全 文 ：利用赭曲霉 !"!"#$羟基化齐墩果酸的研究 王晋宇，欧阳嘉，沈珈琦，范伟平! （南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 #$%%%&）
摘 要：考察了利用赭曲霉 !"#$%&’(()" *+,%-+$)" !"$#%’ 进行 ($$!)羟基化齐墩果酸生化反应的条件。得出了菌株摇 瓶培养最佳培养基配方（*·+ ,$）：葡萄糖 #%，玉米浆 #-，酵母膏 ’，.#/012 $3-，4/ 5 3%。菌株培养 #% 6，加入 # 7*·+ ,$
的齐墩果酸利于诱导羟基化酶的产生。菌株在 #8 9下以 $-% :·7;< ,$振荡培养 #2 6，加入底物的乙醇溶液，使转化
液中齐墩果酸的初始质量浓度达 $%% 7*·+ ,$，转化液中乙醇体积分数最终达 ’=。经 &5 6转化，齐墩果酸转化率可
达到 $% >$#=。通过 /0+(、$/ !?@和$’( !?@分析，结果表明产物为 ($$!)羟基齐墩果酸。
关键词：齐墩果酸；羟基化反应；赭曲霉 !"$#%’
中图分类号：A&’ 3&B 文献标识码：C 文章编号：$5B# , ’5B8（#%%5）%2 , %%-$ , %-
%&’()*&+,-.)/ )0 )+1,/)+.2 ,2.’ 3& 4&’()*&+,51 0()6 !"#$%&’(()" *+,%-+$)" 78$#%’
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（(PQQO*O PR +;RO KS;935-(,2-：?;S:PZ;JQ U:J#$%&’(()" *+,%-+$)" !"$#%’ > Y6O P4U;7G7 SGQUG:O 7OT;G7 SP#- 3%，FOJXU O[U:JSU ’ 3%，.#/012 $3- 7*·+ ,$ PR XGZXU:JUO \JX JTTOT UP U6O SGQUG:O JRUO: #% 6 SPGQT ;6FT:P[FQJXO XOS:OU;P< > CRUO: U6O XU:J;< ;: 3 7;< , $RP: #2 6，$%% 7*·+ , $ PQOJ Y6O JMGOPGX 7OT;G7 ;O Y6O Z;PU:J*+,%-+$)" !"$#%’ SOQQX > Y6O 4G:;R;OT 4:PTGSU \JX ;TO!?@，J:1& ;)(’5：PQOJ齐墩果酸（1QOJ天然产物，有消炎、降脂、抗艾滋病毒等多方面药理
作用［$)#］，但齐墩果酸的高憎水性，使之生物利用度 低，有人对齐墩果酸的 ’)位羟基和 #8)位羧基［’)B］进 行化学修饰以提高其水溶性和增强其药效，也有对 其 C环和 (环进行了部分改造［8)$%］。这些报道中齐
墩果酸化学衍生物的药理活性都比齐墩果酸本身高
出许多。因此对萜类化合物的结构进行改造修饰吸
引了研究者的兴趣，其中通过氧化还原反应在分子
结构中引入羟基是关键步骤。萜类多环化合物采用
化学手段实施定位羟基化十分困难，微生物催化羟
基化日渐显示出其优越性和重要作用。近年来微生
物催化萜类化合物羟基化反应的研究成果报道，主
要集中在对单萜、倍半萜、二萜类化合物的羟基
化［ $$］，而对三萜和四萜类化合物的研究还未见报 ! 收稿日期：#%%5)%&)$% 作者简介：王晋宇（$&8#)），男，江苏苏州人，硕士，研究方向：生物合成药物。 联系人：范伟平，教授，L)7J;Q：R\4^6G_ XP6G > SP7 第 2 卷第 2 期 #%%5 年$$ 月
生 物 加 工 过 程
(6;!PW > #%%5
·-$· 万方数据 道。 本文利用赭曲霉 !"#$%&’(()" *+,%-+$)" !"#$%&，在
常温常压温和条件下进行了齐墩果酸定位羟基化，
以获得 ’## (羟基齐墩果酸，提高其生物活性。
! 材料与方法
# )# 菌种和培养条件
赭曲霉 !"#$%&’(()" *+,%-+$)" !"%$#* 为南京工业 大学生物工程中心实验室保藏。培养基组成为（+· , ( #）：葡萄糖 #-，玉米浆$%，酵母膏 $，.$/01- #，自
来水配制，2/调至 * )%。将保存于土豆汁琼脂斜面
的霉菌用无菌水洗下其孢子，配成 #%3个 4 5, 的孢子
悬浮液。按 #%6的接种量接入种子培养基（#%% 5,
培养基 4 7%% 5,摇瓶），在 $3 8，#7% 9·5:; ( #振荡培 养$- <。培养后期，添加适量的底物可以诱导产酶。
# )$生物转化 菌体培养$- < 后，加入用乙醇配制的无菌齐墩
果酸溶液（#% +·, ( #），使转化液中齐墩果酸的初始
质量浓度达到 #%% 5+·, ( #。转化反应 =* < 后，用
/0,’测定转化液中底物和产物的含量。
# )& 产品分离纯化
酶转化结束后，过滤菌丝体，滤液进一步离心分
离固形物，合并菌丝体和离心得到的固形物，以发酵
液体积相当的乙酸乙酯常温提萃以上合并固形物 &
次，合并萃取液，减压蒸发除去溶剂，所得粗品再经
硅胶柱 .（石油醚）> .（乙酸乙酯）? & > # 分离，制备
液相色谱进一步分离得到齐墩果酸羟基化的纯品。
# )- 检测方法
@0A$%%% /0,’ 仪，,:B<9CD2温，流动相为（ .（乙腈）> .（水）? *7 > &7）&% 5:; 内梯
度至（ .（乙腈）> .（水）? =7 > 7），流量为 # 5,·5:; ( #，
检测波长为 $#7 ;5。产物纯品以#/ !FG和#&’ !FG 经 HGI’.JG @K-%% 型核磁共振仪进行分子结构表 征，以 LFM 内标，样品溶解在 ’N’O&中，# / !FG 在 &%% F/P下测定，#&’ !FG 在 #%% F/P下测定。 " 结果与讨论$ )# 碳源对齐墩果酸生物转化的影响
在“# )#”的培养基组分基础上，分别以 #- +·, ( #
的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、!Q环糊精和可溶性淀
粉作为碳源培养细胞产酶进行生物转化实验，如图
# 所示。
图 # 不同碳源对齐墩果酸转化的影响
R:+ )# JSSEBT CS BU9VC; DCW9BE C; V:CT9U;DSC95UT:C; CS COEU;CO:B UB:X
由图 # 可知，赭曲霉 !"#$%&’(()" *+,%-+$)" !"#$%& 利用以上碳源转化底物时，转化率由高到低依次为 葡萄糖、蔗糖、!Q环糊精、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉。 可见葡萄糖是最有利于该菌株催化转化齐墩果酸的 碳源。其原因可能是葡萄糖不仅是微生物最容易利 用的碳源，而且还可以通过葡萄糖代谢提供酶催化 羟基化所需要的 !@N0/，从而促进底物的转化。 进一步考察葡萄糖初始浓度对转化影响的结果 如图$。从图 $中可以看出，葡萄糖质量浓度为$% +
·, ( #时，齐墩果酸的转化率最高；当葡萄糖浓度继
续增高时，转化率反而下降。
图 $葡萄糖浓度对齐墩果酸转化的影响 R:+ )$ JSSEBT CS +OWBCDE BC;BE;T9UT:C; C;
V:CT9U;DSC95UT:C; CS COEU;CO:B UB:X
$)$ 氮源对齐墩果酸生物转化的影响
“$)#”培养基中葡萄糖浓度提高为$% +·, ( #，考
察质量浓度均为 $% +·, ( #蛋白胨、玉米浆、牛肉膏、 黄豆粉进行转化实验，结果见图 &，氮源为玉米浆时 齐墩果酸转化率最高。其原因可能是由于玉米浆不 仅可作为氮源，同时还含有大量维生素及微量元素， 可为微生物生长代谢提供必需的生长因子。 ·7$· 生物加工过程 第 - 卷第 - 期
万方数据
图 ! 不同氮源对齐墩果酸转化的影响
"#$%! &’’()* +’ ,#*-+$(, .+/-)( +, 0#+*-1,.’+-21*#+,
+’ +3(1,+3#) 1)#4
在保持其他组分不变的条件下，考察不同玉米
浆浓度对齐墩果酸转化的影响，结果如图 5 所示。
图 5 玉米浆浓度对齐墩果酸转化的影响
"#$%5 &’’()* +’ )+-, .*((6 3#7/+- )+,)(,*-1*#+, +, 0#+*-1,.’+-21*#+, +’ +3(1,+3#) 1)#4 由图 5 可以看出，当玉米浆低于 89$·: ; <之前，
随着玉米浆的质量浓度增加，齐墩果酸转化率不断
提高，当玉米浆达到 89 $·: ; <时，齐墩果酸的转化率 可以达到 = %<<>。因此以后实验玉米浆的质量浓 度维持在 89$·: ; <。
8 %! 酵母膏质量浓度对齐墩果酸生物转化的影响
酵母膏对菌株产酶和生物转化过程中起了重要
的作用，即使“8 %<”培养基中葡萄糖质量浓度提高到
8? $·: ; <，玉米浆质量浓度提高到 89$·: ; <，如果培
养基中无酵母膏，转化率很低，只有 8 %@5>，如图 9
所示。当酵母膏质量浓度提高到 ! $·: ; <时，转化率 有较明显的提高。 8 %5 A8BCD5质量浓度对齐墩果酸生物转化的影响 磷是机体必需元素之一，也是辅酶 EFGCB的组 成成分，因此也是生物转化的重要影响因素。在以 上优化培养基上，改变 A8 BCD5的添加量：?，? %9， < %?，< %9，8 %?，8 %9$·: ; <的 A8BCD5，考察了 A8BCD5对
齐墩果酸转化的影响，如图 H 所示。
图 9 酵母膏浓度对齐墩果酸转化的影响
"#$%9 &’’()* +’ I(1.* (J*-1)* )+,)(,*-1*#+, +, 0#+*-1,.’+-21*#+, +’ +3(1,+3#) 1)#4 图 H 不同质量浓度 A8BCD5对齐墩果酸转化的影响 "#$ %H &’’()* +’ A8BCD5 )+,)(,*-1*#+, +,
0#+*-1,.’+-21*#+, +’ +3(1,+3#) 1)#4
由图 H 可知，适当浓度的磷酸盐加入对转化反
应有一定的促进作用。根据以上实验结果，确定最
适培养基组成，当葡萄糖 8? $·: ; <，玉米浆 89$·
: ; <，酵母膏 ! $·: ; <，A8BCD5 < %9$·: ; <，6B H %? 时，
齐墩果酸的转化率达到 @ %?9>。
8 %9 乙醇浓度对齐墩果酸生物转化的影响
由于底物齐墩果酸水溶性很差，在转化液中添
加适当的乙醇可以提高其在反应液中的浓度，促进
转化进行。实验首先考察菌体对乙醇浓度的耐受情
况。将赭曲霉 EK<8?! 孢子悬浮液以体积分数
的接种量接入 基中，培养 85 L 后称量菌丝体干重作比较。
实验结果见图 =，随着乙醇体积分数的增加，菌
丝体生长受到抑制，在乙醇体积分数为 5>时，生长
已明显受到抑制，在乙醇体积分数为 H> M 时，
8??H 年 << 月 王晋宇等：利用赭曲霉 EK<8?! 羟基化齐墩果酸的研究 ·9!·
万方数据
菌体生长几乎处于停滞状态。考察乙醇体积分数为
!"以下时，对齐墩果酸的转化影响如图 # 所示。乙
醇体积分数由 $"增至 %"，齐墩果酸的转化率增加 到 & ’()"，为最高；可见适量的乙醇提高了底物的 分散程度，改善了反应体系传质效果。但过多的乙 醇则抑制了细胞产酶，羟基化转化率明显降低。因 此以后实验乙醇的体积分数控制在 %"。 图 * 乙醇体积分数对菌体生长的影响 +,- ’* .//012 3/ 0245637 1361062852,36 36 9,183:,57 -83;24 图 # 乙醇体积分数对 <==!>羟基化的影响 +,- ’# .//012 3/ 0245637 1361062852,36 36 <==!>4?@83A?752,36$ ’( 底物诱导齐墩果酸生物转化的影响
!"#$%&’(()" *+,%-+$)" BCD$=( 的羟基化酶，属一种 底物诱导酶，本实验室在用它催化坎利酮 <==!>羟基 化反应的实验中得到证明［=$］。因此在本研究中，仍
以适当时间添加底物齐墩果酸的方式诱导 <==!>羟
基化酶的表达，提高羟基化齐墩果酸的转化率，结果
如图 &。
从图 & 可知，菌株培养 $D 4，添加诱导剂在转化 体系中达到$ 9-·E F =时，齐墩果酸的转化率相对最
高，达到了 =D ’=$"。但诱导剂添加时间推迟到$$4后对转化的促进作用减弱。$ ’* 产物分子结构表征
将 !"#$%&’(()" *+,%-+$)" BC=$D% 催化转化得到的
生物转化产物分离纯化后，对所获得的转化产物分
析鉴定，齐墩果酸及其衍生产物 = GBHI 和 =% 谱结果如表 = 所示。
图 & 诱导作用对齐墩果酸转化的影响
+,- ’& .//012 3/ ,6@J12,36 36 2856K/38952,36 3/ 3705637,1 51,@
表 = 齐墩果酸及其衍生物的核磁共振数据
L5:70 = =GBHI 56@ =%51,@ 56@ ,2K @08,M52,M0
序号
齐墩果酸 <
（"<）
相关的 G
（"G）
衍生产物 <
（"<）
相关的 G
（"G）
= %# ’) $’D$，= ’=( %# ’# $’D=，= ’=*$ $* ’= = ’%)，= ’&&$* ’! = ’%%，= ’&&
% *& ’D % ’ $$*& ’) % ’$) ) %# ’* F %& ’= F ! !! ’$ = ’$! !! ’( = ’$) ( =# ’% = ’!(，= ’&! =# ’* = ’!(，= ’&) * %% ’D = ’%D，= ’&D %% ’! = ’$#，= ’&= # %& ’$ F %( ’( F & )* ’( = ’($ !( ’D = ’(= =D %* ’D F %* ’! F == $% ’! = ’**，$ ’D$ (! ’& % ’(# =$ =$$ ’( ! ’$# =$% ’D ! ’$& =% =)% ’( F =)) ’D F =) )= ’( F )= ’# F =!$* ’( = ’&D，= ’*) $# ’= = ’#&，= ’*$
=( $$’& = ’%*，= ’&) $% ’% = ’%$，= ’&( =* )( ’! F )( ’$ F =# )= ’D $ ’#D )= ’% $ ’#% =& )! ’# = ’))，= ’(! )( ’% = ’%&，= ’(% $D %D ’* F %D ’* F $= %% ’# = ’**，= ’&) %) ’$ = ’**，= ’&$$$ %$’( = ’%*，= ’)D %% ’D = ’%!，= ’)$
$%$# ’= = ’D# ’! = ’DD
$) =! ’! D ’&$ =! ’& D ’&)
$! =! ’% D ’&D =! ’* D ’&%$( =* ’= D ’** =* ’! D ’*#
$*$! ’& = ’=( ’% = ’=)
$# =#$ ’% F =#) ’D F
$& %$ ’) D ’&# %= ’= = ’D(
%D $% ’) D ’*)$% ’# D ’*(
·!)· 生物加工过程 第 ) 卷第 ) 期
万方数据
!"# $%&谱中显示有 "’ 个碳的吸收信号，其中 有!!(( )*+ 和!!," )** ( 个烯碳信号及!!+, )’( 的羰 基信号；!-* )," 和!./ )+- 提示为 ( 个连氧碳。! 0$%&中!/ )(*（!0，1）为 ! 个烯氢；!’ )-. 2!! )!, 之
间有 (! 个 0，均为单峰，提示为 - 个甲基；!" )(, 和
!" ).+分别连接在两个含氧碳基团。对比齐墩果酸
的 $%&数据，可以推测 #!!连有一个羟基，又由于 03!! 的耦合常数（ ! 4 !( )/，. )"+，, ).- 05）极大（0 在"位时耦合常数高 ［!,］），可知 03!! 在 #!!的"位， 因此羟基连接在 #!!的#位。67 衍生产物应该为 #!!#3羟基齐墩果酸。 ! 结 论 （!）对赭曲霉 "#$%&’())*# +,-&.,%*# $8!(’" 产酶 羟基化齐墩果酸的产酶条件进行了考察，得到菌株 摇瓶培养最佳培养基配方（9·: ; !）：葡萄糖 (’，玉米 浆 (/，酵母膏 " ，<(0=6, ! )/，>0 . )’。菌株培养 (’ ?，加入 ( @9·; ! : 的齐墩果酸利于诱导羟基化酶的 产生。 （(）菌株在 (+ A下以 !/’ B·@CD ; !振荡培养 (, ?，加入底物的乙醇溶液（!’ 9·: ; !），使转化液中齐 墩果酸的初始质量浓度达到 !’’ @9·: ; !，经 *. ? 转 化，齐墩果酸转化率可达到 !’ )!(E。 （"）产物通过 0=:#、!0$%& 和!"# $%& 分析，
结果表明产物为 #!!#3羟基齐墩果酸。
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万方数据