全 文 ：南昌链霉菌的微波诱变!
郭 峰，程 新，陈其亮，涂国全
（江西农业大学 生物工程系，南昌 !!""#$） 摘 要：以微波对南昌链霉菌进行了微波育种，获得梅岭霉素杀虫剂生产能力高于出发菌株 %!&的 ’#(!))。该菌 株经多次传代，遗传性状保持稳定。 关键词：微波诱变；梅岭霉素；杀虫剂；南昌链霉菌 中图分类号：*+! 文献标识码：, 文章编号：)-%.(!-%/（.""#）"#(""$)("!
!"#$%&’ () "*& ’+,&&)%)- (. *%-* /,($#+%)- !"#$%"&’()$* +,+)-,+.$+*/* ’"0%) 12 3%+,(405& %,,0$%0"%()
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（C4D>EFG45F AH I56 ;< ,6E= 155KO>56 !!""#$，7O<5>） 61’",0+"：, G@F>5F MFE><5 ’#(!)) AH O<6O(DEAP@K<56 !"#$#%&!’(#% Q>M MKE4454P HEAG E45F MFE><5 %# R SN
GL4 P<>FM<56 E>F4 AH <5M4KFD>K#%&!’(#% E4G><54P MF>S=4 >HF4E M@SK@=F@E4 HAE G>5N F7&2 4(,$’：GL4 P<>F江西农业大学微生物教研室从校园油茶根际土
壤中分离筛选到一株产杀虫抗生素的链霉菌新种
———南昌链霉菌（*+,"-+.!’("/ %0%(10%&"%/#/）［)］，通过
与中国科学院上海药物研究所合作研究证实，南昌
链霉菌发酵产物中能产生多种杀虫活性物质，经
?V7薄层层析检测，其中 ,、I、7、C #个组份有较强
的杀虫活性。分离提纯了 I组份，经 8WV7高效液
相色谱检测表明，发现 I组份本身是一多组份的复
合物，其中有 I)、I.、I!、I# 的 ?V7行为非常接近，分
离提纯 I)组份经 8) 核磁共振谱、7)!核磁共振谱、
8)(8)二维相关谱、8)(7)!二维相关谱、质谱的分析
和结构推导，确定了 I)是一种十六元大环内酯类化
合物，它的母核与当今世界著名的广谱驱虫抗生素
———阿维菌素（23"!"(+#%/）相同而侧链结构完全不
同［.(#］，因而是中国国内发现的一种广谱高效的世
界新素，命名为梅岭霉素（!"#$#%&!’(#%）简称 XT I。 并于 )++-年获得中国发明专利权”［$］。梅岭霉素是
一市场前景广阔而亟待开发的新型绿色生物农药。
为获得高产突变株，作者采用微波诱变方法对梅岭
霉素产生菌进行了试验，获得一发酵水平提高 %!&
的突变株。
8 材料与方法
) T) 出发菌株
南昌链霉菌（ *+,"-+.!’("/ %0%(10%&"%/#/）%# R，为
本研究室自行筛选保藏。
) T. 培养基
! 收稿日期：.""#("!(..
基金项目：国家十五攻关项目（."")I,%"/I"%）
作者简介：郭 峰（)+%!(），男，湖北黄梅人，在读硕士研究生，主要从事杀虫抗生素研究。
通讯作者：涂国全 9 Y G><=：F@6@AB@>5Z.-!T 54F
第 .卷第 #期
.""#年 ))月
生 物 加 工 过 程
7O<54M4 JA@E5>= AH I:ALT .""#
·$)· 万方数据 ! "# "! 孢子斜面和平皿分离培养基 高氏 !号培养基 ! "# "# 种子培养基 玉米粉 ! "$ %，玉米淀粉 & "’ %，黄豆饼粉 & "( %，
酵母膏 & "# %，)*#+,- & "&’ %，./01 & "&2 %，（.*-）#3,-
& "&2 %，0/0,4 & "&4 %，5* $，用水定容到 !&& 67。 ! "# "4 发酵培养基 玉米粉 4& %，玉米淀粉 #& %，黄豆饼粉 !& %，葡 萄糖 ! %，).,4 & "2 %，)*#+,- & "2 %，0/0,4 ’ %，5* 8， 用水定容到 ! &&& 67。 ! "4 微波诱变方法 ! "4 "! 单孢子悬液的制备 将成熟孢子斜面加入无菌水，洗下孢子，倒入装 有玻璃珠的灭菌三角瓶中，4& 9，用摇床振荡 4& 6:;，使孢子分散活化，再用灭菌漏斗过滤，制备 单孢子悬液，并稀释至 !&’个 < 67备用。 ! "4 "# 诱变因子处理 采用微波炉（微波源为 # -2& =*>$2& ?家用微
波炉），取制备好的单孢子悬液 2 67于一平皿内，放
入家用微波炉中，中等强度照射。分两种方式照射：
平皿加盖照射与平皿不加盖照射。
每照射 !& @冷却 !& @再照射，照射时间累计，
照射时间分别为 #&、4&、-2、’&、8&、!#& @。然后涂布
平板，4& 9培养 8 A。
! "4 "4 初筛和复筛
将辐射处理过的孢子悬液作一定的梯度稀释，
涂布于平皿分离平板培养基上，4& 9培养 8 A，进行
活菌计数和致死率计算，挑取单菌落进行摇瓶发酵
初筛和复筛，以化学效价为初筛和复筛的标准。
! "- 培养条件
! "- "! 斜面及分离平皿
4& 9培养 8 B !& A。
! "- "# 种子
将斜面孢子少量接种于种子培养基（装量 4&
67 < #2& 67）、置于 4& 9、##& C < 6:;的旋转摇床上振
荡培养 -$D。 ! "- "4 摇瓶发酵 吸取培养好的种子，以 !2E接种量转入发酵培 养基（装量 4& 67 < #2& 67）中，置于 4& 9、##& C < 6:;， 振荡培养 #!’ D。 ! "2 化学效价的测定 称取梅岭霉素的标品，溶于无水乙醇中，配制成 不同浓度的标准溶液。测定时从不同浓度标准溶液 中各取 ! 67移至大试管内，各加 - 67蒸馏水。再 用 & "! 6F1 < 7的 *01调节溶液 5* 4" 2左右，后加入 !& 67环己烷萃取，置于振荡器上振荡 ! 6:;后，静 置 !2 6:;。取上层环己烷萃取液用紫外分光光度计 测定 #4$ ;6波长下的紫外吸收值，回归得方程：! G
48&"-8" H #2"22’（ ## G & "88( $）。 取发酵液离心，弃上清液，无水乙醇补足，浸提 #- D，离心取上清液 ! 67按上面方法处理，紫外 #4$
;6波长测 $% 值，代入上方程计算 ! 值，! 值即为 发酵液中每 67所含梅岭霉素的!% 数。通过以上 测定结果，梅岭霉素化学效价单位为发酵液中每 67 具有梅岭霉素标品 !!%数为 !个单位。 ! "’ 遗传稳定性实验 将复筛得到的高产菌接种斜面培养基培养 8 A， 制备甘油管 & 9冰箱保存，分别连续传代 -次，用化 学效价测定方法测定。 ! 结果 # "! 微波对梅岭霉素产生菌致死效应的影响 微波炉不同辐射时间对梅岭霉素的孢子致死率 见图 !。 对各剂量组活菌计数计算死亡率。平皿加盖组 死亡率 !&&E，平皿不加盖组其致死效应从图 ! 可 以知道，随着时间的延长，不加盖组致死率增加，处 理 8& @时全部死亡。表明梅岭霉素产生菌对微波 敏感，致死效应很明显。 图 ! 微波辐射南昌链霉菌孢子致死率 I:%"! 7JKD/1:KL C/KJ FM @5FCJ@ FM &’#()’*+!,(- ./.,0/.1(.-2- NL 6:OCFP/QJ :CC/A:/K:F; ·2#· 生物加工过程 第 #卷第 -期 万方数据 ! "! 微波对梅岭霉素产生菌诱变效应的影响 平板分离培养基上分离到的单个菌落，少数呈 草帽形，大部分与出发菌株相同，菌落丰满，但色素 深浅不同。分别从各处理组挑取单菌落数个，进行 摇瓶初筛，挑取时挑了菌落丰满，色素浅的单菌落传 到斜面培养。用长好的孢子斜面，以出发菌株 #$ %
效价为 &’’(对照进行发酵筛选实验，统计各剂量
组生产能力。结果见图 !。
图 ! 各剂量组不同生产能力菌株百分率
)*+"! ,-. /.0 12 /01345*6+ 57/78*59 *6 3*22.0.68 +014/ :9 3*22.0.68
31;.
从各组挑出生产能力超过 &’(以上的菌株进
行复筛，多次筛选最后取每组生产能力最高菌株摇
瓶测效价，结果见表 &。最终发现一编号为 <$=>&& 经 ?’ ;处理的菌株生产能力最高，达到$@!!+ A BC，
比出发菌株 #$%的 !?&!+ A BC提高了 #> "!(。 表 & 各组生产能力最高菌株的发酵效价（单位：!+ A BC） ,7:D. & ).0B.6878*16 46*8 12 8-. 4//.0 /01345*6+ 57/75*89 12 ;807*6 *6 3*22.0.68 +014/（!+ A BC） 照射时间 A ; ’ !’ >’$@ ?’
编号 #$%（对照）<&=$& =@! <$=>&& & !?E !E’ >&@$’> $@! ! !@? >’’ >’> >FF$$F > !@F >’@ !F#$&# $@@ 平均 !?& !F@ >’@$’?"> $@! 提高率（(） ’ &> &?"F @@"# #>"! ! "> 遗传稳定性实验 将复筛的 <$=>&&菌株用甘油管放冰箱 ’ G保
存，取孢子接种斜面，连续传代 $次，分别摇瓶后测 定其效价见表 !。实验结果表明，代间效价差异不 明显，证明遗传性状稳定。 表 ! 遗传稳定性实验结果（效价单位：!+ A BC） ,7:D. ! ,-. 0.;4D8; 12 *6-.0*8.3 ;87:*D*89（!+ A BC） 编号 第一代 第二代 第三代 第四代 &$@! $@E"!$$>"F$@’
! $$F $@@ $@’"$@$$ @"!#
> $@’$?’"F"@"E!
平均 $@!$@#"EE $$#"F>$$ #"’>
! 讨论
微波是一种电磁波，能引起水、蛋白质、核苷酸、
脂肪和碳水化合物等极性分子转动，尤其是水分子
在 ! $@’ HIJ微波作用下，能在 & ;内 &E’ G来回转 动 ! "$@ K &’F次，从而引起分子间强烈的摩擦，使得
孢内 LMN分子氢键和碱基堆积化学力受损，最终引
起 LMN分子结构发生变化，导致遗传变异［?］。因此
微波诱变育种成为可能。
本实验采用平皿加盖组与平皿不加盖组处理。
加盖组全部死亡，不加盖组虽然每处理 &’ ; 冷却
&’ ;，但还有很高的死亡率。其说明微波效应有热
效应和非热效应［#］。虽在实验中减少微波辐射的热
效应，但非热效也有致死作用。累积微波辐射的非
热效应，通过本实验取得不错的效果。而且本实验
操作安全、方法易行、设备简单，在工业微生物菌种
选育中值得推广。
本实验挑单菌落时，选菌落丰满，色素浅的传斜
面。其色素与梅岭霉素产量是否有关联，机理如何
值得以后进一步研究。
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万方数据