全 文 ：Mar．2008
· 38·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第2期
2008年3月
宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在
不同毕赤酵母中的分泌表达
周晨妍1，邬敏辰2，李东峰1，王瑾1，王 武1
(1．江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122；
2．江南大学 医药学院，无锡214122)
摘要：将宇佐美曲霉E001的内切一l，4一木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，得到重组质粒pPXY．
NII，将其经Sa／I线性化后分别转化2株毕赤酵母GSll5和KM71，xynⅡ基因通过同源重组被整合到毕赤酵母染色
体上，并处于酵母Ct因子的下游，经筛选获得阳性重组茵PXGL98(Mut+)和PXKL29(Mut‘)。该木聚糖酶基因在2
株毕赤酵母中均实现了分泌表达。同时对工程茵的发酵条件进行了优化，在甲醇诱导下，PXGL98与PXKL29培养
物上清液中的酶活力分另q可达1156．92U／mL和1646．03U／mL。
关键词：宇佐美曲霉，内切一l，4一木聚糖酶基因，毕赤酵母，分泌表达
中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)02—0038—05
SecretedexpressionofAspergillususamii
Pichiapastoris
xylanasegeneindifferent
ZHOUChen．yanl，WUMin．chenl’。，LIDong—fen91，WANGJinl，WANGWul
(1．TheK yLaboratoryofIndustrialBioteehnologyoftheMinistryofEducation，JiangnanUn versity，Wuxi214122，China；
2．SchoolfMedicine，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：Theendo-1，4-xylanasegenefromAspergillususamiiE001wasclonedintothePichiapastoris
expressionvectol；，pPIC9K，therecombinantpl smidwasnamedpPXYNII．Therecombinantpl smid
pPXYNllwaslinearizedwithSalIandthentransformedintoPichiapastorisGSl15andKM71．respec．
tively．ThexynIIgenewasinframeintegratedintothePichiagenomethroughhomologousrecombination．
TherecombinantPichiapastorisGSll5(PXGL98)andKM71(PXKL29)secretedfunctionalendo一1，4一
xylanase，andthe zymaticctivitiesreached1 156．92U／mLand1 646．03U／mL，respectively．
Keywords：Aspergillususamii；endo-1，4一xylanasegene；Pichiapastoris；secrectedxpression
植物纤维是自然界中最主要的可再生有机资
源，在世界能源日益短缺的情况下，这些能源正越
来越受到重视。植物纤维的主要成分是纤维素、半
纤维素和木质素，其中半纤维素约占植物干质量的
35％，是自然界中仅次于纤维素含量的第二丰富可
再生资源。木聚糖是一种结构较复杂的不均一聚
糖，为半纤维素的重要成分。木聚糖酶(xylanases)
是一类水解木聚糖主链内部卢一1，4木糖苷键的酶，
收稿日期：200／4)7-16
基金项目：国家863资助项目(2006AAl02305)
作者简介：周晨妍(1979一)。女，河南省焦作人，博士研究生。研究方向：基因工程。
联系人：王武，女，教授，博士生导师，E—mail：wangwu@sytu．edu．ca
万方数据
2008年3月周晨妍等：宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynlI在不同毕赤酵母中的分泌表达 ·39·
多数作用于木聚糖的无侧枝区段，产生低聚糖或带
有侧枝的寡聚糖，按氨基酸序列同源性分类，大多
数木聚糖酶属第F／10、G／1l族糖基水解酶[1-2]。
木聚糖酶在造纸、食品、饲料、纺织等工业中起着非
常重要的作用，研究他具有很好的商业价值和科学
意义。不同来源的木聚糖酶，其氨基酸序列、空间
结构、相对分子质量、等电点以及底物特异性各不
相同，因而有必要对编码各种木聚糖酶的基因进行
克隆和表达，以满足工业应用的需求"J。目前从不
同来源的微生物中分离了上百种木聚糖酶，并对其
编码基因进行了克隆和表达HJ。
宇佐美曲霉(Aspergillususamii)E001是本研究
室保藏的1株高产木聚糖酶菌株，已从其固态发酵
曲中分离纯化了2种木聚糖酶XynI和XynII【5J。
作者在克隆了木聚糖酶基因xynII(Genbank登录号
为DQl14485)的基础上‘6l，首次将该基因成功地在
2株毕赤酵母KM71和GSll5中实现了分泌表达，
并进行了表达条件的优化。
1材料与方法
1．1 酶、培养基和主要试剂
限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合
酶、4种dNTP、SDS—PAGE低相对分子质量Marker均
购自Tal(aRa公司；燕麦木聚糖购自Signm公司；G418
和YNB购自上海生工生物公司；其他试剂均为进口
或国产分析纯产品；YPD、MM、MD、BMGY、BMMY培
养基见Invitrogen公司的毕赤酵母操作手册。
1．2菌株与质粒
供试菌株和质粒见表l。
表1供试菌株和质粒
Table1 Strainsa dplasmids
1．3重组酵母表达载体的构建和鉴定
以重组质粒pEXYNlI为模板，根据木聚糖酶基
因xynlI(Genbank登录号为DQll4485)序列，设计
合成引物，进行PCR扩增反应。
JN：5’一CGGAATI℃AGTGCCG(汀ATCAACTATG-
3’(含EcoRI酶切位点)
JZ：5’．ATITGCGGCCGC7兀AAGAAGATATCGT．
GAC-3’(含NotI酶切位点)
94℃2min；94℃30s。55℃30s，72℃45s：
30个循环；72℃10rain。
凝胶电泳回收目的条带，用EcoRI和Not1分
别双酶切上述DNA和pPIC9K质粒，凝胶电泳回收
目的条带，按照分子克隆手册r刊进行表达片段的连
接、转化和阳性克隆的筛选。抽提重组质粒DNA，
进行电泳检测、酶切鉴定和测序分析。
1．4酵母的电击转化
将测序正确的重组载体，SalI线性化后，参照
Eppendoff电转化手册(www．ependoff．corn)进行电
转化(电转仪，Eppendoff公司)GSll5和KM71，
pPIC9K作为对照。电转条件：1500V， ms。取200
斗L转化液涂MD平板，30℃培养2—3d，筛选得到
His+克隆，保存转化子。
万方数据
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1．5转化子的鉴定与筛选
将获得的His+转化子分别在含G4180．25，
0．5，1．0，1．5，2．0，3．0，4．0mg／mL的YPD平板上，
30℃培养3—5d，以筛选多拷贝的阳性转化子。挑
取所有抗4．0mg／mLG418的菌落，用MM和MD平
板筛选His+Mut+与His+Mut。表型。
1．6工程菌株发酵条件的优化
(1)种龄对重组菌产酶的影响菌种接入摇瓶后
分别培养14，18，22，26h，转入甲醇诱导阶段，每隔
24h，补加甲醇至终体积分数为0．5％，培养72h，
测发酵液酶活力。
(2)装液量对重组菌产酶的影响将生长培养基
的菌体离心后接入250mL三角瓶中装液量分别为
15，25，35，45mL的BMMY内，每隔24h，补加甲醇
至终体积分数为0．5％，培养72h，测发酵液酶活
力，考察装液量对重组菌产酶的影响。
(3)甲醇诱导量对重组菌产酶的影响将生长培
养基的菌体离心后等量接人最佳装液量并含有甲
醇体积分数分别为0．5％，1．0％，1．5％，2．0％，
2．5％的诱导培养基中进行培养，每24h补加甲醇
至预定值，培养72h。收获发酵液检测酶活性。
(4)诱导时间对木聚糖酶表达的影响：将生长
培养基的菌体离心后接入诱导培养基，诱导192h，
每24h取样0．5mL并补加甲醇。发酵液按上述方
法进行测定。
1．7重组毕赤酵母表达产物的分析
1．7．1细胞光密度(叩鳓)
菌液稀释后于波长600nm以去离子水为对照
进行比色测定∞锄=读数×稀释倍数。
1．7．2木聚糖酶酶活力测定及酶活力单位定义
采用改进的DNS法哺]，在2．4mL质量分数
0．5％的木聚糖中加入0．1mL适当稀释的酶液，
50℃下反应15min，加入2．5mLDNS终止反应，沸
水中显色7min，定容后测定∞铷。
酶活力单位(U)的定义：在该反应条件下，以每
分钟产生1lLLmol还原糖所需的酶量定义为1个
单位。
1．7．3SDS—PAGE
采用5％浓缩胶、15％分离胶。样品制备：阳
性转化株用甲醇诱导，发酵结束后取少量菌液，按
1：l体积比加入样品裂解液，沸水浴处理5min，取
20p．L，进行SDS—PAGE电泳，分析重组蛋白的表达
情况。
2结果与讨论
2．1 宇佐美曲霉木聚糖酶基因重组表达载体的构
建及鉴定
构建含有木聚糖酶xynU基因的重组表达载体
pPXYNII(图1)。重组质粒经EcoRI和NotI双酶
切鉴定和PCR检测(图2)，均得到约600bp的产
物，表明pPXYNII构建成功。经上海生工生物技术
有限公司测序证明，xynII基因序列嵌入到表达载体
pPIC9K的5
7AOXl和37AOXl间，并保持了在
AOXl控制下的正确读码框。
I
oxl03")
I
图1重组质粒pPXYNII的构建图
Fig．1Physicalm pofrecombinantpl smidpPXYNII
1一PCRproduct；2一pPXYNIL／EcDRI+NotI；M—DNAMarker
图2重组表达载体pPXYNII的鉴定
Fig．2Identificationofrecombinantpl smidpPXYNII
万方数据
2008年3月周晨妍等：宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynII在不同毕赤酵母中的分泌表达 ·41·
2．2酵母的电击转化与筛选
用10IxgSalI线性化的DNA电转化受体菌
GSll5和KM71后，在MD平板上筛选得到His+转
化子，然后分别点种于含不同质量浓度的G418的
YPD平板中。对4．0mg／mLG418平板上的转化子
进行Mut表型筛选，对得到的Mut+和Mut。菌株，进
一步经过诱导培养和酶活性测定，筛选得到两株高
产工程菌株PXGL98(Mut+)和PXKL29(Mut8)。
2．3重组表达菌株的诱导表达
2．3．1 重组酵母菌生长密度的测定
在重组酵母菌培养8h后，每4h取样测DD600，
见图3。从图3可以看出，重组酵母菌在接种后12
—26h中的生长最旺盛，为对数生长期。
700
600
C500
；400
晕300
翅
档200
loo
O
14 18
图4重组菌种龄对产酶的影响
Fig．4EffectofgrowthtimeonthexpressionofXynlI
700
600
p500
一
?400
薹300
滥200
100
O
装液量，mL
图5装液量对产酶的影响
图3重组酵母的生长曲线 Fig．5EffectofmediumvolumeonXynIIexpression
Fig．3GrowthcurvesofrecombinantPichiapastoris
2．3．2种龄对重组菌产酶的影响
在一定时间范围内，生长时间延长，菌体量增加，
表达量也相应增加但时间延长，菌体老化，又不利于
外源蛋白的表达。通常接种龄以菌丝处于生命力极
为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到高
峰时，较为合适。针对毕赤酵母的对数生长期，分别
将不同种龄的种子接入BMMY中进行诱导表达。结
果(图4)显示：工程菌PXGL98和PXKL29分别在生
长26，22h时诱导产酶，酶活力最高。
2．3．3装液量对重组菌表达XynII的影响
由图5可见，在250mL的三角瓶中，装液量分
别在35mL和15mL时，PXGL98和PXKL29的木聚
糖酶表达水平最高。
2．3．4甲醇诱导量对重组菌表达XynII的影响
将诱导培养基内甲醇含量分别调至不同浓度，
诱导培养72h，测定酶活力(图6)。结果表明：甲醇
体积分数为1．5％，2．0％分别最有利于PXGL98、
PXKL29表达xynlI。
，
龟
●
量
妲
箍
图6甲醇浓度对产酶的影响
Fig．6EffectofmethanolconcentrationonXynlIexpression
．3．5诱导时间对重组菌表达XynII的影响
PXGL98和PXKL29种子液接入培养基，30℃，
225r／min分别培养26h、22h。进入甲醇诱导阶段
后，于不同时间取发酵上清进行酶活力的测定，测
得PXGL98和PXKL29两类重组酵母分别在诱导96
h和144h时酶活力最高。用空载体转化的宿主菌
作对照，其发酵上清均未检测到酶活力。
万方数据
·42· 生物加工过程 第6卷第2期
1 800
l500
龟1200
已900
馨600
300
0 24 48 72 96 120144168192
t／h
图7诱导时间对产酶的影响
Fig．7EffectofinductiondurationOilxylanaseactivity
工程菌PXGL98和PXKL29在以上优选的摇瓶
发酵条件下表达的XynII，最高酶活力分别为
1 156．92U／mL和1646．03U／mL。
2．4 SDS—PAGE检测
将工程菌进行甲醇诱导表达，通过SDS-PAGE
检测，将含有空质粒的酵母转化子作为阴性对照，
从图8可见两个阳性重组菌在2．3×104处均有一
明显蛋白条带，而阴性对照相应的位置无蛋白条
带，说明重组菌在甲醇诱导下均产生了XynII。
1，2一KM『7l、GSl15；M--M¨ker；3，4--PXKL29、PXGL98
图8重组酵母上清的SDS．PAGE
Fig．8SDS·PAGEofsupematantaftermethanolinduction
3结论与展望
毕赤酵母表达系统是近年来发展很快的一个真
核表达系统，非常适合真核蛋白的表达，表现在其很
强的真核蛋白质修饰功能上，他不存在原核表达系统
中重组蛋白质正确折叠和糖基化等后处理问题。
KM71和Gsll5为甲醇酵母表达系统常用的宿主菌。
不同的宿主菌，构建的重组菌表型不一样，KMTl本身
为AOXl缺陷型，重组菌表型均为Mut。。GSIl5作为
宿主菌，在His4DNA片段的单酶切位点将表达质粒
酶切线性化，通过单交换整合进染色体，AOXI未被
破坏，转化子表型绝大多数呈Mut+。
首次在巴斯德毕赤酵母系统中表达了宇佐美
曲霉xynⅡ基因，通过对重组酵母菌进行筛选，获得
了高拷贝整合的不同表型的重组菌株，并对其表达
外源基因的摇瓶发酵条件进行了研究，增加了基因
的表达水平。PXGL98(Mut+)和PXKL29(Mut5)摇
瓶培养酶活力最高分别可达l156．92U／mL和
1646．03U／mL。与Luttig等一3报道的在酿酒酵母
中表达的来源于Aspergillusniger的木聚糖酶
(XYN4)(最高表达量为73U／m1)以及DengPing
等¨叫报道的在毕赤酵母中表达的来源于Aspergillus
nigerCGMCC1067的木聚糖酶(XYNB)(最高表达
量为62U／mL)比较，作者克隆的木聚糖酶基因在毕
赤酵母中表达量提高了20倍左右。另外，0【一因子信
号肽使表达的重组蛋白分泌到胞外，且毕赤酵母自
身分泌的蛋白种类比较少，使得纯化更为简便，为
其进一步工业应用奠定了基础。
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