全 文 ：
摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
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摇 摇 第 猿源卷 第 员员期摇 摇 圆园员源年 远月摇 渊半月刊冤
目摇 摇 次
前沿理论与学科综述
土壤大孔隙流研究现状与发展趋势 高朝侠袁徐学选袁赵娇娜袁等 渊圆愿园员冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
能源基地生态修复
我国大型煤炭基地建设的生态恢复技术研究综述 吴摇 钢袁魏摇 东袁周政达袁等 渊圆愿员圆冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
国家大型煤电基地生态环境监测技术体系研究要要要以内蒙古锡林郭勒盟煤电基地为例
魏摇 东袁全摇 元袁王辰星袁等 渊圆愿圆员冤
噎噎噎噎噎噎噎噎噎
噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
基于 阅孕杂陨砸模型的国家大型煤电基地生态效应评估指标体系 周政达袁王辰星袁付摇 晓袁等 渊圆愿猿园冤噎噎噎噎
西部干旱区煤炭开采环境影响研究 雷少刚袁卞正富 渊圆愿猿苑冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
露天煤矿区生态风险受体分析要要要以内蒙古平庄西露天煤矿为例 高摇 雅袁陆兆华袁魏振宽袁等 渊圆愿源源冤噎噎噎
草原区矿产开发对景观格局和初级生产力的影响要要要以黑岱沟露天煤矿为例
康萨如拉袁牛建明袁张摇 庆袁等 渊圆愿缘缘冤
噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
三七对土壤中镉尧铬尧铜尧铅的累积特征及健康风险评价 林龙勇袁阎秀兰袁廖晓勇袁等 渊圆愿远愿冤噎噎噎噎噎噎噎
某焦化场地土壤中多环芳烃分布的三维空间插值研究 刘摇 庚袁毕如田袁权摇 腾袁等 渊圆愿苑远冤噎噎噎噎噎噎噎噎
个体与基础生态
杉木人工混交林对土壤铝毒害的缓解作用 雷摇 波袁刘 摇 彬袁罗承德袁等 渊圆愿愿源冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
基于 啄员缘晕稳定同位素分析的人工防护林大型土壤动物营养级研究 张淑花袁张雪萍 渊圆愿怨圆冤噎噎噎噎噎噎噎
铅镉抗性菌株 允月员员强化植物对污染土壤中铅镉的吸收 金忠民袁沙摇 伟袁刘丽杰袁等 渊圆怨园园冤噎噎噎噎噎噎噎
陕北地区石油污染土壤中不动杆菌属的筛选尧鉴定及降解性能 王摇 虎袁吴玲玲袁周立辉袁等 渊圆怨园苑冤噎噎噎噎
祁连山高山植物根际土放线菌生物多样性 马爱爱袁徐世健袁敏玉霞袁等 渊圆怨员远冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
新疆沙冬青 粤酝和 阅杂耘真菌的空间分布 姜摇 桥袁贺学礼袁陈伟燕袁等 渊圆怨圆怨冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
聚糠萘水剂对不同积温带玉米花后叶片氮同化的影响 高摇 娇袁董志强袁徐田军袁等 渊圆怨猿愿冤噎噎噎噎噎噎噎噎
内蒙古河套灌区玉米与向日葵霜冻的关键温度 王海梅袁侯摇 琼袁云文丽袁等 渊圆怨源愿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
四种类型栓皮栎栲胶含量 尹艺凝袁张文辉袁何景峰袁等 渊圆怨缘源冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
食物胁迫对翅二型丽斗蟋飞行肌和繁殖发育的影响 吴红军袁赵吕权袁曾摇 杨袁等 渊圆怨远猿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎
颜色对梨小食心虫产卵选择性的影响 杨小凡袁马春森袁范摇 凡袁等 渊圆怨苑员冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
缓释单萜类挥发物对落叶松毛虫行为及落叶松主要防御蛋白的影响 林摇 健袁刘文波袁孟昭军袁等 渊圆怨苑愿冤噎噎
种群尧群落和生态系统
黄土丘陵沟壑区不同植被恢复格局下土壤微生物群落结构 胡婵娟 袁郭摇 雷 袁刘国华 渊圆怨愿远冤噎噎噎噎噎噎
刺参池塘底质微生物群落功能多样性的季节变化 闫法军袁田相利袁董双林袁等 渊圆怨怨远冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
基于 阅郧郧耘技术的茯砖茶发花过程细菌群变化分析 刘石泉袁胡治远袁赵运林 渊猿园园苑冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
景观尧区域和全球生态
中国区域间隐含碳排放转移 刘红光袁范晓梅 渊猿园员远冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
西南地区退耕还林工程主要林分 缘园年碳汇潜力 姚摇 平袁 陈先刚袁周永锋袁等 渊猿园圆缘冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
青海湖流域草地植被动态变化趋势下的物候时空特征 李广泳袁李小雁袁赵国琴袁等 渊猿园猿愿冤噎噎噎噎噎噎噎噎
黑龙江省温带森林火灾碳排放的计量估算 魏书精袁罗碧珍袁孙摇 龙袁等 渊猿园源愿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
三峡库区森林植被气候生产力模拟 潘摇 磊袁肖文发袁唐万鹏袁等 渊猿园远源冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
三峡水库支流拟多甲藻水华的形成机制 朱爱民袁李嗣新袁胡摇 俊袁等 渊猿园苑员冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
流域库坝工程开发的生物多样性敏感度分区 李亦秋袁鲁春霞袁邓摇 欧袁等 渊猿园愿员冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
城乡与社会生态
基于集对分析的京津冀区域可持续发展协调能力评价 檀菲菲袁张摇 萌袁李浩然袁等 渊猿园怨园冤噎噎噎噎噎噎噎噎
江西省自然保护区发展布局空缺分析 黄志强袁陆摇 林袁 戴年华袁等 渊猿园怨怨冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
鄱阳湖生态经济区生态经济指数评价 黄和平袁彭小琳 袁孔凡斌袁等 渊猿员园苑冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
基于有害干扰的中国省域森林生态安全评价 刘心竹袁米摇 锋袁张摇 爽袁等 渊猿员员缘冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
期刊基本参数院悦晕 员员鄄圆园猿员 辕 匝鄢员怨愿员鄢皂鄢员远鄢猿圆愿鄢扎澡鄢孕鄢 预 怨园郾 园园鄢员缘员园鄢猿缘鄢圆园员源鄄园远
室室室室室室室室室室室室室室
封面图说院 三峡库区森林植被要要要三峡地区属亚热带区域袁山高坡陡尧地形复杂尧物种丰富袁森林是其最重要的自然资源之一袁
其面积占到库区总面积的 猿苑豫左右袁库区内现有森林可初步分为 圆 个植被型组袁愿 个植被型袁员愿 个群系组袁源源 个群
系袁员园圆个群丛袁主要树种有马尾松尧杉树尧柏树等袁低海拔处多为落叶阔叶林尧常绿阔叶林袁较高海拔分布有针阔混交
林尧针叶混交林尧灌木林等袁人工林主要有经济林尧竹林等遥 对三峡库区森林气候生产力进行模拟袁分析库区森林植
被的生产力并进行预测袁可以为三峡库区的生态建设决策提供科学依据遥
彩图及图说提供院 陈建伟教授摇 北京林业大学摇 耘鄄皂葬蚤造院 糟蚤贼藻泽援糟澡藻灶躁憎岳 员远猿援糟燥皂
第 34 卷第 11 期
2014年 6月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.34,No.11
Jun.,2014
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:湖南省自然科学基金项目(13JJ6074); 湖南省高校产学研合作示范基地产业化项目(13CY025, 11CY003, 11CY004); 湖南省科学技
术厅科技计划国际合作项目(2012WK2013);益阳市科学技术局科技计划项目([2013]YK1323)
收稿日期:2013鄄08鄄05; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄02鄄24
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: zyl8291290@ 163.com
DOI: 10.5846 / stxb201308052024
刘石泉,胡治远, 赵运林.基于 DGGE技术的茯砖茶发花过程细菌群变化分析.生态学报,2014,34(11):3007鄄3015.
Liu S Q,Hu Z Y, Zhao Y L.Analysis of bacterial flora during the fahua鄄fermentation process of fuzhuan brick tea production based on DGGE technology.
Acta Ecologica Sinica,2014,34(11):3007鄄3015.
基于 DGGE技术的茯砖茶发花过程细菌群变化分析
刘石泉1,2,胡治远2, 赵运林2,*
(1. 湖南农业大学生物科学与技术学院, 长沙摇 410128; 2. 湖南城市学院化学与环境工程学院,益阳摇 413000)
摘要:变性梯度胶电泳是当前微生物生态学研究重要技术之一。 为研究茯砖茶发花过程中细菌群落结构和种类,对发花过程中
不同时段细菌 16S rDNA 的 V3可变区扩增,经变性梯度胶电泳(DGGE)后、对细菌 DGGE 条带进行克隆、测序和比对。 结果表
明,在发花过程的第 0—4天、6—8天、10—14天茯砖茶发花存在 3个差异较大的细菌优势种群结构的演变;从 16SrDNA 的 V3
可变区比对结果证明黑毛茶发花过程中有短波单胞菌属、诺卡氏菌属、新鞘脂菌属、突那梭菌属、韦龙氏假单胞菌属、乳杆菌属、
克雷伯氏菌属以及不可培养 着鄄变形菌、腐败螺旋菌属、粘球菌属、根瘤菌属和 6 种未知分类地位的不可培养细菌,说明采用
DGGE指纹图谱能更系统、更真实地反映茯砖茶发花发酵过程中细菌群落结构和多样性变化。
关键词:茯砖茶;发花发酵;变性梯度凝胶电泳(DGGE);细菌群
Analysis of bacterial flora during the fahua鄄fermentation process of fuzhuan brick
tea production based on DGGE technology
LIU Shiquan1,2,HU Zhiyuan2, ZHAO Yunlin2,*
1 College of Biology and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
2 College of Chemistry and Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyang 413000, China
Abstract: Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) is one of the most important and commonly used techniques in
studies of microbial molecular ecology. DGGE has been widely used in the analysis of community structures and biodiversity
of bacteria, cyanobacteria, archaea, miniature eukaryotes, eukaryotes, and viruses. This technique can be used for the
reliable analysis of multiple samples at the same time. It is suitable for the surveillance of microbial population changes over
both space and time, and is used to probe microbial community composition by DNA sequence analysis. This technology can
overcome the limitations associated with traditional analysis techniques, such as cultivation, purification, and microscopy.
In this research, DGGE spectra analysis was used to examine the microbial diversity during the Fahua鄄fermentation process
of Fuzhuan Brick Tea production. To explore the bacterial community structure during this process, we collected Fuzhuan
Brick Tea samples at days 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, and 14 of the Fahua鄄fermentation process. Total genomic DNA was
extracted from each of the samples, and the V3 variable region of the 16S rDNA gene was amplified. The amplified products
were separated by DGGE. The separated DGGE bands were extracted and gel鄄purified then ligated into the pEASY鄄T vector.
Resultant plasmids were transformed into electrocompetent Escherichia coli DH5琢 cells, and positive clones were identified
by blue white screening experiment. Plasmids from the positive clones were then extracted and sequenced, and the resulting
sequences were submitted to the GenBank database. Using the BLASTN tool to carry out homology comparisons, we
identified sequences in the database that were most similar to the 16S rDNA sequences amplified from the Fahua鄄
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fermentation community samples. The results showed three distinctive kinds of bacterial community structure, correlating to
fermentation times of 0—4 days, 6—8 days, and 10—14 days. Alignments of the V3 variable regions of the 16S rDNA
genes showed that samples contained Brevundimonas aurantiaca, Millisia brevis, Novosphingobium sp, Clostridium
ultunense, Pseudomonas veronii, Lactobacillus plantarum, Klebsiella pneumoniae, uncultured Epsilonproteobacteria,
uncultured Saprospiraceae bacterium, uncultured Myxococcales bacterium, uncultured Rhizobiales bacterium, and six kinds
of unculturable bacteria. This analysis technique provided a detailed spectrum of bacteria at the different time periods during
the Fahua鄄fermentation process, and showed that bacterial species present during this stage of Fuzhuan Brick Tea production
are abundant. Amongst the bacterial species, nine strains belonged to the Proteobacteria, three strains were identified as
Firmicutes, one strain belonged to the Actinobacteria, and one strain belonged to the phylum Bacteroidetes. We also
identified six strains with the greatest similarity to unknown unculturable bacteria, which will require further analysis. This
study also identified K. pneumoniae, B. aurantiaca, P. veronii, and a Myxococcales bacterium in the Fahua鄄fermentation
process samples, all of which are generally considered to be conditionally pathogenic bacteria. The roles of these species
during the fermentation process remain unknown and will require further investigation. Overall, the results of the current
study indicate that DGGE fingerprinting is a useful technique to obtain a comprehensive, detailed bacterial community
structure and estimate of diversity variation from samples collected during Fahua鄄fermentation in the production of Fuzhuan
Brick Tea.
Key Words: fuzhuan brick tea; fahua鄄fermentation; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); bacterial flora
摇 摇 茯砖茶是我国古老茶类———黑茶中的高档品
种,据《明史·茶法》记载,早在明嘉靖三年(公元
1524年),茯砖茶就被规定为运往西北供少数民族
消费的官茶[1],可见其在历史上的重要地位。 茯砖
茶属于完全发酵茶,其加工工序在黑茶中最为复杂
且耗时较长,包括毛茶筛分、拼配、气蒸渥堆、压制定
型、发花干燥、成品包装等步骤[2],各个工艺环节的
控制对保证其品质稳定至关重要。 过去茯砖茶消费
主要集中在边疆少数民族区域,故又被称为“边销
茶冶。 而近年来随着相关研究深入,大量人体和动物
实验资料表明茯砖茶对高血压、高血脂、肥胖、糖尿
病等疾病具备良好的保健效果,并有提高机体免疫
力的作用[3鄄8],因而获得了“富贵病杀手冶的美誉,进
而受到广大国内外消费者的关注与青睐,大有超过
昔日普洱茶热潮之势。
作为完全发酵茶,茯砖茶独特品质的形成与微
生物作用密切相关,微生物发酵给予了茯砖茶独特
的菌花香、醇厚的滋味以及在保健功效方面的提
升[9鄄10],之前研究者们对茯砖茶中微生物的研究,主
要是围绕优势菌群———冠突散囊菌(俗称金花菌)发
生、生长工艺(俗称发花工艺)进行,而对于发花过程
中同时存在的其他微生物特别是细菌菌群的系统性
研究较少见于报道。 发花过程中细菌的存在对发花
质量、茯砖茶品质有着重要的影响,要提高茯砖茶的
质量必须对发花过程中细菌的动态变化加以深入研
究,但对发花过程中细菌研究主要集中在平板分离
计数、鉴定上[11],不能全面反映茶叶微生物群落的
多样性[12],部分“存在但无法培养冶的微生物不能被
有效分离和鉴定,因而有待于新技术的投入与使用。
分子生物学方法如免培养 DGGE 技术使得研究者能
够在分子水平上对微生物群落多样性进行研究,并
具有可靠性强、重现率高等优点,适宜对较为复杂的
环境中微生物种群结构进行分析[13鄄15]。
本研究采用 DGGE 技术,对益阳茶厂有限公司
(湖南产销量最大的茯砖茶生产企业)生产线上不同
发花工艺期的茯砖茶样品中细菌群落的结构进行分
析,以期能为茯砖茶发花工艺改进研究提供更多信
息,为揭示茯砖茶这一发酵食品品质与微生物群落
结构关系的深入研究提供实验支撑。
1摇 材料与方法
1.1摇 材料
1.1.1摇 茯砖茶样品采集
在益阳茶厂有限公司茯砖茶生产线上采集同一
批压制的茯砖茶作为实验样品,分别在压制后进入
发花房的第 0 天、2 天、4 天、6 天、8 天、10 天、12 天、
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14 天取样,并编号为 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8
(采样时间为 2013年 3月 28日—4月 11日)。
1.1.2摇 主要试剂
引物 338F(CCT ACG GGA GGC AGC AG)、GC鄄
338F(CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGG CGG GGC
GGG GGC GCG GGG GG CCT ACG GGA GGC AGC
AG)和 518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)由北京
美亿美生物技术有限公司合成、扩增相关试剂均购
自北京美亿美生物技术有限公司;聚合酶链式反应
(PCR)产物纯化回收采用 AXYGEN 公司 DNA Gel
Extraction Kit 试剂盒;采用 OMEGA 公司 Poly鄄Gel
DNA Extraction Kit回收 DGGE 目的条带;其他试剂
均为国产分析纯。
1.1.3摇 仪器与设备
PTC220 型 PCR 仪(美国 BIO鄄RAD 公司);Gel鄄
Doc XR 凝胶成像系统(美国 Bio鄄Rad 公司);DGGE鄄
2401变性梯度凝胶电泳仪(美国 C.B.S. scientific 公
司)。
1.2摇 实验方法
1.2.1摇 茶叶细菌总 DNA提取
用 Shaheen BH[16] 方法提取样本细菌基因组
DNA,用 1%琼脂糖凝胶电泳检测提取 DNA 样品,置
于-20 益冰箱内保存。
1.2.2摇 细菌 16S rDNA片段的 PCR扩增
以不同样品组 DNA 为模板、用通用引物 GC鄄
338F 和 518R 扩 增 16S rDNA 的 V3 高 变 区
序列[17鄄18]。
PCR扩增体系为:10 伊 PCR buffer 5 滋L;dNTP
(2.5 mmol / L) 3. 2 滋L; rTaq ( 5 U / 滋L) 0. 4 滋L;GC鄄
338F(20 mmol / L)1 滋L;518R(20 mmol / L)1 滋L;模
板 DNA 100 ng;补 ddH2O至 50 滋L。
PCR扩增程序为:94 益预变性 5 min;94 益变性
30 s、55 益复性 30 s、72 益延伸 30 s、30个循环;最终
72 益延伸 10 min。
PCR产物采用 AXYGEN 公司 DNA Gel Extraction
Kit纯化回收。
1.3.3摇 PCR产物的变性梯度凝胶电泳
将 PCR所得产物进行 DGGE 分析,PCR 产物取
10 滋L,选择变性梯度为 35%—55%、浓度为 8%的聚
丙烯酰胺凝胶(化学变性剂为 100%尿素 7 mol / L 和
40%的去离子甲酰胺)在 1伊TAE 缓冲液中 150 V 60
益下电泳 4 h,变性梯度凝胶电泳(DGGE)完毕后、采
用银染法染色显色。
1.3.4摇 DGGE凝胶条带回收测序
用灭菌手术刀切下待回收 DGGE 条带,采用
OMEGA公司 Poly鄄Gel DNA Extraction Kit 回收目的
条带。
以 2 滋L回收产物为模板,338F(CCT ACG GGA
GGC AGC AG) / 518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)
为引物进行 PCR 扩增。 PCR 扩增体系(50 滋L)为:
10伊 PCR buffer 5 滋L;dNTP (2. 5 mmol / L) 3. 2 滋L;
rTaq(5 U / 滋L)0.4 滋L;338F(20 mmol / L)1 滋L;514R
(20 mmol / L)1 滋L;模板 DNA 1 滋L;补 ddH2O 至 50
滋L。 PCR扩增程序为:94 益预变性 4 min;94 益变
性 30 s,55 益复性 30 s,72 益延伸 30 s,30 个循环;
最后,72 益延伸 10 min。
切胶回收重新扩增的 DNA 片段,纯化后连接到
pEASY鄄T载体上,并转化至 DH5琢 感受态细胞中,筛
选阳性克隆,由北京美亿美生物技术有限责任公司
对插入细菌 16S rDNA片段进行序列测定。
1.3.5摇 序列片段分析
将序列提交到 GenBank数据库。 在 GenBank 中
使用 Blast程序进行同源性比较,获得最相似典型菌
株的 16S rDNA序列[19]。
1.4摇 多样性分析
利用分析软件 ( Quantity One 4. 2. 3, Bio鄄Rad)
DGGE 图谱进行聚类和相似性分析。 多样性分析用
多样性指数 H、均匀性指数 E、丰度指数 S,具体计算
参见 Eichner C A[20] 和 Sekiguchi H[21]。 利 用
DNAstar 软件包中的 SeqMan 程序将 DNA 序列进行
人工校对,并将所有校对后的序列方向统一为正向,
通过在 NCBI(美国国立生物技术信息中心)进行
Blast 检索,根据比对结果获得序列对应的细菌种属
信息。
2摇 结果与分析
2.1摇 样本基因组 DNA提取
经凝胶电泳检测,各组样品的细菌基因组 DNA
能够较高质量的提取。
2.2摇 细菌 16S rDNA的 PCR扩增
以 GC鄄 338F 和 518R 为引物扩增 16S rDNA 序
列、经 2%的琼脂糖凝胶电泳检测,获得约 200 bp 的
9003摇 11期 摇 摇 摇 刘石泉摇 等:基于 DGGE技术的茯砖茶发花过程细菌群变化分析 摇
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DNA片段预期 DNA片段(图 1),用于 DGGE分析。
图 1摇 PCR扩增的 16S rDNA部分序列琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 摇 PCR amplification agarose gel electrophoresis of 16S
rDNA partial sequence
2.3摇 PCR产物的变性梯度凝胶电泳
样品细菌种群的 16S rDNA PCR 产物的变性梯
度凝胶电泳分析结果如图 2。
图 2摇 不同发花段细菌 16S rDNA鄄PCR产物 DGGE图谱
Fig. 2 摇 Bacterial 16SrDNA鄄PCR product of DGGE map in
different pile鄄fermentation stage
从左至右上样顺序:H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8;图中 1—20
分别代表 2.4中回收测序的条带
由图 2可知,在茯砖茶的发花过程中,16S rDNA
的V3高变区序列类型较为丰富,表1数据表明,多
样性指数 H在茶叶进入发花房发花的早期阶段(0—
2 d)略有降低,随后则稳定升高,在发花末期(14 d)
上升到最高水平 2.936。 均匀性指数 E 的变化波动
较小,同多样性指数 H 相似呈现初期略下降而后上
升的趋势。 丰度指数 S变化趋势则与多样性指数 H
基本对应,在样品 H6—H8中稳定为 20,说明随着茯
砖茶发花的进行,茶叶内细菌群落的数量是呈上升
趋势的,这和之前的研究者们对茯砖茶发花微生物
的检测结果有一定差异,推测是由于在之前茶叶中
微生物检测主要采用平板培养观察计数法,部分不
能被培养的细菌未能进入统计所致。 对于茯砖茶发
花过程中微生物的观察结果,文献检索表明主要集
中在散囊菌属和其他一些霉菌方面,许多研究者们
认为“茯砖茶内部独特的环境及营养组成最适合冠
突散囊菌生长,而于其他微生物生长不利冶,加上黑
毛茶本身具备一定抑菌作用[22],从而简单的推测茯
砖茶发花过程中较少有细菌生长代谢的观念,实验
证明细菌在发花过程中始终存在,而且发花后期细
菌的群落结构趋向稳定,因而忽略细菌在茶叶中的
作用,这种观念存在一定的局限性。
由图 3的主成分分析(PCA)可知,H1、H2 分布
在第二象限;H3、H4分布在第二象限;H6、H7、H8 分
布在第一象限,H5 单独分布在第三象限,而由图 4
的带型进化树也验证了这种变化,H1、H2、H3 相似
性较近;H4、H5 相似性较近;H6、H7、H8 相似性较
近,这说明在 14 d的发花过程中,细菌种群的构成变
化较大,分别在发花的 0—4 d、6—8 d、10—14 d茶叶
内存在着 3 个差异较大的细菌优势种群结构的演
变。 推测是在茶叶经过高温气蒸压制后,一部分耐
热的细菌以芽孢的方式存活了下来并在茶叶内生长
繁殖,而从发花的第 3—4 天起,随着冠突散囊菌为
主导的散囊菌属微生物快速生长,而冠突散囊菌的
代谢产物对部分细菌具备一定抑制作用[23],这使得
受到拮抗作用的菌群慢慢消失,而取代以能与冠突
散囊菌共生的细菌构建优势群落。 同时,随着发花
过程的进行,烘房温度升高,茯砖茶内水分含量越来
越低(由初期的 24%—26 %到结束时的 12 %以下).
这些也影响了茶叶内细菌结构组成,使得细菌种群
结构向更耐高温、干燥的趋势变化。
0103 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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表 1摇 不同发花阶段细菌群落特征
Table 1摇 Characteristics of bacterial community in different Fahua-fermentation stage
样品编号
Number of samples
发花时间 / d
Fahua鄄fermentation stage
多样性指数 H
Shannon鄄Wiener Index
均匀性指数 E
Evenness
丰度指数 S
Richness
H1 0d 2.781 0.962 18
H2 2d 2.771 0.959 18
H3 4d 2.844 0.966 19
H4 6d 2.846 0.967 19
H5 8d 2.858 0.971 19
H6 10d 2.896 0.967 20
H7 12d 2.924 0.976 20
H8 14d 2.936 0.980 20
图 3摇 不同发花阶段主成分分析(PCA)分析
Fig. 3 摇 Principal Component Analysis ( PCA ) in different
Fahua鄄fermentation stage
图 4摇 不同发花阶段进化树
Fig.4摇 Evolution tree of different Fahua鄄fermentation stage
2.4摇 DGGE凝胶条带回收测序及序列分析
DGGE凝胶条带回收后,以 338F / 518R 为引物
进行 PCR 扩增,获得约 200 bp 的 DNA 片段。 PCR
产物纯化后连接到 pEASY鄄T 载体上,转化至 DH5琢
感受态细胞中,筛选阳性克隆测序。 测序结果递交
GenBank数据库,并于 GenBank 中的序列进行比对,
得到不同条带所代表的不同细菌类型。 每个回收条
带选取 3 个克隆进行重复检验比较,编号 band1、
band2、band3、¼、band20 表示图 2 中位置 1—20 条
带进行了序列测定,将序列提交到 GenBank 数据库,
在 GenBank中使用 Blast程序进行同源性比较,获得
最相似典型菌株的 16S rDNA序列如表 2 所示,根据
这些 DGGE带谱所代表的微生物即可判定茯砖茶不
同发花阶段细菌群落的组成状况。
一般情况下认为,两种细菌 16S rDNA 序列同源
性小于 98%时属于不同种,而同源性小于 93%—
95%时,则属于不同的属[24],因此,从比对结果可以
获知, 在茯砖茶发花过程中有短波单胞菌属
(Brevundimonas aurantiaca)、诺卡氏菌属 (Millisia
brevis)、新鞘脂菌属(Novosphingobium sp)、突那梭菌
属 ( Clostridium ultunense )、 韦 龙 氏 假 单 胞 菌 属
( Pseudomonas veronii )、 乳 杆 菌 属 ( Lactobacillus
plantarum KC965107; Lactobacillus plantarum
KC845197)、 克雷伯氏菌属 ( Klebsiella pneumonia
KC609741;Klebsiella pneumoniae KC431795;Klebsiella
sp. XC鄄08 ) 以及不可培养 着鄄变形菌 ( Uncultured
epsilon proteobacterium)、不可培养腐败螺旋菌属
(Uncultured Saprospiraceae bacterium)、不可培养粘球
菌属(Uncultured Myxococcales bacterium)、不可培养
根瘤菌属(Uncultured Rhizobiales bacterium)和未知分
类地 位 的 不 可 培 养 细 菌 Uncultured bacterium
( HE860554 )、 Uncultured bacterium ( GQ866159 )、
Uncultured bacterium ( KC304531 )、 Uncultured
bacterium ( HQ889765 )、 Uncultured bacterium
(HE663286)、Uncultured bacterium(JQ383874)六种。
在检测到的 20 种细菌当中,诺卡氏菌[25]实验
证明能分泌生物活性成分,对增强机体免疫功能有
着一定的作用,具有抗病原微生物感染及明显的抑
肿瘤作用,新鞘脂菌[26]属等能降解呋喃丹,短波单
1103摇 11期 摇 摇 摇 刘石泉摇 等:基于 DGGE技术的茯砖茶发花过程细菌群变化分析 摇
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胞菌[27]能产 L鄄脯氨酸,植物乳杆菌[28]可产生有机
酸,此外还能产生多种酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶
等,显然对茯砖茶发花过程中 pH值变化及茶叶风味
和品质的形成起着重要作用。
发花在茯砖茶的生产工艺中又被称为“第二次
发酵冶,在之前茶叶原料还有着一次发酵过程即“渥
堆冶,渥堆之后的茶叶内成分得到微生物初步降解,
茶叶纤维被软化,并且一些微生物在茶叶内开始形
成优势种群,有利于之后的发花。 温琼英等[29]对茯
砖茶渥堆中微生物多样性进行检测,认为主要存在
的细菌包括无芽孢小杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌、金黄
色葡萄球菌等,且在渥堆的初期还有大量其他细菌
存在,由于当时技术条件限制未能精确鉴定到种。
而方祥、赵龙飞等[30鄄31]对同属黑茶的普洱茶渥堆过
程中微生物的检测结果显示,乳杆菌属、芽孢杆菌
属、短杆菌属、球菌属都是普洱茶发酵中的常见微生
物,其中芽孢杆菌属的细菌能产生丰富的多酚氧化
酶和过氧化物酶等,有利于缩短发酵时间及提高产
品品质。 通过与本次检测的结果对比可知,茶叶无
论是在渥堆发酵还是发花过程中细菌的群落构成均
较为丰富,且其中一部分渥堆细菌并未因为气蒸压
制而完全失去活力,而是通过芽孢等休眠状态过渡
到发花阶段继续生长繁殖。
付秀娟[32]从自然发酵的普洱茶内分离出了两
株细菌 B鄄04、B鄄07,并制成发酵菌液用于接种发酵普
洱茶,结果显示,两种细菌单菌种发酵的普洱茶内茶
褐素、茶多酚、咖啡碱均有一定程度降低,且 B鄄07 分
泌的果胶酶在发酵初期时活性较高,证明细菌在茶
叶发酵过程中具有一定的积极意义。
另外,本次研究中也发现茶叶中存在克雷伯氏
菌、短波单胞菌、假单胞菌和粘球菌等,姚静[33]等也
曾在普洱茶中分离了类似细菌,这些微生物通常被
认为是条件致病菌,可感染人和动物使其患病,既然
能在茯砖茶发花过程样品中却被检出,那么说明它
们对于茯砖茶发花肯定有一定影响,但对茶叶品质
的利弊、以及具体作用机理还有待进一步研究。
表 2摇 DGGE凝胶条带回收序列分析结果
Table 2摇 The analysis results of DGGE gel bands recovery sequence
编号
Number
相似菌
Similar strain
相似度
Similarity
登录号
Accession number
分类
Classification
Band1 Millisia brevis(诺卡氏菌属) 99 NR042952 Actinobacteria(放线菌门)
Band2 Uncultured Myxococcales bacterium(不可培养粘球菌属) 99 AM936499 Proteobacteria(变形菌门)
Band3 Novosphingobium sp. (新鞘脂菌属) 100 HF936984 Proteobacteria(变形菌门)
Band4 Brevundimonas aurantiaca(短波单胞菌属) 100 KC855474 Proteobacteria(变形菌门)
Band5 Uncultured bacterium(不可培养细菌) 99 GQ866159 -
Band6 Uncultured bacterium(不可培养细菌) 98 HE860554 -
Band7 Pseudomonas veronii(韦龙氏假单胞菌属) 99 HQ825038 Proteobacteria(变形菌门)
Band8 Uncultured epsilon proteobacterium(不可培养 着鄄变形菌) 99 AY191496 Proteobacteria(变形菌门)
Band9 Uncultured Saprospiraceae bacterium(不可培养腐败螺旋菌属) 91 EU283496 Bacteroidetes(拟杆菌门)
Band10 Uncultured bacterium(不可培养细菌) 99 KC304531 -
Band11 Clostridium ultunense(突那梭菌属) 99 GQ461825 Firmicutes(厚壁菌门)
Band12 Klebsiella pneumonia(克雷伯氏菌属) 99 KC609741 Proteobacteria(变形菌门)
Band13 Uncultured bacterium(不可培养细菌) 99 JQ383874 -
Band14 Uncultured bacterium(不可培养细菌) 99 HQ889765 -
Band15 Uncultured Rhizobiales bacterium(不可培养根瘤菌属) 100 JQ401320 Proteobacteria(变形菌门)
Band16 Klebsiella pneumoniae(克雷伯氏菌属) 99 KC431795 Proteobacteria(变形菌门)
Band17 Klebsiella sp. XC鄄08(克雷伯氏菌属) 100 KC787534 Proteobacteria(变形菌门)
Band18 Lactobacillus plantarum(乳杆菌属) 100 KC965107 Firmicutes(厚壁菌门)
Band19 Uncultured bacterium(不可培养细菌) 99 HE663286 -
Band20 Lactobacillus plantarum(乳杆菌属) 99 KC845197 Firmicutes(厚壁菌门)
摇 摇 16S rDNA 的 V3高变区序列进行聚类分析,结果如图 5
2103 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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图 5摇 20个条带建立的进化树
Fig.5摇 Evolution tree of 20 band
3摇 讨论
本研究通过 DGGE技术对黑毛茶发花发酵中不
同时间段的细菌群落结构进行分析,发现发花过程
中细菌种类较为丰富,在比对出的细菌种类中,
Proteobacteria(变形菌门)9 株、Firmicutes(厚壁菌门)
3株、Actinobacteria(放线菌门)1 株、Bacteriodetes(拟
杆菌门)1株,还有六株不可培养菌株(表 2),并且群
落呈现较为规律的变化,三类差异较大细菌群落分
别在发花的 0—4d、6—8d、10—14d 之间出现,通过
对比茯砖茶中优势微生物冠突散囊菌的生长曲
线[34],可以发现早期的细菌群落随着冠突散囊菌的
生长而受到抑制,而后期细菌与冠突散囊菌基本保
持共生关系,细菌总数量随着发花的进行略有上升。
其中有一部分细菌如放线菌、乳杆菌是存在于茯砖
茶或普洱茶渥堆过程中的常见微生物,而另外一部
分如克雷伯氏菌、短波单胞菌等在传统培养方法中
都未曾检出过,因此 DGGE指纹图谱在此更全面、更
真实地反映了茯砖茶发花过程中细菌群落的结构和
多样性变化。 在利用现代分子技术解析茯砖茶发花
细菌结构的基础上,进一步对细菌区系及其相互协
同制约的代谢机制、以及与茯砖茶品质之间的具体
的关系有望成为今后黑茶研究的重点方向。
茯砖茶因其保健功效作为当代黑茶市场的新
宠,发酵技术水平是决定其品质高低的重要因素,发
酵相关微生物的研究深入,能更好的人工调控发酵
工艺、进一步完善产品品质。 以往由于细菌在茯砖
茶的发酵过程中数量相对真菌处于劣势地位,再加
上检测手段的限制,而被研究者们所忽视,我们的实
验证实,细菌在发花过程中大量而且始终存在,我们
要在茯砖茶精控发酵中取得进一步进展,就必须重
视不同细菌在发酵过程中的作用,根据细菌种类和
作用的程度,以不同条件加以控制,充分发挥有益菌
种的协同作用,减少或杜绝有害菌的生长,并利用有
益菌种的生物转化作用改善茯砖茶品质,提高发花
效率,将茯砖茶制造技术提高到一个新的水平。
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5103摇 11期 摇 摇 摇 刘石泉摇 等:基于 DGGE技术的茯砖茶发花过程细菌群变化分析 摇
粤悦栽粤 耘悦韵蕴韵郧陨悦粤 杂陨晕陨悦粤 灾燥造援猿源袁晕燥援员员 允怎灶藻袁圆园员源渊杂藻皂蚤皂燥灶贼澡造赠冤
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砸藻增蚤藻憎 燥灶 皂葬糟则燥责燥则藻 枣造燥憎 蚤灶 泽燥蚤造 郧粤韵 在澡葬燥曾蚤葬袁载哉 载怎藻曾怎葬灶袁在匀粤韵 允蚤葬燥灶葬袁 藻贼 葬造 渊圆愿园员冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
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郧粤韵 再葬袁 蕴哉 在澡葬燥澡怎葬袁宰耘陨 在澡藻灶噪怎葬灶袁藻贼 葬造 渊圆愿源源冤
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燥责藻灶 责蚤贼 糟燥葬造 皂蚤灶蚤灶早 运粤晕郧 杂葬则怎造葬袁 晕陨哉 允蚤葬灶皂蚤灶早袁 在匀粤晕郧 匝蚤灶早袁 藻贼 葬造 渊圆愿缘缘冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
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粤怎贼藻糟燥造燥早赠 驭 云怎灶凿葬皂藻灶贼葬造泽
悦葬贼葬遭葬贼蚤糟 藻枣枣藻糟贼 枣则燥皂 葬则贼蚤枣蚤糟蚤葬造 皂蚤曾藻凿 责造葬灶贼葬贼蚤燥灶 燥枣 悦怎灶灶蚤灶早澡葬皂蚤葬 造葬灶糟藻燥造葬贼葬 燥灶 泽燥蚤造 葬造怎皂蚤灶怎皂 贼燥曾蚤糟蚤贼赠
蕴耘陨 月燥袁 蕴陨哉 月蚤灶袁 蕴哉韵 悦澡藻灶早凿藻袁 藻贼 葬造 渊圆愿愿源冤
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蕴陨晕 允蚤葬灶袁 蕴陨哉 宰藻灶遭燥袁 酝耘晕郧 在澡葬燥躁怎灶袁 藻贼 葬造 渊圆怨苑愿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
孕燥责怎造葬贼蚤燥灶袁 悦燥皂皂怎灶蚤贼赠 葬灶凿 耘糟燥泽赠泽贼藻皂
杂燥蚤造 皂蚤糟则燥遭蚤葬造 糟燥皂皂怎灶蚤贼赠 泽贼则怎糟贼怎则藻 怎灶凿藻则 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 增藻早藻贼葬贼蚤燥灶 则藻泽贼燥则葬贼蚤燥灶 责葬贼贼藻则灶泽 蚤灶 贼澡藻 造燥藻泽泽 澡蚤造造赠 葬则藻葬
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蕴陨哉 杂澡蚤择怎葬灶袁匀哉 在澡蚤赠怎葬灶袁 在匀粤韵 再怎灶造蚤灶 渊猿园园苑冤
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悦葬则遭燥灶 泽藻择怎藻泽贼则葬贼蚤燥灶 责燥贼藻灶贼蚤葬造 燥枣 贼澡藻 皂葬躁燥则 泽贼葬灶凿泽 怎灶凿藻则 贼澡藻 郧则葬蚤灶 枣燥则 郧则藻藻灶 孕则燥早则葬皂 蚤灶 杂燥怎贼澡憎藻泽贼 悦澡蚤灶葬 蚤灶 贼澡藻 灶藻曾贼 缘园 赠藻葬则泽
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蕴陨 郧怎葬灶早赠燥灶早袁 蕴陨 载蚤葬燥赠葬灶袁 在匀粤韵 郧怎燥择蚤灶袁 藻贼 葬造 渊猿园猿愿冤
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孕粤晕 蕴藻蚤袁 载陨粤韵 宰藻灶枣葬袁栽粤晕郧 宰葬灶责藻灶早袁藻贼 葬造 渊猿园远源冤
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粤泽泽藻泽泽皂藻灶贼 燥灶 糟燥燥则凿蚤灶葬贼蚤增藻 葬遭蚤造蚤贼赠 燥枣 泽怎泽贼葬蚤灶葬遭造藻 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 月藻蚤躁蚤灶早鄄栽蚤葬灶躁蚤灶鄄匀藻遭藻蚤 砸藻早蚤燥灶 遭葬泽藻凿 燥灶 泽藻贼 责葬蚤则 葬灶葬造赠泽蚤泽
栽粤晕 云藻蚤枣藻蚤袁 在匀粤晕郧 酝藻灶早袁 蕴陨 匀葬燥则葬灶袁 藻贼 葬造 渊猿园怨园冤
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匀哉粤晕郧 在澡蚤择蚤葬灶早袁 蕴哉 蕴蚤灶袁 阅粤陨 晕蚤葬灶澡怎葬袁 藻贼 葬造 渊猿园怨怨冤
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叶生态学报曳圆园员源年征订启事
叶生态学报曳是由中国科学技术协会主管袁中国生态学学会尧中国科学院生态环境研究中心主办的生态学
高级专业学术期刊袁创刊于 员怨愿员年袁报道生态学领域前沿理论和原始创新性研究成果遥 坚持野百花齐放袁百家
争鸣冶的方针袁依靠和团结广大生态学科研工作者袁探索生态学奥秘袁为生态学基础理论研究搭建交流平台袁
促进生态学研究深入发展袁为我国培养和造就生态学科研人才和知识创新服务尧为国民经济建设和发展服务遥
叶生态学报曳主要报道生态学及各分支学科的重要基础理论和应用研究的原始创新性科研成果遥 特别欢
迎能反映现代生态学发展方向的优秀综述性文章曰研究简报曰生态学新理论尧新方法尧新技术介绍曰新书评价和
学术尧科研动态及开放实验室介绍等遥
叶生态学报曳为半月刊袁大 员远开本袁圆愿园页袁国内定价 怨园元 辕册袁全年定价 圆员远园元遥
国内邮发代号院愿圆鄄苑袁国外邮发代号院酝远苑园
标准刊号院陨杂杂晕 员园园园鄄园怨猿猿摇 摇 悦晕 员员鄄圆园猿员 辕 匝
全国各地邮局均可订阅袁也可直接与编辑部联系购买遥 欢迎广大科技工作者尧科研单位尧高等院校尧图书
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通讯地址院 员园园园愿缘 北京海淀区双清路 员愿号摇 电摇 摇 话院 渊园员园冤远圆怨源员园怨怨曰 远圆愿源猿猿远圆
耘鄄皂葬蚤造院 泽澡藻灶早贼葬蚤曾怎藻遭葬燥岳 则糟藻藻泽援葬糟援糟灶摇 网摇 摇 址院 憎憎憎援藻糟燥造燥早蚤糟葬援糟灶
编辑部主任摇 孔红梅摇 摇 摇 执行编辑摇 刘天星摇 段摇 靖
生摇 态摇 学摇 报渊杂匀耘晕郧栽粤陨摇 载哉耘月粤韵冤渊半月刊摇 员怨愿员年 猿月创刊冤
第 猿源卷摇 第 员员期摇 渊圆园员源年 远月冤
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编摇 摇 辑摇 叶生态学报曳编辑部
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电话院渊园员园冤远圆怨源员园怨怨憎憎憎援藻糟燥造燥早蚤糟葬援糟灶泽澡藻灶早贼葬蚤曾怎藻遭葬燥岳 则糟藻藻泽援葬糟援糟灶
主摇 摇 编摇 王如松
主摇 摇 管摇 中国科学技术协会
主摇 摇 办摇 中国生态学学会
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