全 文 ：第 35 卷第 19 期
2015年 10月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.19
Oct.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(41171217, 41322007)
收稿日期:2014鄄02鄄26; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄12鄄04
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: zhanglm@ rcees.ac.cn
DOI: 10.5846 / stxb201402260329
张苗苗,王伯仁,李冬初,贺纪正,张丽梅.长期施加氮肥及氧化钙调节对酸性土壤硝化作用及氨氧化微生物的影响.生态学报,2015,35(19):
6362鄄6370.
Zhang M M, Wang B R, Li D C, He J Z, Zhang L M.Effects of long鄄term N fertilizer application and liming on nitrification and ammonia oxidizers in acidic
soils.Acta Ecologica Sinica,2015,35(19):6362鄄6370.
长期施加氮肥及氧化钙调节对酸性土壤硝化作用及氨
氧化微生物的影响
张苗苗1,2,王伯仁3,李冬初3,贺纪正1,张丽梅1,*
1 中国科学院生态环境研究中心, 北京摇 100085
2 中国科学院大学, 北京摇 100049
3 中国农业科学院农业部祁阳红壤生态环境重点野外科学观测试验站, 永州摇 426100
摘要:以长期施加氮肥及添加氧化钙调节的酸性土壤为研究对象,运用定量 PCR和 DGGE技术,探讨了土壤氨氧化微生物及硝
化作用对不同施肥处理及氧化钙调节的响应。 长期施化学氮肥导致酸性土壤 pH(KCl)值(3.35—3.47)和硝化潜势(0.02—0.14
滋g NO-2 鄄N g
-1土壤 h-1)进一步降低,而添加 CaO后土壤酸化得以缓解(pH值 4.10—4.46),土壤硝化潜势(0.22—0.34 滋g NO-2 鄄N
g-1土 h-1)显著增加。 同时,添加 CaO处理对氨氧化古菌(AOA)的群落结构无明显影响,但明显提高了各施肥处理土壤中氨氧
化细菌(AOB)的群落多样性,加 CaO处理的土壤中,AOA的数量降低而 AOB的数量增加。 这些结果表明虽然酸性土壤中 AOA
在数量和活性上占主导优势,AOB在功能上冗余,但当添加 CaO后,AOA和 AOB对环境变化迅速作出响应,并根据其不同的生
态位需求重新分配优势地位,二者交替作用共同驱动酸性土壤硝化作用。
关键词:酸性土壤; 氧化钙调节; 硝化作用; 氨氧化古菌(AOA); 氨氧化细菌(AOB)
Effects of long鄄term N fertilizer application and liming on nitrification and
ammonia oxidizers in acidic soils
ZHANG Miaomiao1,2, WANG Boren3, LI Dongchu3, HE Jizheng1, ZHANG Limei1,*
1 Research Center for Eco鄄Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
3 Red Soil Experimental Station (Qiyang, Hunan province), the Ministry of Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Yongzhou 426100, China
Abstract: High levels of N fertilization and acid deposition could cause soil acidification directly and indirectly. The
nitrogen cycle, especially nitrification, makes a great contribution to the acidification of agricultural soils across China,
which further leads to the mobilization of potentially toxic metals such as aluminum ( Al) and manganese ( Mn) and
decerases crop yields. Chemicals ( e. g., CaO) are amended as soil conditioners to relieve soil acidification. Ammonia
oxidation, the rate鄄limiting step in the nitrification process, is driven by ammonia鄄oxidizing bacteria (AOB) and ammonia鄄
oxidizing archaea (AOA). Increasing evidence demonstrates that pH is one of the most important factors determining the
niche separation of AOA and AOB, and AOA play the more important role in nitrification of acidic soils. However,
abundant AOB have been detected in acidic soils but little is known about their ecological function. In this study, the effects
of long鄄term N fertilization practices and liming on nitrification and ammonia oxidizers in acidic soils were investigated using
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quantitative PCR and DGGE methods combined with soil physiochemical analysis. Compared with a previous study
conducted 6 years ago at the same site, N fertilizer application without liming further decreased soil pH (3.35—3.47) and
potential nitrification rate (PNR) (0.02—0.14 滋g NO-2 鄄N g
-1 soil h-1), while 2 years liming alleviated soil acidification
(pH 4.10—4.46) and increased PNR (0.22—0.34 滋g NO-2 鄄N g
-1 soil h-1) significantly. There was a significantly positive
correlation between soil pH and PNR, indicating the increase in soil pH via liming had positive effects on nitrification in
acidic soils. AOA amoA gene copy numbers ( 7. 40 伊 107—4. 08 伊 108 copies / g) were significantly higher than their
counterpart AOB (1.67 伊 106—2.57 伊 107 copies / g) in soils that received different chemical N fertilizers. Ratios of AOA
and AOB amoA gene abundance ranged between 10. 9 and 44. 3. After amending lime for two years in the N fertilizers
treatment plots, AOA amoA gene copy numbers (8.23 伊 106—4.89 伊 107 copies / g) decreased to a certain degree but AOB
amoA gene copy numbers (1. 99 伊 107—5.42 伊 107 copies / g) increased significantly compared to their corresponding
fertilization treatments without liming, resulting in lower ratios of AOA to AOB amoA gene abundance ( 0. 83—1.94).
Moreover, liming showed no clear influence on AOA community structure, but significantly increased AOB community
diversity. Taken together, these results indicate that although the activity and abundance of AOA was generally greater than
those of AOB in acidic soils, both AOA and AOB actively responded to disturbance in acidic soils based on their niche
differentiation and had different effects on nitrification of acidic soils.
Key Words: acidic soils; liming; nitrification; ammonia鄄oxidizing archaea (AOA); ammonia鄄oxidizing bacteria (AOB)
酸性土壤(pH <5.5)在我国分布面积广泛,是我国热带亚热带经济作物如茶树、林木、果树和粮食作物的
重要产地。 近几十年来,因化学氮肥的过量施用和酸沉降加剧,我国农田土壤的酸度逐步升高,面积也不断增
加[1]。 为了缓解土壤酸化,农业中常采用田间施加化学改良剂(如石灰(CaO))的方法来进行改良,效果
显著[2鄄3]。
硝化作用是土壤氮素转化的关键过程,除影响土壤中无机氮对植物的有效性外,硝化作用对酸性土壤进
一步酸化、有毒金属元素的溶解释放等都有重要影响[1, 4鄄6]。 氨氧化作用作为硝化作用的限速步骤,是全球氮
循环的中心环节,主要由氨氧化细菌(AOB) [7]和古菌(AOA) [8鄄10]驱动。 大量分子生态学调查发现,虽然多种
环境因子,包括温度、pH值、施肥、土壤类型及土地利用方式等都会影响两类氨氧化微生物的群落组成和数
量,但 pH值是影响其分布及功能活性的决定性因子。 已有研究发现,随着 pH值增加,AOA和 AOB群落组成
发生明显演替,AOA的数量和 amoA基因的表达活性显著降低,AOB 则呈相反趋势[11鄄15]。 2007 年,对湖南祁
阳红壤长期定位实验站连续 16a施加不同化学肥料处理土壤中的氨氧化细菌和古菌的群落组成进行了调查,
结果发现,长期施加无机氮肥显著降低了 AOA和 AOB的数量,并改变了 AOA的群落组成,但对 AOB 的群落
结构无显著影响,揭示了 AOA 可能在该酸性土壤硝化作用中起重要作用[16]。 通过稳定性同位素探测技术
(stable isotope probing, SIP)等的研究,也证实氨氧化古菌是一些酸性土壤硝化作用的主导者[17]。
以上研究揭示了氨氧化古菌对酸性土壤硝化作用的重要贡献,然而在多数酸性土壤中也能检测到数量相
当的氨氧化细菌,但对这些酸性土壤中氨氧化细菌的存在有何生态学意义并不清楚。 由于多年连续施肥,湖
南祁阳红壤定位施肥实验站长期接受施化学氮肥处理的土壤 pH 值持续下降,土壤肥力和生产力严重受阻,
该实验站于 2010年将原施氮肥(N)、氮钾肥(NK)、氮磷肥(NP)、氮磷钾肥(NPK)处理的小区划分出一半进
行添加氧化钙处理,以期通过添加氧化钙调节土壤 pH值,改善土壤质量。 本研究在 2007 年对该样地土壤研
究的基础上,对持续施肥 5a后以及添加 CaO处理对土壤硝化作用和氨氧化细菌和古菌的影响进行了跟踪研
究,以期为进一步认识酸性土壤硝化作用过程及其机制提供参考,为农田施肥及酸性土壤改良管理方式提供
指导依据。
3636摇 19期 摇 摇 摇 张苗苗摇 等:长期施加氮肥及氧化钙调节对酸性土壤硝化作用及氨氧化微生物的影响 摇
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1摇 材料和方法
1.1摇 样品采集
摇 摇 本研究中的土壤样品采集于湖南省祁阳红壤定位施肥实验站(26毅45忆N,111毅52忆E),该地属于典型的亚热
带季风气候,年平均气温 18 益,年降水量 1300 mm。 本实验共选择了 9个处理,包括 1990年开始的长期施肥
处理及 2010年开始的施加氧化钙(CaO)处理,具体情况如下:1)不施肥(Control),2)氮肥(N),3)氮钾肥
(NK),4)氮磷肥(NP),5)氮磷钾肥(NPK),6)氮肥加氧化钙(N+CaO),7)氮钾肥加氧化钙(NK+CaO),8)氮
磷肥加氧化钙(NP+CaO),9)氮磷钾肥加氧化钙(NPK+CaO)。 肥料用量为年施用 N 300 kg / hm2、P 2O5 120
kg / hm2、K2O 120 kg / hm2,N 颐P 2O5颐K2O比值为 1颐0.4颐0.4;氧化钙年施用量为 2550 kg / hm2。
样品采集于 2012年 7月,所采样品均为 0—20 cm 表层土壤。 每个处理小区取 3 个重复,每个重复分别
取 5个点混合而成。 样品于低温保存带回实验室后,剔除石砾和植物残根等杂物,过 2 mm筛处理,一部分保
存于 4 益冰箱用于土壤基本化学性质的测定,其余样品放置于-80 益保存,用于分子生态学实验分析。
1.2摇 土壤化学指标及硝化潜势测定
土壤 pH值的测定采用 1 mol / L KCl溶液以水土比 2.5颐1浸提,以 Delta 320 pH计(Mettler鄄Toledo,上海)测
定。 土壤 NH+4 鄄N 和 NO
-
3 鄄N 以 1 mol / L KCl 按水土比 5 颐 1 浸提后,用连续流动分析仪 ( SAN + +, Skalar,
Holland)测定。 所有样品均重复 3次测定。
土壤硝化潜势(PNR)测定采用氯酸盐抑制法[18]。 以水土比 4颐1 向 5 g 土壤中加入含 1 mmol / L (NH4) 2
SO4的磷酸盐缓冲液(NaCl 8.0 g / L, KCl 0.2 g / L, Na2HPO4 0.2 g / L, NaH2PO4 0.2 g / L; pH值 7.4),并加入 10
mmol / L KClO3溶液抑制亚硝酸盐的氧化。 土样于 25 益黑暗培养 24 h 后加入 5 mL 2 mol / L KCl 溶液浸提
NO-2。 NO
-
2 以 N鄄(1鄄萘基)鄄乙二胺显色,在 540 nm波长下测定。 所有样品均重复 3次。
1.3摇 土壤 DNA提取
土壤 DNA提取以 MoBio PowerSoilTM DNA(MO BIO laboratories, CA, US))试剂盒进行提取,称取 0.25 g
土壤按照试剂盒操作指南进行,并略加修改:细胞破碎在 FastPrep上进行,破碎速度为 5.0,时间为 45 s。 DNA
提取后于-20 益保存待用,所有 DNA均稀释 10倍用于下游实验。
1.4摇 定量 PCR分析
氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)定量 PCR 分析均采用 SYBR Green 法,反应在 iCycle iQ5(Bio鄄
Rad, USA)仪器上进行。 PCR反应体系为 25 滋L,包含 12.5 滋L 2 伊 SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa, Japan),10
滋mol / L正反向引物各 0.5 滋L,DNA模板 2 滋L,其余用 ddH2O补足至 25 滋L[19]。 定量 PCR所用的扩增引物及
反应条件见表 1。
1.5摇 变性梯度凝胶电泳分析
氨氧化微生物的群落结构分析采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)法,DGGE 在 DCode Universal Mutation
Detection System (Bio鄄Rad, USA)中进行。 AOA amoA 基因 PCR 扩增体系为 25 滋L,其中包括 12.5 滋L 2 伊
Premix Ex TaqTM(TaKaRa, Japan),10 滋mol / L正反向引物各 0.5 滋L,DNA模板 2 滋L,其余用 ddH2O补足至 25
滋L。 AOB amoA基因扩增体系除 10 滋mol / L正反向引物用量为 0.4 滋L外,其余与 AOA amoA反应体系相同。
DGGE鄄PCR反应的扩增引物及反应条件如表 1 所示。 DGGE 电泳在 6%聚丙烯酰胺胶中进行,AOA amoA 基
因所用的变性胶浓度范围为 10%—45%,电泳条件为 90 V,12 h。 AOB amoA 基因变性胶浓度范围为 30%—
55%,电泳条件为 120 V,8 h。 每个处理选取两个重复进行 DGGE分析。
1.6摇 统计分析
本研究中所有相关分析均采用 Pearson相关分析;添加 N与 N+CaO、NK与 NK+CaO、NP 与 NP+CaO、NPK
与 NPK+CaO各组处理间的差异性分析采用成对数据 T检验分析;多组数据间的方差分析采用单因素方差分
析 ANOVA。 所有统计检验均用 SPSS 19实现,P<0.05 即认为差异显著。 DGGE 图谱的聚类分析以 Quantity
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One软件读取条带后以 UPGMA方法进行。
表 1摇 定量 PCR及 DGGE鄄PCR中所用引物及反应程序
Table 1摇 Primers and reaction conditions used for Real鄄time PCR and PCR for DGGE
目标群落及用途
Target group and
purpose
引物
Primer
序列
Sequence
反应程序
Thermal program
参考文献
Reference
AOB定量 PCR
AOB Quantitative amoA鄄1F GGGGTTTCTACTGGTGGT
95 益预变性 1 min;95 益变性 10 s,55
益退火 30 s,72 益延伸 1 min,共 40 [20]
PCR amoA鄄2R CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC 个循环;72 益 30 s后,在 83 益读盘 15 s
AOB
DGGE鄄PCR amoA鄄1F鄄GC
CGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG鄄
GCGGGGTTTCTACTGGTGGT
95 益预变性 3 min;95 益变性 30 s,62
益退火 45 s,72 益延伸 1 min,之后每个
循环退火温度降低0 . 5益 ,共10个循
[19]
amoA鄄2R CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC
环;95 益变性 30 s,57 益退火 45s,72 益
延伸 1 min,共 30 个循环;72 益 延伸
10 min
AOA定量 PCR
AOA Quantitative
PCR
Arch鄄amoAF STAATGGTCTGGCTTAGACG
95 益预变性 1 min;95 益变性 10 s,53
益退火 30s,72 益延伸 1 min,共 40个循
环;72 益延伸 1 min
[21]
Arch鄄amoAR GCGGCCATCCATCTGTATGT
AOA
DGGE鄄PCR CrenamoA鄄23f ATGGTCTGGCTWAGACG
95 益预变性 1 min;94 益变性 30 s,55
益退火 30 s,72 益延伸 1 min,共 10 个
循环;92 益变性 30 s,55 益退火 30 s,
[17]
CrenamoA鄄616r GCCATCCATCTGTATGTCCA
72 益延伸 1 min,共 25个循环;72 益延
伸 10 min
2摇 结果
2.1摇 土壤化学性质及硝化潜势(PNR)
各土样的基本化学性质及硝化潜势如表 2所示。 与对照 Ctrol土壤相比,所有施肥处理的土壤 pH(KCl)降
低(3.35—3.47)。 成对数据 T 检验结果显示,添加 CaO 后,土壤 pH(KCl)显著升高(4.10—4.46) ( t>14, P<
0.05)。 所有处理土壤中 NH+4 鄄N含量无显著差异,施加 N、NK、NP 肥处理中 NO
-
3 鄄N 含量(11.66—12.93 mg /
kg)显著高于其他处理土壤(0.63—2.27 mg / kg),NPK+CaO 及 Ctrol 土壤中 NO-3 鄄N 含量最低,分别为 0.63 和
0.69 mg / kg。
表 2摇 土样的基本化学性质及硝化潜势(依标准误差)
Table 2摇 Basic chemical properties and potential nitrification rates of sampled soils (依standard error)
处理
Treatment
pH(KCl)
NH+4 鄄N /
(mg / kg)
NO-3 鄄N /
(mg / kg)
硝化潜势(PNR)
Potential nitrification rate (PNR) /
(滋g NO-2 鄄N g-1土 h-1)
Ctrol 4.43 10.88依0.57a 0.69依0.19a 0.44依0.02h
N 3.35 19.86依3.08a 12.93依0.34d 0.02依0.00a
NK 3.41 14.44依2.01a 12.46依0.56cd 0.09依0.00c
NP 3.42 13.30依0.43a 11.66依0.0.49c 0.06依0.00b
NPK 3.47 6.75依0.48a 1.94依0.40ab 0.14依0.00d
N+CaO 4.10 8.81依0.24a 1.08依0.18ab 0.27依0.00f
NK+CaO 4.46 6.87依0.56a 2.27依0.26b 0.22依0.01e
NP+CaO 4.15 12.05依1.20a 1.21依0.19ab 0.34依0.01g
NPK+CaO 4.31 13.37依1.36a 0.63依0.12ab 0.29依0.00f
摇 摇 不同字母表示处理之间的差异显著性
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土壤硝化潜势在各施肥处理间具有显著差异。 其中,Ctrol土壤的硝化潜势(0.44 滋g NO-2 鄄N g
-1土 h-1)最
高,其次为 NP+CaO(0.34 滋g NO-2 鄄N g
-1土 h-1),NPK+CaO(0.29 滋g NO-2 鄄N g
-1土 h-1)和 N+CaO(0.27 滋g NO-2 鄄
N g-1土 h-1)。 添加 CaO 处理土壤(N+CaO, NK+CaO, NP+CaO, NPK+CaO)的硝化潜势(0.22—0.34 滋g NO-2 鄄
N g-1土 h-1)均显著高于其对应的施肥处理土壤(0.02—0.14 滋g NO-2 鄄N g
-1土 h-1)。 土壤硝化潜势与土壤
pH(KCl)呈显著正相关( r= 0.78, P<0.05)。 这些结果表明添加 CaO,在提高土壤 pH 值的同时显著增加了土壤
硝化活性。
摇 图 1摇 不同氮肥处理及氧化钙(CaO)调节处理土壤中氨氧化细菌
(AOB)和氨氧化古菌(AOA)amoA基因丰度
Fig.1摇 Abundance of archaeal and bacterial amoA gene in soils
under different N fertilizers and CaO treatments
依标准误差;不同大写字母表示 AOA丰度在各处理之间的差异显
著性,不同小写字母表示 AOB丰度在各处理之间的差异显著性
2.2摇 氨氧化微生物的丰度变化
利用实时荧光定量 PCR技术对各处理土壤中的氨
氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的 amoA 基因丰
度进行了分析,结果如图 1所示。 成对数据 T检验分析
结果显示,在所有未加 CaO 的处理中,AOA amoA 基因
的丰度均显著高于 AOB ( P < 0. 05),二者的比值为
10.9—44.3。 添加 CaO 后,AOA 丰度在一定程度上降
低,AOB丰度显著增加(P<0.05),使得 AOA 和 AOB 二
者基因丰度相当,无显著差异,其比值降低至 0. 83—
1.94。 在所有处理中,对照土壤 AOA 丰度最高(1.39伊
109 copies / g),N+CaO 土壤 AOA 丰度最低(5.31伊107
copies / g);NPK+CaO处理土壤中 AOB丰度最高(2.42伊
108 copies / g),N 肥处理土壤中 AOB 丰度最低(3.34伊
106 copies / g)。 另外,土壤硝化潜势与土壤中 AOA 和
AOB amoA基因丰度均无显著相关关系,但与 AOA 和
AOB amoA基因丰度之和,即土壤中总 amoA 基因丰度
显著正相关( r= 0.40, P<0.05)。
2.3摇 氨氧化微生物的群落结构
氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的群落结构以 PCR鄄DGGE 方法进行分析,结果发现所有处理均
容易获得足量的 AOA PCR产物用于 DGGE电泳。 DGGE图谱及其对应条带的聚类分析结果显示,对照处理
Ctrol与其它施肥处理明显分开,单独成为一支,表明对照处理 Ctrol土壤中 AOA的群落结构与其它处理存在
明显差异;所有施肥处理中,N处理与其它处理明显分开,NP 和 NK,NPK+CaO和 NPK,NK+CaO、NP+ CaO和
N+CaO分别聚集成 3个小分支(图 2),表明 AOA的群落组成在这 3组处理中存在稍小差异。
而对 AOB来说,施加 CaO的所有处理均能获得足够的 PCR产物进行 DGGE 电泳分析,但尽管使用同样
的 PCR扩增条件,对照处理土壤 Ctrol及各施氮肥处理土壤中 AOB amoA基因 PCR扩增产物较弱甚至扩增不
出,在 DGGE图谱上仅得到一些随机条带;与不施加 CaO的处理相比,施加 CaO的所有处理中 AOB 的 DGGE
条带明显增加,并显示出较高的群落相似性,表明施加 CaO明显刺激了这部分氨氧化细菌的生长;此外,NPK
+CaO处理土壤比 N+CaO,NK+CaO,NP+CaO处理显示出更高的组成多样性(图 3)。 对 DGGE 图谱进行的聚
类分析的结果也显示,施 N 肥处理及对照处理与其它处理明显分开,其余处理聚积于一大分支,其中添加
CaO的 4个处理又聚积成一个小分支,且 NPK+CaO处理与 N+CaO,NK+CaO,NP+CaO相互分开(图 3)。
3摇 讨论
3.1摇 长期施肥处理及添加 CaO对土壤性质和硝化作用的影响
长期施加 N肥会导致土壤酸化,对于酸性土壤而言,进一步的土壤酸化则可能引起有毒金属元素(如
Al3+等)在土壤中的溶解性和迁移率增加,降低土壤质量及肥料利用率。 同时,土壤酸化还能溶解土壤中的一
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图 2摇 不同土壤中氨氧化古菌 amoA基因的 DGGE图谱及其 UPGMA聚类分析
Fig.2摇 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) profiles and the UPGMA dendrogram of ammonia鄄oxidizing archaeal amoA gene
in soils
图 3摇 不同土壤中氨氧化细菌 amoA基因 DGGE图谱及其 UPGMA聚类分析
Fig.3摇 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) profiles and the UPGMA dendrogram of ammonia鄄oxidizing bacterial amoA gene
in soils
些营养物质如钾、钙、镁等,使土壤的营养成分随降雨和灌溉流失,造成土壤贫瘠化,影响作物生长[5鄄6]。 于
2007年对该长期施肥实验站同样的处理小区进行的研究发现,与未施肥的对照土壤相比,在连续 16a 施 N肥
处理后,N、NP、NK、NPK处理土壤 pH(KCl)值显著降低(3.71—4.04),硝化潜势 PNR(0.26—0.99 滋g NO
-
2 鄄N g
-1
土 h-1)也显著低于对照土壤(1.49 滋g NO-2 鄄N g
-1土 h-1)。 在本研究中发现,又经过后续 6a 的持续施加 N 肥
后,这些施肥处理土壤的 pH(KCl)值进一步降低(3.35—3.47),硝化潜势 PNR也显著降低(0.02—0.14 滋g NO
-
2 鄄
N g-1土 h-1)。 但在连续 2a施加 CaO后,土壤 pH(KCl)值显著升高(4.10—4.46),硝化潜势 PNR(0.22—0.34 滋g
NO-2 鄄N g
-1土 h-1)也显著高于连续施肥土壤。 Pearson相关分析发现,土壤硝化潜势与土壤 pH 值呈显著正相
关,这说明在酸性土壤中,土壤 pH值的增加有利于土壤的硝化作用,这与之前的研究报道一致[11]。 土壤 pH
值与硝化作用的这种关系可能是因为,低 pH值不利于 NH3在土壤中的存留,大量的 NH3离子化生成 NH
+
4,造
成硝化作用底物不足的现象,故不利于硝化作用的进行。 但也有研究发现 pH<5 的土壤在 N 矿化速率很高
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时,土壤硝化速率也较高,这可能与土壤矿化作用、有机质含量及组成有关[22]。
3.2摇 氨氧化微生物对长期施氮肥及添加 CaO的响应
在所有施肥处理土壤中,氨氧化古菌 AOA amoA 基因(7.40伊107—4.08伊108copies / g)的丰度均显著高于
氨氧化细菌 AOB(1.67伊106—2.57伊107 copies / g),二者比值为 10.9—44.3,这与 2007年的调查结果一致,并与
其他有关酸性土壤中 AOA占主导优势的研究结论相符[23鄄26]。 已有的大量研究也表明,在大区域尺度上,pH
值是驱动氨氧化微生物多样性分布及活性的主要因子[12]。 Nicol 等[11]对 pH 值梯度为 4.9—7.5 的草地土壤
进行的研究发现,AOA与 AOB的数量比值随 pH值增加而降低,AOA的数量和 amoA基因的表达活性随土壤
pH值增加明显降低,而 AOB 则相反。 作者及国内其他研究者利用高通量测序技术及稳定性同位素探测
(SIP)等技术对我国一系列土壤开展的研究也发现,随土壤 pH值增加,AOA和 AOB群落组成发生明显演替;
在北方碱性潮土中,氨氧化细菌是硝化作用的主要驱动者,而在南方酸性土壤中,硝化作用主要由氨氧化古菌
所驱动[13, 17, 27鄄28]。 这些结果一致证实了 AOA和 AOB生态位分异的特征,即 AOB倾向于在高氮及 pH值中性
或碱性的环境中起主导作用,而 AOA则倾向于在酸性及低氮高有机质的土壤中占主导优势[29鄄32]。
本研究结果表明,当向这些施肥处理土壤中添加 CaO 后,AOA 丰度在一定程度上降低,AOB 则显著增
加,二者基因丰度比值降低到 0.83—1.94。 从群落结构上来看,与对照土壤相比,长期施肥明显改变了 AOA
的群落结构组成,但在 4个不同施氮肥处理及添加 CaO的处理之间无明显差异。 与此相反,在未添加 CaO的
施肥处理及不施肥的对照处理中,AOB丰度较低,较难获得用于 DGGE分析的 PCR扩增产物。 这些结果与之
前有关酸性土壤中氨氧化古菌在数量及活性方面均比氨氧化细菌占优势的结论一致。 AOA适应酸性条件的
可能原因包括:1)AOA对底物的亲和力约为 AOB的 200 倍,酸性土壤中氨离子化,多以 NH+4 形式存在,能供
给氨氧化所需要底物(NH3)浓度较低,AOA对氨的高亲和力使得其在低 pH值土壤中更具有竞争优势[33];2)
AOA具有独特的生物化学及遗传学特征,能够适应低 pH 及寡营养环境[34鄄35]。 但另一方面,在添加 CaO 后,
尽管土壤 pH值仍处于酸性条件(4.10—4.46),AOB 的丰度和群落多样性表现出显著增加,土壤硝化潜势也
显著增加,而 AOA的数量则受到一定程度的抑制,这表明虽然酸性土壤中 AOB在功能上冗余,但当环境条件
发生微小变化时,AOA和 AOB均会迅速作出响应,并根据其不同的生态位需求重新分配优势地位,二者共同
驱动土壤的硝化作用。 此外,虽然对照处理与添加 CaO 处理土壤的 pH 非常相近,且氨态氮和硝态氮含量也
非常相近,但对照处理中 AOB的丰度显著低于 CaO处理土壤,表明添加 CaO对 AOB 的刺激作用不完全是由
于 pH值的增加所导致,而可能是由于 pH增加导致土壤矿化作用增加而释放出更多可供利用的氨态氮,也可
能是由于 pH的增加导致作物地上生物量及作物根系分泌物增加,从而刺激了 AOB 的生长和硝化作用,其中
的微观机理有待进一步研究。
此外,还发现,NPK及 NPK+CaO土壤中 AOB和 AOA群落结构与其它处理土壤也有一定差异,这说明 P、
K也会影响土壤氮循环过程及氨氧化微生物,这与之前一些研究报道结果一致[36鄄37]。
4摇 结论
本研究对长期施加不同氮肥处理并添加 CaO调节的酸性红壤中硝化作用及氨氧化微生物的群落结构和
丰度特征进行了研究,结果发现,连续施加含氮肥料可导致土壤 pH值和硝化作用进一步降低,添加 CaO则可
缓解土壤酸化,显著提高土壤 pH值和硝化潜势。 AOA的群落组成在长期施肥处理与不施肥处理间有显著不
同,但在不同氮肥处理间无显著差异。 添加 CaO 处理对 AOA 的群落组成无显著影响,但明显提高了各施肥
处理土壤中氨氧化细菌的丰度,并增加了其群落多样性,氨氧化古菌的丰度受到一定程度的抑制。 这些结果
表明,虽然氨氧化古菌因自身的生理及遗传特征更适应在酸性土壤硝化作用中发挥作用,酸性土壤中 AOB 在
功能上冗余,但当添加 CaO后,AOA和 AOB对环境条件变化迅速作出响应,并根据其不同的生态位需求重新
分配优势地位,二者交替作用共同驱动着酸性土壤的硝化作用。
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