全 文 ：第6卷第1期
2008年1月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Jan．2008
·2l·
甾短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中的表达
张 玲，霍惠芝，沈 微，杨海麟，邬敏辰，王 武
(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036)
摘要：为了实现胆固醇氧化酶在大肠杆茵中的表达，将甾短杆菌Brevibacteriumsp．DGCDC-82胆固醇氧化酶基因
用PCR的方法去掉信号肽序列，连接到质粒pTrc99a，通过筛选得到了表达胆固醇氧化酶的重组茵JMl09／pTrc99a-
COD。经IPTG诱导后表达出相对分子质量约为5．5×104的蛋白质。分别考察了诱导温度、时间、IPTG浓度等因
素对重组茼表达的胆固醇氧化酶的影响。在优化条件下，该胆固醇氧化酶的酶活可以达到700U／L。酶学特性分
析表明其反应的最适pH为7．5，最适温度为40℃。
关键词：Brevibacterium叩．DGCDC-82；胆固醇；氧化酶；原核表达；信号肽
中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)0l一0021—06
ExpressionofcholesteroloxidasegenefromBrevibacterium
sp．DGCDC-82inE．coli?
ZHANGLing，HU0ui—zhi，SHENWei，YANGHai-Lin，WUMin—Chen，WANGWu

(TheKeyLaboratoryofIndustrialB otechnologyoftheMinistryofEducation，
JiangTtanUniversity，Wuxi214036，China)
Abstract：TofacilitatehexpressionofcholesteroloxidasegeneinarecombinantE．coli。afragmentof
thegenefromBrevibacteriumsp．DGCDC-82，inwhicht esignalpeptidewasdeletedbyPCRmethod，
waginsertedintoaprokaryoficexpressionvectorpTrc99a．Bycolony-PCRmethodscreening，arecombi-
nantplasmidpTrc99a—CODWasobtainedanthentransformedintothexpressionhostJMl09．Theex-
pressionproductswereanalyzedbySDS—polyacrylamidegelelectrophoresisindicatingthatproteinaround
5．5×104Wasobtained．Theinfluenceofinductionconditionssucha IPTGconcentration．theinduction
temperaturendtimeofinductiononthexpressionoftherecombinantproteinwereinvestigated．Under
optimalcondition，theenzymeactivitycouldreach700U／L．Theenzymaticnalysisoftheprokaryoticde—
rivedcholesteroloxidaserevealedthatitsoptimalpHandtemperatureWas7．5and40℃．respectively．
Keywords：Brevibacterium8p．DGCDC-82；cholesterol；oxidase；prokaryotice pre sion；signalpeptide
胆固醇氧化酶(COD，EC1．1．3．6)是一类黄素
蛋白，属于GMC氧化还原酶体系，它能催化胆固醇
分解成4-胆甾烯．3．-酮和过氧化氢，是胆固醇代谢过
程中的一个关键酶。在临床上胆固醇氧化酶与胆
固醇脂酶和过氧化氢酶一起作为血浆总胆固醇含
量的检测试剂‘¨，用以诊断冠心病、动脉粥样硬化
收稿日期：2007-06-22
基金项目：国家863计划课题资助项目(2006AAl02305)；工业生物技术教育部重点实验室基金资助项目(KLIB．KF200505)
作者简介：张玲(1981一)。女，鸟鲁木齐人。硕士研究生，研究方向：酶工程。
联系人：王武，女，教授，E-mail：wangwu@sytu．edu．cn
万方数据
·22· 生物加工过程 第6卷第1期
等心脑血管疾病；在食品行业它常用来降低食品中
胆固醇含量，制造保健食品旧1；近年来还发现，胆固
醇氧化酶可以抑制某些昆虫的生长，是一种新型
的、高效的杀虫剂"-。
能够产生胆固醇氧化酶的微生物有很多种，研
究得比较深入的胆固醇氧化酶基因主要是来自于
链霉菌Streptomycessp．的choAHl和甾短杆菌Brevi—
bacteriumsterolicum的choB【5jo Ohta等旧。曾报道在
大肠杆菌中表达了来源于Brevibacteriumst olicum
ATCC21387的胆固醇氧化酶，但获得的活性酶蛋白
仅占总蛋白的0．02％。Ohta等。列又将胆固醇氧化
酶基因与LacZ基因进行融合表达，但是主要的酶蛋
白以包涵体的形式表达。
本实验室从土壤中筛选得到一株胆固醇氧化
酶的甾短杆菌，产酶水平60U／L，经多种诱变处理
使突变株产酶水平达到500U／L【8】。桑吉等【91进一
步采用超声波与亚硝基胍联合诱变的手段，使产酶
水平达到了1200U／L。王龙刚等u驯获得了Brevi-
bacterium印．DGCDC-82胆固醇氧化酶结构基因
(GenBank登录号DQ345780)，利用含T7lac的
pET-28a质粒在大肠杆菌中获得表达，所得酶活为
340U／L，表达量占总蛋白的0．02％。Chen等¨纠曾
报道将信号肽去除后有利于胆固醇氧化酶基因在
毕赤酵母中的表达，甲醇诱导72h后，成熟肽基因
表达的胆固醇氧化酶活性为1000U／L，含信号肽的
结构基因表达的胆固醇氧化酶活性仅为600U／L。
因此去掉信号肽序列的胆固醇氧化酶基因连接到
含有trp／lac杂合启动子的质粒pTrc99a上，使其在
大肠杆菌JMl09中进行了活性表达。
1材料和方法
1．1菌株和载体
胆固醇氧化酶生产菌Brevibacteriumsp．DGC．
DC-82由本实验室筛选并保存；大肠杆菌表达质粒
pTrc99a由江南大学生物工程学院沈微老师惠赠；
最coliJMl09由本实验室保存。
1．2培养基、工具酶和试剂
Brevibacteriumsp．DGCDC一82的培养基配制参
照文献E9]；限制性内切酶EcoRl，胁蒯III，T4连接
酶，Taq酶，蛋白质相对分子质量标准品均购自
TaKaR且公司(大连)；胶回收试剂盒购自上海捷瑞
生物工程有限公司，细菌基因组DNA抽提试剂盒购
自上海飞捷生物公司；其他试剂均为国产或进口分
析纯试剂。
1．3方法
1．3．1引物
根据胆固醇氧化酶基因序列(GenBank登录号
DQ345780)设计了去掉信号肽的引物，由北京赛百
盛基因技术有限公司合成。上下游分别引入了Eco
RI和所以III酶切位点。
上游引物为：5’一AATTACCGGAATTCGC·
CCCCAGCCGCACCCTC．3’
下游引物为：5’一AA7rrACCGAAGCrIr兀CACTG
GATGTCGGACGAGATG．3’
1．3．2PCR条件
以甾短杆菌Brevibacteriumsp．DGCDC-82的基
因组为模板进行胆固醇氧化酶基因的PCR扩增，其
反应参数为：95℃，4min；95℃，1min；60℃，
1 min；72℃，1．5min；30个循环；最后72℃延伸
10min。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
1．3．3目的片断的回收
PCR产物约50斗L，用l％的琼脂糖电泳回收目
的片段。利用DNA胶回收试剂盒进行回收，方法参
见DNA胶回收试剂盒说明书。
1．3．4重组大肠杆菌的构建
将PCR扩增的胆固醇氧化酶基因片断和
pTrc99a质粒分别用EcoRI和胁以III进行酶切，酶
切产物用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，4℃用T4DNA
连接酶过夜连接目的基因和质粒片断，连接产物转
化EcoliJMl09感受态细胞，挑取菌落进行筛选验
证，得到重组E．coliJMl09／pTrc99a—COD。重组子
序列测定由大连宝生物工程公司完成。
1．3．5重组菌的诱导表达与鉴定
挑取阳性克隆单菌落并接种于5mL含有质量
浓度为100I．Lg／mLAmp的LB液体培养基中，于
37℃、220r／min震荡过夜。取1mL培养物，将其
转接于50mL质量浓度为100Ixg／mLAmp的IJB液
体培养基中37℃、220r／min震荡至菌体浓度DD鲫
约为0．6～0．8左右，加入一定浓度的IPTG诱导，不
同温度下继续培养。收集菌体供电泳分析及酶活
力测定。
1．3．6表达产物SDS—PAGE分析[12—3]
以转入pTrc99a空质粒的E．coliJMl09菌体作
为对照，将鉴定为阳性的E．coliJMl09／pTrc99a．
COD重组菌经IPTG诱导培养一定时间后，离心收
万方数据
2008年1月 张玲等：甾短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中的表达 ·23·
集相同量的菌体，加入适当上样缓冲液，使每个上
样的蛋白量相近，混匀煮沸10min，进行SDS-PAGE
电泳分析；浓缩胶质量分数为5％，分离胶质量分数
为12％。电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色。
1．3．7菌体破碎
12000r／min，4℃离心5min收集菌体后，用
o-1mol／L、pH7．5的磷酸钾缓冲液洗涤悬浮菌体，
超声波破碎仪400W，工作5s，间歇5s，99个循环，
超声破碎菌体。4℃，12000r／rain离心15min，去除
细胞碎片沉淀，取上清进行酶活分析。
1．3．8表达产物的酶活力测定
按照季文明等¨41的比色法测定胆固醇氧化酶酶
活。胆固醇氧化酶催化氧化1mol胆固醇成为ltool
胆甾4烯-3．-酮，同时产生1mol过氧化氢。胆甾4-
烯-3．酮在24011111处有最大吸收峰，而过氧化氢在过
氧化氢酶的作用下能将4-氨基．安替比林、苯酚转化
为醌亚胺呈红色，在500lira处有最大吸收峰。通过
检测紫外吸收强度或通过比色就可以测定胆固醇的
含量，从而计算出胆固醇氧化酶的酶活单位。
3mL溶液A(4一氨基一安替比林1mmol／L；苯
酚6mmol／L；叠氮钠0．2g／L；过氧化物酶5000
U／L；磷酸钾缓冲液25mmol／L，pH7．5)，1501xL
溶液B(胆固醇8．26g／L；TritonX-1004．26％；异
丙醇为溶剂)，50¨L酶液，37℃，反应5min，沸水
浴3 min，于500rlm测吸光值∞铷。
酶活(U／mL)=1．6832×oD伽。
酶活力单位定义：37℃，1分钟转化1斗mol胆
固醇生成胆甾·4一烯一3-酮的酶量定义为1个酶活
单位(U)。
1．3．9表达产物的酶学性质
(1)最适反应温度及热稳定性
将1．0mLpH7．5磷酸钾缓冲液配制的工作液
在不同温度(30～65℃)下保温5min后加人50斗L
适当稀释的酶液，测定∞姗吸光度变化，绘制酶活
力随温度变化曲线；并将酶液分别在不同温度下保
温不同时间，测定酶活力，考察其热稳定性。
(2)最适反应pH及pH稳定性
将1．0mL不同pH缓冲液配制的工作液在37
℃保温5min后加入50灿适当稀释的酶液，测定
0D湖吸光度变化，绘制酶活力随pH变化曲线；并将
酶液分别用0．1mol／L不同pH的缓冲液(pH4．0—
5．5磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液，pH6．0—8．0PB缓冲
液，pH8．5～9．5riffs—HCI缓冲液)进行适当的稀释，
25℃处理24h，测定酶活力，考察其pH稳定性。
(3)金属离子对酶活力的影响
用10mmol／L磷酸缓冲液(pH7．0)配成含
2mmol／L不同金属离子的缓冲液，与一定量酶液在
25℃保温lh后，测定胆固醇氧化酶活力。以不含
金属离子反应液为对照。
2结果与分析
2．1 胆固醇氧化酶基因序列分析与PCR扩增结果
利用BLAST软件进行同源性分析，发现本实验
室筛选保藏的Brevibacteriumsp．DGCDC-82胆固醇
氧化酶基因与目前胆固醇氧化酶重要工业生产菌
株Brevibacteriums olicumATCC21387的胆固醇氧
化酶基因(GenBank登录号I)00712)的同源性达到
98％，并采用在线分析程序SignaIPV3．0辅助分
析，确定Brevibacterium印．DGCDC名2产生的胆固
醇氧化酶包括一段约45个氨基酸的信号肽¨5l。本
文设计了一条去除信号肽序列的引物，以Brevibacte-
riumsp．DGCDC．82的基因组为模板进行PCR扩
增，得到了将胆固醇氧化酶信号肽去除的合适大小
的DNA片断(图1)。
1一PcR扩增产物；2一DNA分子标准
图l PCR扩增产物电泳图
Fig．1PCRproductofCODgene
2．2重组大肠杆菌的构建
将扩增得到的胆固醇氧化酶基因和质粒
pTrc99a分别用限制酶EcoRI和觑以III酶切，酶切
产物纯化后进行连接，连接产物转化EcoliJMl09
得到重组质粒pTrc99a．COD。对重组质粒分别进行
万方数据
．24· 生物加工过程 第6卷第1期
双酶切鉴定(用EcoRI和觑以III)和PCR鉴定，获
得一条约1．5kb的片断(图2)。经DNA测序验
证，所得的重组质粒中基因序列正确，信号肽序列
已被去除。
1一DNA分子标准；
2一重组质粒用EcoRI和HindHI双酶切产物；
3一以重组质粒为模板PCR产物
图2重组质粒的双酶切与PCR验证
Fig．2Identificationofexpressionplaamid
byrestrictiondigestionandPCR
2．3 SDS—PAGE分析
鉴定为阳性的E．coliJMl09／pTrc99a-COD经
IPTG诱导后收集菌体，加上样缓冲液煮沸10min，
进行SDS—PAGE电泳。从电泳图谱上可以看出，经
IPTG诱导后，含有重组质粒pTrc99a-COD的大肠杆
菌有相对分子质量约为5．5×104的蛋白表达条带
(图3)。这进一步证明了重组表达载体pTrc99a—
COD构建成功。
l一蛋白质相对分子质量标准；2--JMl09／pTrc99a诱导3h；
3—6一分别为JMlOg／pTrc99a·COD诱导1h,3h．5h．7h
图3 JMl09／pTrc99a—COD诱导表达的SDS-PAGE图谱
Fis．3AnalysisofSDS-PAGEthexpressionpr ducts
2．4胆固醇氧化酶的诱导表达
2．4．1诱导剂对胆固醇氧化酶表达的影响
用不同浓度的IPTG在37℃下对重组菌诱导3
h，然后分别检测胆固醇氧化酶活性(图4)。IPTG
浓度为0．6mmol／L时酶活达到最高值，此后随着
IPTG用量的增大，菌体的酶活反而有所下降。有可
能是诱导剂IPTG有一定毒性，对菌体生长不利，从
而使外源蛋白的表达随着IPTG浓度达到一定值以
后反而下降。
乒
■
●
已
!}g
髓
图4 IPTG浓度对酶活的影响
Fig．4InfluenceofIPTGfinalconcentration
通过对廉价无毒的乳糖替代IPTG作为诱导剂
进行了初步研究。实验结果表明，在乳糖浓度为7
mmol／L的时候诱导效果较好，但其酶活仅相当于
IPTG诱导时的15％左右。
2．4．2诱导温度对胆固醇氧化酶表达的影响
将EcoliJMl09／pTrc99a—COD分别在25，29，32，
37℃温度下用0．6mmol／L的IFFG进行诱导，3h后
取样检测菌体的胆固醇氧化酶活性(图5)。
f叫
■
●
呈
妲
槛
图5诱导温度对酶活的影响
Fig．5Influenceofinductionemperature
从图5可见，在37℃时表达的胆固醇氧化酶酶
活力较高，低温不适合重组菌目的蛋白的表达。
万方数据
2008年1月 张玲等：甾短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中的表达 ·25·
2．4．3诱导时间对胆固醇氧化酶表达的影响
将重组菌于37℃用0．6mmoL／L的IPTG诱导，
每隔Ih取样检测菌体的胆同醇氧化酶活性(图
6)。发现5h后随着诱导时间增长，酶活反而下降。
对不同时间下诱导的菌体进行SDS—PAGE检测(图
3)。结果发现，随着诱导时间的增长，目的蛋白占
胞内可溶性蛋白的比例没有明显增加。分析原因
可能是在诱导过程中，发酵液里存在着一些使表达
的重组蛋白发生降解的因素，例如蛋白酶的降解、
pH变化的影响等，从而产生酶活在诱导时问超过
5h后酶活反而下降的现象．还有可能是随着外源蛋
白的大量积累，不能折叠成有活性的目的蛋白。
图6诱导温度对酶活的影响
Fig．6Influenceofinductionme
经过诱导条件的优化，在250mL摇瓶中，37℃
用0．6mmol／L的IPTG诱导5h，重组菌的胆固醇氧
化酶酶活可达700U／L。
2．5表达产物酶学性质测定
2．5．1最适反应温度及热稳定性
实验结果表明，酶的最适反应温度为40℃(图
7)。酶在50℃以下保温30min后能够保持90％
的活性，高于60℃时酶活力几乎丧失，说明该酶对
高温敏感，可能是辅酶FAD肽链结合不牢固，当处
理温度升高到一定值以上，发生不可逆解离，从而
表现为酶活性的丧失。
2．5．2最适反应pH及pH稳定性
实验结果表明，胆固醇氧化酶的最适反应pH
为7．5(图8)。该酶在pH6．0～8．0的范围内比较
稳定，1h后可保持80％的活性。
去除信号肽的重组酶的最适pH，最适温度与王
龙刚获得的含有信号肽的重组酶¨刮以及季文明获
得的甾短杆菌Brevibacteriumsp．DGCDC名自身产
的胆固醇氧化酶”1的酶学性质一致。
零
!lg
落
莨
罂
图7温度对胆固醇氧化酶的影响
Fig．7Effectsof emperatureoncholesteroloxidase
零
蜒
溢
霞
罂
图8 pH对胆固醇氧化酶的影响
Fig．8EffectsofpHoncholesteroloxidase
2．5．3金属离子对胆固醇氧化酶活性的影响
结果表明：M92+基本不影响胆固醇氧化酶的活
性，Ca2+、Fe3+、Mn2+、Zn“、Cu2+对酶活性有轻微的
抑制作用，而H92+和Ag+离子完全抑制了胆固醇氧
化酶的活性(表1)，胆固醇氧化酶的活性部位可能
有游离的巯基存在，银离子和汞离子与巯基结合以
后，酶就失去了催化活性。
表1 不同金属离子对胆固醇氧化酶的影响
Table1 Effectsofmetalionsoncholesteroloxidase
金属离子 相对酶活／％ 金属离子 相对酶活／％
M92+ 100．0 Zn“ 98．5
Ca2+ 95．6 Cu“ 92．6
F0+85．5Ag+0
Mn2+ 99．3 H92+0
3讨论
胆固醇氧化酶在食品开发、医疗保健、临床检
测、生物农药等方面具有广泛的应用，在国内，对它
的研究大多停留在筛选菌种及产酶条件优化等方
万方数据
· 26· 生物加工过程 第6卷第1期
面，缺乏对酶在分子水平上的研究和了解，并且目
前该酶主要依赖于进口。本文以本实验室筛选保
藏的甾短杆菌基因组为模板，将去除了自身信号肽
的胆固醇氧化酶基因连接到含有trp／lac双启动子
pTrc99a载体上，构建得到了产胆固醇氧化酶重组
大肠杆菌JMl09／pTrc99a—COD。对重组菌进行了诱
导表达，结果发现诱导剂IPTG的用量、诱导温度、
诱导时间等对胆固醇氧化酶的表达都有较大的影
响。在优化的表达条件下，胆固醇氧化酶的酶活可
达700U／L，相对于国内同类报道有大幅提高。实
验结果表明信号肽的去除有利于胆固醇氧化酶产
物活性的提高，这与Sampson等¨刊报道的结论相
同。同时研究了重组酶的酶学性质，与含信号肽的
重组酶和野生菌的酶学性质一致。
由于大肠杆菌表达系统密码子存在一定的偏
好性，而来源于甾短杆菌Brevibacteriumsp．DGCDC一
82的胆固醇氧化酶基因含有大肠杆菌稀有密码子，
并且GC含量较高，可能对表达水平有很大影响，因
此胆固醇氧化酶产物在E．coliJMl09中的表达量
较低。另外考虑到胆固醇氧化酶在实际操作中遇
到的一些问题如易被蛋白酶降解，酶活力下降较快
等，因此有必要选择合适的表达系统，并对胆固醇
氧化酶基因进行改造，以期在基因水平上提高酶的
表达量和酶活力。
参考文献：
[1]MalikV。PundlrCS．Determinationoftotalcholesterolin∞mm
bycholesterolesterasendCO—immobilizedontoarylaminegI脚
[J]．BiotechnolApplBiechem，2002，35(3)：191—197．
[2]吕陈峰，王龙刚，杨胜利，等．胆固醇氧化酶转化蛋黄胆固醇工
艺的优化[J]．食品与生物技术，2001，20(6)：555-559．
[3]PuroeUJohnP，GreenplateJohnT．Cholesteroloxidase：apotent
insecticidalproteinactiveagainstboll删larvae[J]．Bioehem
BiophysReCommun，1993，196(3)：1406—1413．
[4]YuanCS．Detectionofanalytesusingattenuatedenzyares：WO，
0102600[P]．2001-01．11．
[5]JacsehM．Cholester01．oxidaeefr mBrevibacteriumsterolicum：WO，
9425003[P]．1994—11—10．
[6]OhtaT，FujishiroK，Yamaguchi，K，eta1．Sequenceofgene
ehoBencodingcholesteroloxidaeeofBrevibacteriumsterolicum：
Com—parisonwithchoAofStreptomycessp．SA—COO[J]．Gene，
1991，103(1)：93-96．
[7]OhmT，FujishiroK，YamaguehiK，eta1．Hyperexprossionanda-
nalysisofchoBencodingcholesteroloxidaseofBrevibacteriumst -
rolicuminEscherichiacolandStreptomyceslividans[J]．Biesci
BiotechnolBiechem。1992。56(11)：1786—1791．
[8]季文明．短杆菌胆固醇氧化酶的生成及性质研究[D]．无锡：
江南大学，2000．
[9]桑吉，王龙刚，李忠琴，等．胆固醇氧化酶高产菌株的复合诱变
选育[J]．食品工业科技，2006。27(6)：87-89．
[10]王龙刚，邬敏辰，王武．胆固醇氧化酶基因的克隆及在Eeoli
中的表达[J]．微生物学通报，2006，33(6)：39-42．
[11]ChenYen-tong，HuangHsin—ho。ChengYi—fang，eta1．Expression
ofacholesteroloxidasegenefromArthrobactersimplexinEscherich-
iacoliandPichiapastoris[J]．EnzymeandMicrobialT chnology，
2006，39(4)：854-856．
[12]SambrookJ，FritsehEF。ManiatisT．MolecularCloning：A【丑bo．
ratorymanual[M]．3甜ed．NewYork：ColdSpringHa bort—Qtora-
toryPress，2001．
[13]WeaverRF．MolecularBiology[M]．北京：科学出版社，2001．
[14]季文明，陈毅力．比色法测定胆固醇氧化酶酶活[J]．食品与生
物技术。2000，19(3)：251-254．
[15]SampsonNS，ChenXiao-yu．Ineroasedexpre sionofBrevibact靠
啪sterolicumcholesteroloxidaaeinEscherichiacolibygenetic
modification[J]．ProteinExpressioandPurification。1998，12
(3)：347-352．
[16]王龙刚．短杆菌胆固醇氧化酶高产株选育、酶纯化及基因研究
[D]．无锡：江南大学，2007．
万方数据