅｒｒｅｒ Ａ，Ｒｏｄｒíｇｕｅｚ Ｌóｐｅｚ Ｊ Ｎ，Ｇａｒｃíａ Ｃáｎｏｖａｓ Ｆ，ｅｔ ａｌ．
Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ： ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ［ Ｊ ］ ．
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９５，１２４７（１）：１⁃１１．
［ ４ ］ 　 Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｍ Ｖ，Ｗｈｉｔａｋｅｒ Ｊ Ｒ． Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｂｒｏｗｎｉｎｇ［Ｊ］ ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
１９９５，６（６）：１９５⁃２００．
［ ５ ］ 　 陈清西，林建峰，宋康康．酪氨酸酶抑制剂的研究进展［ Ｊ］ ．厦
门大学学报：自然科学版，２００７，４６（２）：２７４⁃２８２．
［ ６ ］ 　 李楠，刘元，候滨滨．黄酮类化合物的功能特性［ Ｊ］ ．食品研究
与开发，２００５，２６（６）：１３９⁃１４１．
［ ７ ］ 　 Ｋｕｂｏ Ｉ，Ｋｉｎｓｔ Ｈｏｒｉ Ｉ，Ｉｓｉｇｕｒｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｆｌａｖｏｎｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｈ． ｉｎｕｌｏｉｄｅｓ．
ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｒｉｔｅｒｉａ ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｏｒｇ
Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０００，８：１５８５⁃１５９１．
［ ８ ］ 　 Ｘｉｅ Ｌ Ｐ，Ｃｈｅｎ Ｑ Ｘ，Ｈｕａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｍｅ
ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｔｙｒ ｏｓｉｎａｓｅ ［ Ｊ ］ ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｍｏｓｃｏｗ） ，２００３，６８（４）：４８７⁃４９１．
［ ９ ］ 　 李迪民，陈坚．天山花楸水提取液药理学研究［ Ｊ］ ．中草药，
１９９６，２６（６）：３０２．
［１０］ 　 于明，李铣．花楸属植物化学成分和药理作用及其研究进展
［Ｊ］ ．辽宁中医学院学报，２００４，６（５）：３６４⁃３６６．
［１１］ 　 李容，张婧萱，廖保宁，等．超声波提取少花龙葵总黄酮及鉴
别方法［Ｊ］ ．中国处方药，２０１２，１０（２）：４６⁃４８．
［１２］ 　 Ｃｈｅｎ Ｑ Ｘ， Ｓｏｎｇ Ｋ Ｋ， Ｗａｎｇ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｂｙ ｓｏｍｅ ａｌｋｙｌｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅｓ［ Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００３， １８ （ ６ ）：
４９１⁃４９６．
［１３］ 　 黄璜，刘晓丹，陈清西．苯甲醛族化合物对蘑菇酪氨酸酶抑制
作用的研究［ Ｊ］ ．厦门大学学报：自然科学版，２００３，４２（１）：
９８⁃１０１．
［１４］ 　 Ｋｈａｔｉｂ Ｓ， Ｎｅｒｙａ Ｏ， Ｍｕｓａ Ｒ． Ｃｈａｌｃｏｎｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ａ ２，４⁃ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ ｍｏｉｅｔｙ
［Ｊ］ ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，１３（２）：４３３⁃４４１．
（责任编辑　 周晓薇）
７６　 第 ４期 付建红等：新疆天山花楸黄酮类物质对酪氨酸酶的抑制机制
＼ ＼ＤＺ１９ ＼Ｄ ＼孙桂云 ＼生物加工 ２０１５ ＼第 ４期 ＼第 ４期．ＰＳ　 ４校样　 排版：孙桂云　 修改日期：２０１５ ／ ０７ ／ ０８