全 文 ：第９卷第３期
２０１１年５月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．３
Ｍａｙ２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０３．０１０
收稿日期：２０１０－１２－２０
基金项目：福建省科技项目（２００５Ｑ００７）
作者简介：颜彩玲（１９８５—），女，福建泉州人，硕士研究生，研究方向：生物大分子；黄建忠（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｈｊｚ＠ｆｊｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
葡糖酸醋杆菌内源复制片段的克隆
颜彩玲，李　欣，黄建忠
（福建师范大学 生命科学学院 福建省现代发酵技术工程研究中心
工业微生物教育部工程研究中心，福州 ３５０１０８）
摘　要：采用改进的碱裂解法提取ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９自发不产膜突变体的内源隐蔽质粒。用不
同的限制性内切酶对混合质粒直接进行酶切，酶切后的片段混合物与ｐＵＣ１８载体连接构建重组载体。重组载体回
转入Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９获得隐蔽质粒上具有复制能力的片段，序列结果分析表明：该片段上没有某些其他质
粒所具有的Ｒｅｐ蛋白。利用该片段，构建了能同时在大肠杆菌和葡糖酸醋杆菌中复制的质粒载体，体内的抗生素
抗性实验证明该载体具有良好的稳定性。
关键词：葡糖酸醋杆菌；混合质粒；复制
中图分类号：Ｑ７８５　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０３－００４７－０５
ＣｌｏｎｉｎｇｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｆｒｏｍＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ＹＡＮＣａｉｌｉｎｇ，ＬＩＸｉｎ，ＨＵＡＮＧＪｉａｎｚｈｏｎｇ
（ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆ
ＦｕｊｉａｎＭｏｄｅｒｎＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＦｕｊｉａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０１０８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｃｒｙｐｔｉｃｐｌａｓｍｉｄｓｏｆＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ
ｃｅｌｕｌｏｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｍｏｄｉｆｉｅｄａｌｋａｌｉｎｅｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅｄｉｒｅｃｔｌｙ
ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｃｅｒｔａｉｎｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ａｎｄｔｈｅｄｉｇｅｓｔｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｌｉｇａｔｅｄｔｏｐＵＣ１８
ｖｅｃｔｏｒｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｓ．Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏ
Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９ｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｔｈｅｃｒｙｐｔｉｃｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｉｓｆｒａｇｍｅｎｔｄｉｄｎｏｔｃｏｎｔａｉｎｔｈｅＲｅｐｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅｖｅｃｔｏｒｒｅｐｌｉｃａｔｅｄｉｎｂｏｔｈ
Ｅ．ｃｏｌｉａｎｄＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄｉｔｓｇｏｏｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｉｎａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅ
ｓｉｓｔａｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ；ｐｌａｓｍｉｄｍｉｘｔｕｒｅ；ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ
　　细菌纤维素（ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｕｌｏｓｅ，简称 ＢＣ）是很
多细菌分泌的一种胞外多糖，它是由 β Ｄ 葡萄糖
通过β １，４ 糖苷键结合而成的直链，直链间彼此
平行，无分支结构，又称为 β １，４ 葡聚糖。
Ｂｒｏｗｎ［１］发现在需氧条件下静置培养时，木醋杆菌
Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓ（现在命名为木葡糖酸醋杆菌Ｇｌｕ
ｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓ）在培养基的气 液界面形成一
层细胞外纤维素薄膜。细菌纤维素具有高的机械
强度、良好的生物相容性和生物降解性等，这些特
性使之能广泛应用于食品、医药、纺织、造纸、电子
等行业［２］。此外，利用细菌纤维素制备人造皮肤、
人造血管、创伤敷料、软骨组织工程支架、哺乳动物
细胞培养基质等方面的研究正成为人们关注的热
点［３］。但是由于细菌纤维素产率低，导致生产成本
高，目前仅用于高附加值产品。通过提高细菌的生
产能力是降低成本的一个重要途径。ＤＮＡ重组技
术是改造细菌的最有效的方法之一，因此，发展宿
主载体系统对该细菌进行基因工程操作十分必要。
葡糖酸醋杆菌具有复杂内源质粒ＤＮＡ系统，这
些质粒的功能目前还不是很清楚，有的质粒可能与
纤维素膜的产生有关，因为某些不产纤维素的自发
突变菌株丢失了部分内源质粒［４］；某些内源质粒与
宿主ＤＮＡ发生相互作用，导致其携带有染色体上的
ＤＮＡ片段［５］。利用这些内源质粒，已经构建得到穿
梭质粒载体［６－８］。这些穿梭载体为研究和改造细菌
纤维素生产菌提供了极大的便利，如利用穿梭载体
ｐＳＡ１９载体研究了 Ａ．ｘｙｌｉｎｕｍＢＰＲ２００１的纤维素合
酶启动子的功能［９］；而利用 ｐＳＡ１９在 Ａ．ｘｙｌｉｎｕｍ
ＢＰＲ２００１中表达了绿豆的蔗糖合酶提高了其纤维
素的产量［１０］。
传统的质粒提取方法是通过 ＣｓＣｌ密度梯度超
速离心分离得到单个质粒，然后将其完整地插入其
他载体骨架上，以获得穿梭载体。然而，ＣｓＣｌ超速
离心费时，对设备和操作要求高，且插入整个内源
质粒导致重组载体大，影响后续基因工程的操作。
由于Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９自发不产膜突变株生长
快，并且能够消除细胞外纤维素的影响，笔者选取
其作为提取质粒的菌株。通过对提取的 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉ
混合质粒直接进行酶切，酶切产物直接连入 ｐＵＣ１８
载体，来克隆质粒上具有复制能力的片段。
１　材料与方法
１１　质粒及菌种
汉氏葡糖酸醋杆菌（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｈａｎｓｅｎｉ）
ＡＴＣＣ２３７６９购于美国ＡＴＣＣ，大肠杆菌 ＥｃｏｌｉＤＨ５α
和ｐＵＣ１８质粒由福建师范大学工业微生物教育部
工程研究中心保存。
１２　培养基
Ｅｃｏｌｉ用 ＬＢ培养基，３７℃培养；Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉ
ＡＴＣＣ２３７６９不产膜突变体用 ＨＳ培养基（ｇ／Ｌ）：葡
萄糖２０，蛋白胨 ５，酵母浸出物 ５，柠檬酸 １１４，
Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ０６８；２８℃培养。
１３　Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９抗生素耐受性实验
选取含５０～５００μｇ／ｍＬ不同质量浓度的氨苄
青霉素的ＨＳ培养基对 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９进行
处理，确定原始菌株对抗生素的敏感度。将原始菌
株分别涂布于不同浓度的抗生素板上，每个抗生素
浓度做３个平行实验，倒置于２８℃培养３ｄ，观察它
们的生长状况。
１４　质粒ＤＮＡ的提取和重组质粒构建
Ｅ．ｃｏｌｉ质粒的提取方法参照文献［１１］。
为消除细胞外细菌纤维素膜对质粒提取的影
响，葡糖酸醋杆菌质粒的提取采用 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉ
ＡＴＣＣ２３７６９自发不产膜突变体，提取方法为改进的
碱裂解法［１２］。
选择常见的几种限制性内切酶 ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ，对提取的 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９混
合质粒分别进行随机酶切过夜，各取２μＬ酶切混合
物进行琼脂糖凝胶电泳检测。选取合适的酶切产
物，用相对应限制性内切酶对 ｐＵＣ１８载体进行单酶
切并去磷酸化，两者连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α得到重
组质粒。
１５　葡糖酸醋杆菌电转化
将重组质粒加入葡糖酸醋杆菌感受态细胞中，
轻轻搅拌混匀，转入 ０１ｃｍ冰预冷的电转杯中
（ＢｉｏＲａｄ），用ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩａｐｐａｒａｔｕｓ（ＢｉｏＲａｄ）电
击，使用如下参数：１８ｋＶ，２００Ω，２５μＦ。电击后加
入１ｍＬ新鲜的ＨＳ培养液，于２８℃、８０ｒ／ｍｉｎ振荡
培养１５ｈ，涂布相应浓度的抗生素平板，倒置于
２８℃培养。
１６　载体稳定性的测定
将待测菌株的阳性单菌落接种到新鲜无抗生
素ＨＳ液体培养基中摇瓶培养，待细菌长到一定浓
度，每隔２４ｈ按１％的比例接种到新鲜无抗生素的
ＨＳ液体培养基中，转接３次后（约７０代），稀释划
线于无抗生素ＨＳ固体平板上，２８℃培养长出单菌
落后，随机挑取单菌落至ＨＳ（Ａｍｐ２００μｇ／ｍＬ）液体
培养基中培养，观察细菌生长情况。
２　结果与讨论
２１　抗性验证结果
Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９原始菌株对 ５０～５００
μｇ／ｍＬ之间不同质量浓度的氨苄青霉素的抗性结
果如表１所示。由表１可知：当培养基中的氨苄青
霉素浓度达到 ２００μｇ／ｍＬ，Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９
已经不能生长，因此后续的实验使用氨苄青霉素的
质量浓度均采用２００μｇ／ｍＬ。
８４ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
表１　葡糖酸醋杆菌对氨苄青霉素的抗性验证
Ｔａｂｌｅ１　Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ′ｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＡｍｐｉｃｉｌｉｎ
ρ（Ａｍｐ）／（μｇ·ｍＬ－１） ５０ １００ １５０ ２００ ２５０ ５００
抗性结果 ＋ ＋ ＋ － － －
　注：＋表示生长；－表示死亡。
２２　Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉ内源质粒的随机酶切结果
用常用的限制性内切酶 ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＰｓｔＩ
和ＸｂａＩ对提取的 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９混合质粒
进行酶切，酶切结果如图１所示。由图１可知：与原
始的混合质粒相比，ＥｃｏＲＩ和 ＸｂａＩ的酶切产物看
不出明显的条带变化，而 ＨｉｎｄＩＩ和 ＰｓｔＩ的酶切图
谱出现了许多相对分子质量较小的条带，因此后续
实验选用ＨｉｎｄＩＩ和ＰｓｔＩ的酶切产物。
１—λＨｉｎｄＩＩｄｉｇｅｓｔｅｄＤＮＡｍａｒｋｅｒ；２～５—ｐｌａｓｍｉｄｓｍｉｘｔｕｒｅ
ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩ，ＰｓｔＩａｎｄＸｂａＩ；
６—ｐｌａｓｍｉｄｓｍｉｘｔｕｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＧ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９
图１　Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９混合质粒的酶切图谱
Ｆｉｇ．１　ＰｌａｓｍｉｄｓｍｉｘｔｕｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＧ．ｈａｎｓｅｎｉ
ＡＴＣＣ２３７６９ａｎｄｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｄｉｆｅｒｅｎｔ
ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ
２３　克隆 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９内源质粒具有
复制能力的片段
　　选择ＨｉｎｄＩＩ和ＰｓｔＩ对Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９
的混合质粒分别进行酶切，并分别连接到相应酶切
的ｐＵＣ１８载体上，得到各种不同的 ｐＵＣ１８２３７６９混
合重组质粒，重组质粒混合物分别转化 ＤＨ５α，从转
化板上随机挑取几个克隆提取质粒，对它们用相应
的酶进行酶切鉴定，酶切结果（图 ２）显示插入到
ｐＵＣ１８载体中的片段大小各不相同。
将这些含有外源片段的重组质粒电击转化进
１—λＨｉｎｄＩＩｄｉｇｅｓｔｅｄＤＮＡｍａｒｋｅｒ；
２～６—ｐＵＣ１８２３７６９ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＨｉｎｄＩＩ；
７～８—ｐＵＣ１８２３７６９ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＰｓｔＩ
图２　Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９重组质粒ｐＵＣ１８２３７６９
的ＨｉｎｄＩＩＩ和ＰｓｔＩ酶切鉴定
Ｆｉｇ．２　ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＵＣ１８２３７６９ｆｒｏｍ
Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙ
ＨｉｎｄＩＩＩａｎｄＰｓｔＩ
Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９突变体中，涂布于 ＨＳ（Ａｍｐ
２００μｇ／ｍＬ）平板筛选，发现含有较大片段的重组质
粒几乎都能在含抗生素的 ＨＳ平板上长出单克隆
体。为了方便后续的研究，选取插入片断较小（约
３３ｋｂ）的一个重组质粒（图２中第２泳道）进行进
一步研究，并将此质粒命名为ｐＵＣ１８ Ｈ１，结果如图
３所示。由图３可知：Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９原始
菌和转入 ｐＵＣ１８空载体的 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９
均不能在含氨苄青霉素的 ＨＳ平板上生长，而转入
ｐＵＣ１８ Ｈ１的Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９则能长出单菌
落，说明转入的质粒赋予了葡糖酸醋杆菌氨苄青霉
素的抗性。
通过对ｐＵＣ１８ Ｈ１进行测序，获得了Ｈ１片段的
核苷酸序列，结果如图４所示。由图４可知：该片段
长度为３３３８ｂｐ。利用 ＮＣＢＩ的 ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ软件分
析，在该序列中发现了２３个开放阅读框，其中开放
阅读框大小在１００个氨基酸以上的有 １０个，根据
Ｂｌａｓｔ比对分析发现其中存在一个可能的 ＡＢＣ转运
蛋白编码框（位于１３６９～３１８９ｂｐ之间）和一个可
能的内切核酸酶ＩＩ编码框（位于１００６～２９９ｂｐ，反
向互补序列），内切核酸酶 ＩＩ编码框可能参与了质
粒的复制。但是在该序列中没有发现编码复制起
始蛋白（Ｒｅｐ蛋白）的编码框，可能该片段的复制并
不依赖于自身编码的Ｒｅｐ蛋白。
９４　第３期 颜彩玲等：葡糖酸醋杆菌内源复制片段的克隆
图３　ｐＵＣ１８和ｐＵＣ１８Ｈ１电转Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９的结果
Ｆｉｇ．３　ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｐＵＣ１８ａｎｄｐＵＣ１８Ｈ１ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＧ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９
图４　Ｈ１片段序列
Ｆｉｇ．４　ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＨ１ｆｒａｇｍｅｎｔ
２４　载体稳定性的测定
将Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９（ｐＵＣ１８ Ｈ１）阳性克
隆接入新鲜的空白 ＨＳ（Ａｍｐ０μｇ／ｍＬ）液体培养基
中，转接３次后（每２４ｈ一次），细菌增殖大约７０代
后，于空白ＨＳ平板上划线得到单克隆体，随机挑取
２０个单克隆体转入 ＨＳ（Ａｍｐ２００μｇ／ｍＬ）培养液
中，结果如图 ５所示。由图 ５可知：挑取的所有
Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉ仍然具有氨苄青霉素抗性，说明细菌在传
０５ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
代许多代后，该质粒载体在细菌中仍旧稳定存在，
该载体具有良好的稳定性。
图５　载体的稳定性实验
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｏｆｔｈｅｖｅｃｔｏｒ
３　结论
通过对提取的质粒混合物进行随机酶切的方
法，成功克隆到 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉＡＴＣＣ２３７６９内源隐蔽质
粒中一段具有自主复制能力的片段Ｈ１，该片段的大
小仅为３３ｋｂ左右，小于用其他传统方法克隆得到
的具有复制能力片段的长度，由此构建得到的质粒
载体能够容纳更大的外源基因片段。利用Ｈ１片段，
构建了能够在大肠杆菌和葡糖酸醋杆菌中进行增
殖的质粒载体，该载体在大肠杆菌和葡糖酸醋杆菌
中能够稳定存在和复制，并能通过筛选标记氨苄青
霉素抗性来筛选转化子，为在葡糖酸醋杆菌中进行
基因工程操作提供了良好的载体工具。该片段的
克隆不仅有助于对葡糖酸醋杆菌进行后续的基因
工程操作，而且有助于进一步分析葡糖酸醋杆菌隐
蔽质粒内部具有复制能力片段的结构，为了解该细
菌隐蔽质粒的复制情况提供良好的材料。
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１５　第３期 颜彩玲等：葡糖酸醋杆菌内源复制片段的克隆