全 文 ：第 １２卷第 ３期
２０１４年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０３􀆰 ０１２
收稿日期：２０１２－１２－２９
基金项目：国家自然科学基金青年项目（３１２０００１２）
作者简介：宋　 波（１９７８—），四川都江堰人，讲师，研究方向：环境微生物学，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｓｏｎｇｂｏ１＠ １２６􀆰 ｃｏｍ
外加电场刺激对菲降解菌的影响
宋　 波，侯怡铃，丁　 祥
（西华师范大学 生命科学学院，南充 ６３７００２）
摘　 要：以菲为主要 Ｃ源，吐温 ８０作为增溶剂，研究细菌 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ在直流电和交流电条件下的生长和
代谢过程。 实验结果表明：当施加 １０ ｍＡ直流电时，通电 ８ ｈ后，菌液中细胞的菲降解率较对照增长 １􀆰 ６倍，细胞生
长亦有所加快；而施加交流电时，细菌生长和菲降解率均低于直流电刺激。
关键词：交流电；直流电；电解刺激；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ；菲；生物修复
中图分类号：Ｑ９３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０３－００６２－０４
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ
ｂｙ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ
ＳＯＮＧ Ｂｏ，ＨＯＵ Ｙｉｌｉｎｇ，ＤＩＮＧ Ｘｉａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ Ｗｅｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈｏｎｇ ６３７００２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｅ􀆰 ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｗｅａｋ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ（ＤＣ） ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ
ｕｓｉｎｇ ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ ａｎｄ Ｔｗｅｅｎ ８０ ａｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ􀆰 Ｗｈｅｎ １０ ｍＡ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ
ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ，ｔｈｅ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＣ ｌｅｄ ｔｏ ａｎ ｏｂｖｉｏｕｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ
ｕｐｔａｋｅ􀆰 Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ １􀆰 ６ ｆｏｌｄ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｉｃ
ｆｉｅｌｄ。 Ｗｈｅｎ ＡＣ ｉｍｐｏｓｅｄ，ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ ｗｅｒｅ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ
ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｃｕｒｒｅｎｔ （ ＡＣ ）； ｄｉｒｅｃｔ ｃｕｒｒｅｎｔ （ ＤＣ ）； ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ； Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ；ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ；ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ
　 　 多环芳烃 （ ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ，
ＰＡＨｓ）是一类在环境中广泛分布的有机污染物，其
性质稳定、残留时间长，是最早被发现和研究的化
学致癌物［１］，已被多个国家列为优先控制污染物。
ＰＡＨｓ在环境中普遍存在，具有致诱变性，而且结构
稳定，难以降解等特点。 目前，治理 ＰＡＨｓ 污染的方
法主要以生物修复为技术。 以微生物代谢作用为
主的生物修复技术具有成本低、效果好、无二次污
染等优点，是目前 ＰＡＨｓ 污染土壤修复最具有潜力
的修复手段之一［２－３］。 但是采用传统的微生物降解
手段耗时较长，借助外加电场等技术加速菲的降解
显得尤为重要［４－５］。
对微生物细胞施加外加电场如弱电流在液相
或泥浆体系中激发电极反应能刺激微生物的生长
和代谢作用［６］ ，已成功应用于酵母菌的发酵［７］ 、生
物脱氮［８］以及铁细菌［９］电化学培养等过程。 微生
物电解技术是电化学与生物工程交叉领域的一个
重要课题，近年来受到研究者日益增长的关注。
目前该技术已在工业微生物培养和环境微生物电
刺激修复［７－８］两方面显示出良好的前景，为未来利
用外加电场强化于微生物反应的生物化工及环境
化工过程提供了一个新的趋势。 鉴于此，笔者以
从石油污染土壤分离得到的细菌 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ为实验对象，以菲为唯一 Ｃ 源，由于菲在
水中的溶解度较低，通过添加吐温 ８０ 促溶，使菲
在水中的溶解度有明显的提高［１０］ 。 综合考察在外
加电场下，利用直流电（ ＤＣ）和交流电（ ＩＣ）条件
下，该细菌在生长、活性以及菲的降解率等方面的
影响，旨在为利用微生物修复土壤环境中多环芳
烃污染提供理论与实践依据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种来源
所用的菌种筛选自天津大港油田油污染水中，
并以菲为唯一 Ｃ 源进行驯化。 经 １６ｓ ｒＤＮＡ 测序后
鉴定该菌为 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ 属革兰氏阴性肠
杆菌。
１􀆰 ２　 培养基
采用无机盐类（ｇ ／ Ｌ）：ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ２５、ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０􀆰 ０１、 ＣａＣｌ２ ０􀆰 ０３２、 Ｋ２ＨＰＯ４ ０􀆰 ８、 ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ２、
ＮＨ４ＮＯ３ ０􀆰 ８；由于菲难溶，故添加吐温 ８０ 作为增溶
剂，质量浓度分别为 ３􀆰 ２和 １ ０００ ｍｇ ／ Ｌ。
１􀆰 ３　 预培养条件
参考 Ｌｕｏ 等 ［１１］报道电刺激多采用对数期的
细菌作为研究对象，首先对细菌溶液进行预培
养，以保持细菌液具有较高的活性。 预培养条
件：首先从－８０ ℃低温冰箱中保存的甘油管中取
出 ０􀆰 １ ｍＬ 种子菌液，接种至盛有 ５０ ｍＬ 经过滤
灭菌含培养基的三角瓶中，３０ ℃恒温摇床（ １５０
ｒ ／ ｍｉｎ）中培养约１０ ｈ，此时所得的细菌的生长处
于对数生长期初期，菌体浓度（ ＯＤ６００）在 ０􀆰 ２ 至
０􀆰 ３ 之间。
１􀆰 ４　 分析方法
１􀆰 ４􀆰 １　 细菌浓度测定
测量 ６００ ｎｍ波长处的吸光度值（ＯＤ６００）。
１􀆰 ４􀆰 ２　 细胞脱氢酶活测定
采用 ２，３，５ 三苯基氯化四氮唑（ＴＴＣ）显色法
测定细胞脱氢酶活［１２］。
１􀆰 ４􀆰 ３　 氧化还原电位测定
采用 Ｐｔ４８６５ ５０ Ｓ７，氧化还原电极（Ｍｅｔｔｌｅｒ
Ｔｏｌｅｄｏ公司）测定氧化还原电位（ＯＲＰ）。
１􀆰 ４􀆰 ４　 菲的测定
由于菲不溶于水，采用正己烷将溶液中的菲萃
出。 萃取出液相时，１ ｍＬ样品溶液中加入 １ｍＬ正己
烷，剧烈振荡 １ ｍｉｎ 后离心，取上层有机相。 采用
Ｓｈｉｍａｄｕ ＬＣ １０ＡＴ（Ｓｈｉｍａｄｕ公司）高压液相色谱配
合 Ｃ１８反相柱测定有机相中菲的浓度。 检测方法
为紫外法（ＵＶ），检测波长为 ２５４ ｎｍ，流动相为甲
醇 水溶液 （两者体积比为 ９０ ∶ １０ ），流速 １８０
ｍＬ ／ ｍｉｎ。 采用外标法测定菲的浓度。
１􀆰 ４􀆰 ５　 吐温 ８０的分析
采用硫氢酸铵钴显色法测定吐温 ８０［１３］。
１􀆰 ５　 电解刺激实验装置及方法
参照文献［１４］的方法进行电刺激实验。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 外加电场对菲降解菌生长及代谢的影响
脱氢酶是细胞胞内呼吸链上一组重要酶系的
统称，其活性高低表明了细胞从葡萄糖底物上获取
质子和电子以供应细胞代谢活动的能力，也常用于
表征微生物细胞的总体代谢活力，而且能直接表示
生物细胞对其基质降解能力的强弱。 为考察直流
电和交流电对细菌 Ｅ􀆰 ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ 生长及活性的电解
刺激效果，在实验中采用测定细菌脱氢酶的方法来
反映 细 菌 的 活 性［１５］。 为 研 究 外 加 电 场 对
Ｅ􀆰 ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ 在生长和底物代谢两方面的影响，在
１０ ｍＡ电流条件下采用铂电极分别对预培养菌液进
行了直流电和交流电刺激，同时监测实验过程中细
胞脱氢酶活（ＤＨＡ）、菲和吐温 ８０ 的降解速率以及
生长曲线三方面的变化，结果如图 １和图 ２所示。
由图 １可知：随着加电时间的延长，细菌脱氢酶
活性逐渐增强，菌液中细胞的生长浓度也逐渐增
加。 与参比值相比，可以明显看出加电后细菌的生
长和脱氢酶活得到显著提升。 由图 ２ 可知：加电后
吐温 ８０和菲的浓度也有着显著的变化。 与参比值
相比，２种 Ｃ源的消耗均有所加快，尤其是在直流电
条件下，吐温 ８０的降解速率较参比增长了 １ 倍，在
降解后的 ８ ｈ，ＤＣ 刺激下的残余菲的量为 ２􀆰 ２５，而
对照组的残余菲的量为 ２􀆰 ６８。 很明显在 ＤＣ刺激下
菲的降解速率是对照组的 １􀆰 ６倍。 根据在无菌培养
基中进行电解的实验结果，采用相同条件下的
１０ ｍＡ电流不会导致培养基中菲发生明显的电化学
降解（数据未显示）。 因此，综合考虑细胞菌浓和脱
氢酶活同时增长的实验现象，加电菌液中菲的生物
３６　 第 ３期 宋　 波等：外加电场刺激对菲降解菌的影响
图 １　 外加电场对菲降解菌生长及脱氢酶活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｏｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｅ．ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ
图 ２　 外加电场对菲降解菌及吐温 ８０的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ
ａｎｄ Ｔｗｅｅｎ ８０ ｉｎ Ｅ．ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ ｂｒｏｔｈ
降解速率得到加快。 此结果与笔者在以葡萄糖为
唯一底物的培养基体系中的电解实验相似。 这表
明电解刺激方法的确可以强化细胞对底物的代谢，
而在“表面活性剂 多环芳烃”的生物修复体系中具
有应用潜力。
２􀆰 ２　 外加电场对培养液理化性质的影响
为了考察加电电场（ＯＲＶ）对细胞菌液理化性
质的影响，因此测定了细菌溶液的氧化还原电位
（ＯＲＰ）值和 ｐＨ，结果见图 ３。
图 ３　 外加电场对细胞溶液的氧化还原电位和 ｐＨ的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｏｎ ＯＲＰ ａｎｄ
ｐＨ ｉｎ ｔｈｅ Ｅ􀆰 ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｒｏｔｈ
由图 ３ 可知：菌液的理化性质随着外加电场的
施加，溶液的氧化还原电位急剧下降，尤其是直流
电在加电的 １ ｈ就达到－５８０ ｍＶ，交流电刺激后为
－２３０ ｍＶ，而参比值仅为 １００ ｍＶ，并在整个培养周
期内显著低于参照菌液。 由图 ３ 可以看出：溶液
的 ｐＨ随着细胞的生长代谢逐渐下降，原因可能是
在细胞生长的后期菌液出现一定程度的酸化现
象。 而加电后溶液的 ｐＨ略低于参比值，并且在整
个加电过程中 ｐＨ 的变化很小。 这一结果与佘鹏
等［１４］ 、许晓路等［１５］对以葡萄糖为唯一 Ｃ 源的培养
物体系的电解刺激作用结果相似，加电后细胞的
脱氢酶活、底物降解及细胞的生长显著提高。 在
菌液物化性质上，加电后菌液的氧化还原电位明
显下降。 这极有可能是阴极水电解反应所生产的
Ｈ２ 导致了溶液氧化还原电位的急剧下降［１６］ 。 这
正是菌液中长期保持有氧状态的强还原性环境的
原因，从而促进了菲降解菌的生长和代谢。
３　 结　 论
研究表明，外加电场对菲的降解有明显的促
进作用。 低电流刺激下，施加直流电能促进菲降
解细菌的生长和代谢，对菲的降解效果明显。 交
流电的刺激效果没有直流电的刺激效果明显，可
能是直流电和交流电电极反应产物的不同所造成
的。 因此，用微生物电解刺激降解多环芳烃污染
是一种绿色可行的环保方法。 电刺激技术是一个
很复杂的体系，但是这一结果有助于加深对微生
物电解刺激技术的认识，为以后的应用提供广阔
的前景。
（下转第 ７２页）
４６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
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（责任编辑　 荀志金）
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（责任编辑　 荀志金）
２７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷