全 文 ：第 １３卷第 ５期
２０１５年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０５􀆰 ０１１
收稿日期：２０１４－０８－２５
基金项目：上海市科学技术委员会科技支撑项目（１２４３１９０１４０２）
作者简介：翁志兵（１９８０—），男，江苏泰兴人，工程师，研究方向：无血清培养基及大规模动物细胞培养，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｗｅｎｇ１９８０＠ ｓｉｎａ．ｃｏｍ
无血清培养基干粉的生产工艺优化
翁志兵１，邵春花１，胡　 辉２，３
（１． 上海中信国健药业股份有限公司，上海 ２０１２０３；２． 抗体药物国家工程研究中心，上海 ２０１２０３ ；
３． 上海生物制造技术协同创新中心，上海 ２００２３７ ）
摘　 要：为了研究瞬时温度的提高对培养基加工的影响，通过不同的固定温度处理培养基，考察不同温度长时间处理
后的培养基对 ＣＨＯ细胞的生长和表达的影响。 结果表明，４０ ℃处理后的效果最佳，处理工序与对照工艺相比，大大
简化，产能有很大提升，为大规模生产培养基设备的选型和生产参数设置提供理论依据，且提高了设备的生产效率。
关键词：无血清培养基；温度；针磨
中图分类号：Ｑ８１３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０５－００５７－０４
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ⁃ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ
ＷＥＮＧ Ｚｈｉｂｉｎｇ１，ＳＨＡＯ Ｃｈｕｎｈｕａ１，ＨＵ Ｈｕｉ２，３
（１． Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣＰ Ｇｕｏｊｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ；
３． Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏ⁃Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｉｎｓｔａｎｔａｎｅｏｕｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ􀆳ｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｓｅｒｕｍ⁃ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ， ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｌｉｍｉｔ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ，ｋｅｅｐｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ⁃ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ａ ｌｏｎｇ ｔｉｍｅ ｔｏ
ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ
４０ ℃ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｉｔ ａｌｓｏ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ．Ｉｔ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ
ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ， ａｎｄ
ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｅｒｕｍ⁃ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；ｐｉｎ ｇｒｉｎｄｉｎｇ
　 　 动物细胞培养多采用无血清培养基，无血清培
养基长期被国外供应商垄断，国内生产无血清培养
基的公司寥寥无几。 由于培养基所需的大部分原
料容易受潮，若不进行干燥处理，会对培养基的最
终品质以及用量造成不利影响。 因此，在培养基生
产中，首先需要在一定温度下对原料进行干燥处
理。 在处理过程中，不同成分对温度的敏感程度各
不相同，需要在不同的温度下进行处理，然后混合
在一起，经过碾磨最终制成培养基干粉。 国内现有
的企业都是采用传统球磨方式，球磨虽然结构简
单，但钢珠的清洗及搬运费时费力，效率低下，工作
噪音大，占地面积大，增加了生产成本和生产时间。
另外，球磨工艺采用的是批次生产，造成单批产能
有限［１－２］。
国内抗体产业不断发展，规模越来愈大。 如上
海中信国健药业股份有限公司投资的亚洲最大
３０ ０００ Ｌ抗体项目将于 ２０１５年年底投产，必将增大
对无血清培养基的需求。 如果继续采用球磨方式
会很大程度降低培养基的年产能。 目前国际上已
经有培养基公司采用先进针磨工艺，其优势在于能
实现无血清培养基的连续生产，一台体量很小的针
磨设备就可以与大型球磨机产能相当。 但针磨工
艺的缺点是设备高速旋转，产热量大；热交换面积
小，导致传热效率低，对培养基的品质也会造成不
利影响。 同时，不同的工作温度对设备的产能影响
很大［３－８］。 因此，找到一个绩效比最高的生产温度
就显得非常重要。 目前，国内对培养基干粉温度处
理的研究较少，对于针磨的使用缺乏实际经验。
针对针磨工艺导致瞬间温度提高影响培养基
质量问题，笔者研究不同温度长时间处理的培养基
干粉对 ＣＨＯ细胞培养和蛋白表达的影响，以确定绩
效最高的处理温度。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
表达抗人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗
体的 ＣＨＯ细胞由上海中信国健药业股份有限公司
提供，培养基生产原料由上海抗体药物国家工程研
究中心有限公司提供。
１􀆰 ２　 培养基处理方法
设定 ４个温度点，分别为 ４０、６０、８０ 和 １００ ℃，
处理时间 ４ ｈ（针磨设备物料接触极限值），以原方
法处理的作为对照实验（ＲＴ）。 每个温度点加 ２ 个
平行试验，以消除实验误差可能带来的影响。
１􀆰 ３　 细胞培养方法
将细胞以 １×１０６ 个 ／ ｍＬ 的初始细胞密度接种
于 １ Ｌ摇瓶中，载液量为 ４００ ｍＬ，培养时间为 １０ ｄ，
ｐＨ低于 ６􀆰 ８补碱，每天补糖至 ３ ｇ ／ Ｌ，温度为 ３７ ℃，
ＣＯ２体积分数为 ５％，转速为 １２５ ｒ ／ ｍｉｎ。 每天取样
计数，并将培养液于 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ，保存
上清液于－２０ ℃冰箱，用于理化参数分析。
１􀆰 ４　 分析方法
１􀆰 ４􀆰 １　 细胞计数
每天取样利用台盼蓝拒染法染色，使用上海睿
钰生物科技有限公司的 Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ 自动细胞计数仪
读取活细胞密度和细胞活率，每样计数 ３ 次，取平
均值。
１􀆰 ４􀆰 ２　 葡萄糖 乳酸测定方法
采用德国 Ｌａｂｏ公司全自动 ＴＲＡＣＥ 葡萄糖 乳
酸分析仪检测乳酸和葡萄糖浓度，每一样品重复检
测 １次，取平均值。
１􀆰 ４􀆰 ３　 蛋白表达量测定方法
色谱柱采用ＡＢ公司 ＰＯＲＯＳ􀳏 Ａ２０ Ｃｏｌｕｍｎｓ，２􀆰 １
ｍｍ×３０ ｍｍ，系统采用 Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０ ＨＰＬＣ。 流动相 Ａ：
５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸缓冲液，０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ，流动相 Ｂ：
０􀆰 １％ＨＣｌ，０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ，流动相 Ａ 和流动相 Ｂ 的
比例为 ３ ∶ ７；流速 １ ｍＬ ／ ｍｉｎ；检测波长 ２８０ ｎｍ；进样温
度（５±３） ℃；柱温（２５±５） ℃；进样量 １００ μＬ。
１􀆰 ５　 统计方法
采用 ＳＰＳＳ １９ 软件进行数据的统计分析。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 不同温度处理的培养基对活细胞密度的影响
研究不同温度处理的培养基对活细胞密度的
影响，结果如图 １所示。
图 １　 不同温度处理的培养基对活细胞密度的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ
从图 １可以发现，１００ ℃时的活细胞密度最低，
可能是由于培养基中的某些成分经过 １００ ℃高温处
理后，会有部分损失，营养成分的减少影响了细胞
的生长繁殖，造成了活细胞密度较低。 在培养基磨
制过程中，实际针磨工艺瞬时高温可达 ８０ ℃以上，
对热敏感物质有很大破坏，例如 ＰＦ６８（一种非离子
型乙烯和环氧丙烷共聚物，被用作消泡剂和抗击细
胞培养中剪切力的细胞膜稳定剂）就会熔化并结
块。 针磨处理培养基原料时间受设备处理能力和
筛网大小影响，一般接触时间约为 １０ ～ ３０ ｍｉｎ，因
此，控制针磨腔体内部温度尤为重要，一般使用干
冰或液氮降温。 合理控温点可在节约成本的同时
提高产能。 从活细胞密度来看，４０ ℃和对照组差异
较小，基本相同，细胞活力较高。
２􀆰 ２　 不同温度处理的培养基对乳酸的影响
研究不同温度处理的培养基对乳酸的影响，结
果如图 ２所示。
８５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
图 ２　 不同温度处理的培养基对乳酸的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｎ ｌａｃｔａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
从图 ２可以发现，１００、８０ ℃时的乳酸质量浓度
较高，达到 １􀆰 ７５ ｇ ／ Ｌ以上，６０ ℃时的乳酸浓度居中，
４０ ℃和对照组的乳酸浓度最低。 乳酸浓度较高会
抑制细胞的生长和表达，对比图 １和图 ２可以看出，
乳酸浓度较高的，活细胞密度相对较低。
培养基干粉处理温度较高时会对培养基成分
造成一定影响，比如谷氨酰胺和转铁蛋白等［９－１０］，这
些成分与细胞生长和代谢相关，有可能是影响了三
羧酸循环（ＴＣＡ循环），能量代谢进入了糖酵解途径
或者己糖磷酸支路（ＨＭＰ）途径，乳酸浓度升高。 乳
酸浓度越低，说明能量代谢越彻底，释放的 ＡＴＰ 越
多，越有利于细胞生长和代谢，乳酸浓度高影响细
胞能量代谢，进而抑制细胞生长和表达。 因此，从
乳酸浓度来看，４０ ℃和对照组最优。
２􀆰 ３　 不同温度处理的培养基对目的蛋白表达量的
影响
　 　 研究不同温度处理的培养基对目的蛋白表达
量的影响，结果如图 ３所示。
图 ３　 不同温度处理的培养基对表达量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｐｒｅｓｓｉｏｎ
从图 ３可以看出，１００ ℃处理下的蛋白表达量
最低，仅有 ２􀆰 ０６ ｇ ／ Ｌ；４０ ℃处理后的蛋白表达量和
对照组蛋白表达量最高，分别达到 ２􀆰 ４５ 和 ２􀆰 ５３
ｇ ／ Ｌ。 其他温度处理下的蛋白表达量均低于 ４０ ℃下
的表达量。 １００ ℃时的蛋白表达量最低，可能是由
于培养基中的部分成分经过 １００ ℃高温处理后，会
有部分损耗，营养成分的减少影响了细胞代谢，造
成了蛋白表达量较低。
２􀆰 ４　 单因素实验结果及方差分析
比较不同培养基培养 １０ ｄ 后活细胞密度、乳酸
及其目的蛋白表达量，并进行方差分析，结果如表 １
和 ２所示。
表 １　 各组培养 １０ ｄ后的活细胞密度、乳酸及其
目的蛋白表达量的比较
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ，ｌａｃｔａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ
ａｎｄ ｔｈｅ ｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｉｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｇｒｏｕｐｓ ａｆｔｅｒ １０ ｄ′ｓ ｃｕｌｔｕｒｅ（ｘ±ｓ）
组别 温度 ／℃
活细胞密度 ／
（１０６ 个·ｍＬ－１）
ρ（乳酸） ／
（ｇ·ｍＬ－１）
目的蛋白
表达量 ／
（ｇ·ｍＬ－１）
１ ＲＴ ９􀆰 ３ ± ０􀆰 １ ０􀆰 ８ ± ０􀆰 ０３ ２􀆰 ５３ ± ０􀆰 ０３
２ ４０ ９􀆰 １４ ± ０􀆰 １３① ０􀆰 ８４ ± ０􀆰 ０７② ２􀆰 ４５ ± ０􀆰 ０５③
３ ６０ ７􀆰 ８ ± ０􀆰 １８ １􀆰 ２ ± ０􀆰 １ ２􀆰 ３ ± ０􀆰 ０７
４ ８０ ７􀆰 ２ ± ０􀆰 ０９ １􀆰 ５７ ± ０􀆰 １２ ２􀆰 １ ± ０􀆰 ０３
５ １００ ６􀆰 ４ ± ０􀆰 ０８ １􀆰 ７ ± ０􀆰 ０８ ２􀆰 ０６ ± ０􀆰 ０９
注：①Ｐ＞０􀆰 １，②Ｐ＞０􀆰 １，③Ｐ＞０􀆰 ０５；与空白比较，其他数据 Ｐ＜０􀆰 ０５。
表 ２　 单因素实验方差分析
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｏｎｅ⁃ｗａｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ
组别 方差来源 均方 ＭＳ Ｆ值 Ｐ值 显著性
１ ＲＴ 　 ２􀆰 ５４ ０􀆰 ０４２ ０􀆰 ３０
２ ４０ ５􀆰 １４ ０􀆰 ０８３ ０􀆰 ２８
３ ６０ ３１７􀆰 ８４ ５􀆰 ３２ ０􀆰 ０８ ∗
４ ８０ ４６１􀆰 ０２ ７􀆰 ７４ ０􀆰 ０５ ∗
５ １００ １ ３８２􀆰 ５９ ２３􀆰 １５ ０􀆰 ０３ ∗
由表 １ 和表 ２ 可知：１００ ℃处理下的活细胞密
度最低，４０ ℃处理下的活细胞密度最高，其他温度
处理下的活细胞密度与对照组比较均为显著性差
异。 ４０ ℃时，Ｐ＞０􀆰 ０５，为非显著性差异。 ４０ ℃和对
照组的乳酸浓度最低，浓度相差较小，非显著性差
异，较为接近。 从蛋白表达量来看，４０ ℃和对照组
为非显著性差异，其他组与对照组为显著性差异，
明显高于其他处理温度时的蛋白表达量，因此，４０
℃和对照组最优。
９５　 第 ５期 翁志兵等：无血清培养基干粉的生产工艺优化
３　 结论
针对针磨工艺导致瞬间温度提高影响培养基
质量问题，笔者研究不同温度长时间处理的培养基
干粉对 ＣＨＯ细胞培养和蛋白表达的影响，以确定绩
效最高的处理温度。 综合乳酸浓度、活细胞密度和
蛋白表达量来看，４０ ℃和对照组的均优于其他组，
其中对照组的乳酸浓度最低，蛋白表达量最高，但
对照组的培养基干粉处理工序较为繁琐，生产效率
较低。 而 ４０ ℃处理后细胞的生长状况和对照组为
非显著性差异，但是处理工序却大大减少，生产效
率得到大幅提高。 综合考虑，４０ ℃的培养基干粉针
磨处理工序是最佳的处理温度。
参考文献：
［ １ ］　 苏晓蕊，岳华，汤承．Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基研究进展［ Ｊ］ ．动
物医学进展，２０１２，３３（２）：８７⁃９０．
［ ２ ］ 　 Ｊａｙｍｅ Ｄ， Ｆｉｋｅ Ｒ， Ｒａｄｏｍｉｎｓｋｉ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｓｅｒｕｍ⁃ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ
［ Ｍ ］ ／ ／ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｂａｓｉｃ ＆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ．
Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００２：１５５⁃１５９．
［ ３ ］ 　 Ｃｈａｓｅ Ｌ Ｇ，Ｌａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ Ｕ，Ｓｏｌｃｈａｇａ Ｌ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｕｍ⁃
ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ
［Ｊ］ ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１０，１（１）：８．
［ ４ ］ 　 Ｌｉ Ｙ，Ｐｏｗｅｌｌ Ｓ，Ｂｒｕｎｅｔｔｅ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｅｒｕｍ⁃ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ａｎｉｍａｌ⁃ｄｅｒｉｖｅｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００５，９１ （ ６）：
６８８⁃６９８．
［ ５ ］ 　 Ｊｕｎｇ Ｓ，Ｓｅｎ Ａ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ
ｃｕｌｔｕｒｅ：ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ
ｓｅｒｕｍ⁃ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ［ Ｊ ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２，６（５）：３９１⁃４０３．
［ ６ ］ 　 Ｂｒｕｎｎｅｒ Ｄ，Ｆｒａｎｋ Ｊ，Ａｐｐｌ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｒｕｍ⁃ｆｒｅｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ： ｔｈｅ
ｓｅｒｕｍ⁃ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｎｌｉｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ［ Ｊ］ ．Ａｌｔｅｘ，２０１０，２７
（１）：５３．
［ ７ ］ 　 Ｋａｎａｔｓｕ⁃Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｍ， Ｉｎｏｕｅ Ｋ， Ｏｇｏｎｕｋｉ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｒｕｍ⁃ａｎｄ
ｆｅｅｄｅｒ⁃ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１１，８４（１）：９７⁃１０５．
［ ８ ］ 　 Ｋｏｎｎｏ Ｍ， Ｈａｍａｚａｋｉ Ｔ Ｓ， Ｆｕｋｕｄａ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ⁃
ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ⁃ｆｒｅｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ［ Ｊ ］ ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２０１０，
４００（４）：４６１⁃４６５．
［ ９ ］ 　 马洪龙，韩飞，李爱科，等．谷氨酰胺及其结合肽的研究进展
［Ｊ］ ．粮油食品科技，２０１４，２２（３）：７６⁃８１．
［１０］ 　 龙华，曾勇，郑英，等．转铁蛋白的研究与发展［Ｊ］ ．生物工程进
展，２００１，２１（２）：３２⁃３９．
（责任编辑　 管　 珺）
０６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷