全 文 ：
摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 32 卷 第 13 期摇 摇 2012 年 7 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
砂质潮间带自由生活海洋线虫对缺氧的响应———微型受控生态系研究
华摇 尔,李摇 佳,董摇 洁,等 (3975)
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植物种群自疏过程中构件生物量与密度的关系 黎摇 磊,周道玮,盛连喜 (3987)………………………………
基于景观感知敏感度的生态旅游地观光线路自动选址 李继峰,李仁杰 (3998)…………………………………
基于能值的沼气农业生态系统可持续发展水平综合评价———以恭城县为例
杨摇 谨,陈摇 彬,刘耕源 (4007)
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内蒙古荒漠草原植被盖度的空间异质性动态分析 颜摇 亮,周广胜,张摇 峰,等 (4017)…………………………
典型草地的土壤保持价值流量过程比较 裴摇 厦,谢高地,李士美,等 (4025)……………………………………
长沙市区马尾松人工林生态系统碳储量及其空间分布 巫摇 涛,彭重华,田大伦,等 (4034)……………………
厦门市七种药用植物根围 AM真菌的侵染率和多样性 姜摇 攀 ,王明元 (4043)………………………………
Cd、低 Pb / Cd下冬小麦幼苗根系分泌物酚酸、糖类及与根际土壤微生物活性的关系
贾摇 夏,董岁明,周春娟 (4052)
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凉水保护区土壤产类漆酶鄄多铜氧化酶细菌群落结构 赵摇 丹,谷惠琦,崔岱宗,等 (4062)……………………
盐渍化土壤根际微生物群落及土壤因子对 AM真菌的影响 卢鑫萍,杜摇 茜,闫永利,等 (4071)………………
菌丝室接种解磷细菌 Bacillus megaterium C4 对土壤有机磷矿化和植物吸收的影响
张摇 林,丁效东,王摇 菲,等 (4079)
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闽江河口不同河段芦苇湿地土壤碳氮磷生态化学计量学特征 王维奇,王摇 纯,曾从盛,等 (4087)……………
高山森林三种细根分解初期微生物生物量动态 武志超,吴福忠,杨万勤,等 (4094)……………………………
模拟降水对古尔班通古特沙漠生物结皮表观土壤碳通量的影响 吴摇 林,苏延桂,张元明 (4103)……………
铁皮石斛组培苗移栽驯化过程中叶片光合特性、超微结构及根系活力的变化
濮晓珍,尹春英,周晓波,等 (4114)
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不同产量水平旱地冬小麦品种干物质累积和转移的差异分析 周摇 玲,王朝辉,李富翠,等 (4123)……………
基于作物模型的低温冷害对我国东北三省玉米产量影响评估 张建平,王春乙,赵艳霞,等 (4132)……………
黄土高原 1961—2009 年参考作物蒸散量的时空变异 李摇 志 (4139)……………………………………………
莫莫格湿地芦苇对水盐变化的生理生态响应 邓春暖,章光新,李红艳,等 (4146)………………………………
不同蚯蚓采样方法对比研究 范如芹,张晓平,梁爱珍,等 (4154)…………………………………………………
亚洲玉米螟成虫寿命与繁殖力的地理差异 涂小云,陈元生,夏勤雯,等 (4160)…………………………………
黑河上游天然草地蝗虫空间异质性与分布格局 赵成章,李丽丽,王大为,等 (4166)……………………………
苦瓜叶乙酸乙酯提取物对斜纹夜蛾实验种群的抑制作用 骆摇 颖,凌摇 冰,谢杰锋,等 (4173)…………………
长江口中国花鲈食性分析 洪巧巧,庄摇 平,杨摇 刚,等 (4181)……………………………………………………
基于线粒体控制区序列的黄河上游厚唇裸重唇鱼种群遗传结构 苏军虎,张艳萍,娄忠玉,等 (4191)…………
镉暴露对黑斑蛙精巢 ROS的诱导及其蛋白质氧化损伤作用机理 曹摇 慧,施蔡雷,贾秀英 (4199)……………
北方草地牛粪中金龟子的多样性 樊三龙,方摇 红,高传部,等 (4207)……………………………………………
合肥秋冬季茶园天敌对假眼小绿叶蝉和茶蚜的空间跟随关系 杨摇 林,郭摇 骅,毕守东,等 (4215)……………
植被、海拔、人为干扰对大中型野生动物分布的影响———以九寨沟自然保护区为例
张摇 跃,雷开明,张语克,等 (4228)
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基于社会网络分析法的生态工业园典型案例研究 杨丽花,佟连军 (4236)………………………………………
基于生命周期的户用沼气系统可用能核算———以广西恭城瑶族自治县为例
齐摇 静,陈摇 彬,戴摇 婧,等 (4246)
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专论与综述
水文情势与盐分变化对湿地植被的影响研究综述 章光新 (4254)………………………………………………
松嫩碱化草甸土壤种子库格局、动态研究进展 马红媛,梁正伟,吕丙盛,等 (4261)……………………………
一种新的景观扩张指数的定义与实现 武鹏飞,周德民,宫辉力 (4270)…………………………………………
研究简报
华山新麦草光合特性对干旱胁迫的响应 李摇 倩,王摇 明,王雯雯,等 (4278)……………………………………
美丽海绵提取物防污损作用 曹文浩,严摇 涛,刘永宏,等 (4285)…………………………………………………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*306*zh*P* ￥ 70郾 00*1510*37*
室室室室室室室室室室室室室室
2012鄄07
封面图说: 涵养水源———在长白山南坡的峭壁上,生长在坡面上的森林所涵养的水源还在汨汨地往下流个不停,深红色的落叶
掉在了苔藓上,这里已经是长白山的深秋了。 虽然雨季已经过去了很久,但是林下厚厚的枯枝落叶层、腐殖质层、苔
藓草本层所涵养的水分还在不间断地流淌,细细的水线在壁下汇成了溪、汇成了河。 涵养水源是森林的主要生态功
能之一。
彩图提供: 陈建伟教授摇 北京林业大学摇 E鄄mail: cites. chenjw@ 163. com
第 32 卷第 13 期
2012 年 7 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 32,No. 13
Jul. ,2012
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:浙江省新苗人才计划资助
收稿日期:2011鄄06鄄02; 摇 摇 修订日期:2011鄄09鄄28
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: XY_jia@ 163. com
DOI: 10. 5846 / stxb201106020739
曹慧,施蔡雷,贾秀英.镉暴露对黑斑蛙精巢 ROS的诱导及其蛋白质氧化损伤作用机理.生态学报,2012,32(13):4199鄄4206.
Cao H, Shi C L, Jia X Y. Toxicity mechanism of Cadmium鄄induced reactive oxygen species and protein oxidation in testes of the frog Rana nigromaculata.
Acta Ecologica Sinica,2012,32(13):4199鄄4206.
镉暴露对黑斑蛙精巢 ROS的诱导及其
蛋白质氧化损伤作用机理
曹摇 慧,施蔡雷,贾秀英*
(杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州摇 310036)
摘要:重金属镉对精巢发育、呼吸及神经系统信号转导等途径均有不良影响,被认为是造成两栖动物种群数量急剧下降的重要
原因之一。 然而,有关镉对精巢损伤的分子机理还不清楚。 通过对镉暴露后的黑斑蛙精巢活性氧自由基(ROS)、蛋白质羰基
(PCO)以及 DNA蛋白质交联(DPC)等指标的系统分析,探讨了镉对精巢毒害的分子作用机理。 随镉浓度的增加,黑斑蛙精巢
细胞线粒体 ROS随镉暴露浓度的增加而升高,0. 5、1. 0 mg / L 镉染毒组与对照组比较有显著性差异(P<0. 05);精巢组织 PCO
和 DPC也随镉暴露浓度的增加而逐渐上升,且均呈明显的浓度鄄效应关系。 结果表明:镉诱导机体产生 ROS,进而导致蛋白质
氧化损伤以及 DNA损伤,说明精巢组织 ROS的产生是镉致雄性生殖毒效应机制的重要因素之一。
关键词:镉; 活性氧自由基; 蛋白质羰基含量; DNA鄄蛋白质交联
Toxicity mechanism of Cadmium鄄induced reactive oxygen species and protein
oxidation in testes of the frog Rana nigromaculata
CAO Hui, SHI Cailei, JIA Xiuying*
College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China
Abstract: Exorbitant heavy metal embodies certain underlying toxic effects that have been regarded as one of the culprits
rendering amphibian populations decline and extinct at a fast clip in recent decades. Cadmium ( Cd) is a ubiquitous
environmental pollutant that has been concerned as globe issue. The previous study has found that Cd could induce
testicular damage, respiratory and nervous system disorders. However, the toxicity mechanism of Cd has not been
addressed. Here, we explored the toxicity mechanism study of Cd by investigating the effect of chronic exposure to CdCl2 on
the reproductive system and examine the toxicity mechanism of Cd2+ in male Rana nigromaculata. Based on the levels of the
Integrated Wastewater Discharge Standard (GB3838—1988) of China and 96h acute toxicity test, six test concentrations,
i. e. 0. 005, 0. 01, 0. 05, 0. 1, 0. 5, 1. 0 mg / L, were adopted for the chronic toxicity test by epidermal uptake of CdCl2
solution. 140 adult male frogs were randomly divided into seven groups, each group embraced twenty. The group treated
only with distilled water was set aside as control. All frogs were sacrificed and the testis tissues were collected in the wake of
30 days treatment for the measurement of reactive oxygen species (ROS), protein carbonylation (PCO) and DNA鄄protein
crosslinks (DPCs) levels. The results showed that with the increasing of CdCl2 concentrations, ROS of test groups became
higher than that of control group. In 0. 5 mg / L or 1. 0 mg / L CdCl2 groups, ROS increased significantly in comparison with
control group ( P < 0. 05). The content of PCO increased notably along with the increasing of Cd2+, taken on strong
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dose鄄dependent relationship (R2 =0. 9603, P<0. 05). In the presence of 0. 5mg / L or 1. 0mg / L of Cd2+, PCO content was
significantly higher than that of control group (P<0. 05). Cd2+ also induced DPCs levels increasing, which showed obvious
dose鄄dependent relationship (R2 = 0. 909, P<0. 05). Compared with control group, we observed significantly difference
when the groups treated with 0. 5mg / L and 1. 0mg / L Cd2+ . Regression analysis showed that quadratic curve regression were
found between PCO content and ROS levels (R2 =0. 5547), while linear regression occurred between DPCs levels and PCO
content (R2 =0. 8394). Above results indicated that ROS accumulation could induce the PCO content increasing and the
PCO might be the upstream signal for Cd鄄induced DNA damage in the testes of R. nigromaculata. Finally, we proposed
that ROS introduced by cadmium played a central role in male reproductive toxicity and ROS may induce the cascade
reaction of protein oxidation damage and DNA impairment.
Key Words: Cadmium (Cd); reactive oxygen species (ROS); protein carbonylation ( PCO); DNA鄄protein crosslinks
(DPCs)
两栖动物是生态群落的重要组成部分,据报道,两栖动物种群数量在急剧下降,环境化学污染是其重要的
影响因素之一[1鄄3]。 重金属镉是典型的工业毒物和环境污染物,对机体具有多器官和组织毒性。 精巢是镉作
用的重要靶器官,对生殖功能具有较大的影响[4-6]。 已有研究表明,镉能促进活性氧自由基(Reactive oxygen
species, ROS)的产生,使机体处于氧化应激状态[7]。 蛋白质的羰基化被广泛地用于评价各种生物有机体组
织的氧化程度[8],蛋白质羰基(PCO)是蛋白质氧化损伤敏感的指标[9]。 在正常细胞中存在一定量的 DNA鄄蛋
白质交联(DPC),如果机体内的大分子受到外来污染物的作用,则可诱导产生超量的 DPC, 从而对 DNA的构
象、功能、复制和转录产生影响,也会影响蛋白质的结构与功能[10]。 目前,有关重金属镉对两栖动物的生长、
发育及生理生化等方面的影响国内外已开展了不少研究[11鄄15],但有关镉对精巢蛋白质氧化损伤的研究还未
见报道。 因此,本实验以黑斑蛙(Rana nigromaculata)为模式动物,研究低水平镉暴露对黑斑蛙精巢蛋白质氧
化损伤的影响,同时测定精巢组织中 ROS和 DPC,以期探讨氧化损伤与 ROS、DPC相互间的关系,为当前探寻
两栖类动物种群数量下降的原因提供相应的毒理学资料,也为进一步探讨镉对两栖动物的生殖毒性作用机制
提供重要信息。
1摇 材料与方法
1. 1摇 供试动物
健康成年雄性黑斑蛙(Rana nigromaculata)采自杭州市郊天目山,平均体长为(5. 85依0. 32)cm,平均体重
为(20. 05依3. 78)g。 实验室驯养 7 d后,挑选健壮、规格整齐的黑斑蛙进行实验。
1. 2摇 实验试剂
Cd采用 CdCl2·2. 5H20 (上海金山亭新试剂厂,分析纯),用双蒸馏水配制成 1. 0 g / L 母液,实验时稀释
成所需各浓度。
考马斯亮蓝蛋白试剂盒,由南京建成生物工程研究所提供。
HEPES游离酸(美国 Amresco)、硫酸链霉素(美国 Amresco)、蛋白酶 K(美国 Amresco)、小牛胸腺 DNA
(美国 sigma)、Hoechst33258 荧光染料(美国 sigma)、二氯荧光素二乙酸酯(DCFH鄄DA,美国 sigma),其他药品
均采用国产分析纯。
1. 3摇 实验设计
1. 3. 1摇 实验处理
实验用黑斑蛙随机分成 7 组,每组 20 只。 根据 96h 急性毒性实验,参考国家污水综合排放标准
(GB3838—1988)中环境镉限制浓度,将镉暴露浓度设为 0. 005、0. 01、0. 05、0. 1、0. 5、1. 0 mg / L(以镉计,CdCl2
·2. 5H2O配制)。 实验容器为室内玻璃水族箱(60 cm伊40 cm伊35 cm),实验用水为曝气自来水(实验水温
18—22 益,pH值 6. 5—7. 0,溶氧 6—8 mg / L),暴露实验持续 30 d. 实验采用静态置换法,每天更换实验溶液,
0024 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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每天投喂蚯蚓(Esisenia foetida)2 次。 驯养期间及实验过程中黑斑蛙基本没有出现死亡情况。
1. 3. 2摇 样品处理
染毒结束后,将黑斑蛙用双毁髓法处死,立即取出肝脏组织,去除粘连物,用冰冷的 0. 65%生理盐水清
洗,吸干,-20 益冷藏待用。
1. 4摇 测定指标及方法
1. 4. 1摇 精巢组织样品准备
解剖个体取出精巢,去除粘连物,0. 65%生理盐水清洗,滤纸吸干称重,根据质量体积比 1颐19 加入 0郾 65%
生理盐水,冰浴匀浆,1000 r / min,4 益离心 5 min,将上清液分装-20 益保存待测。
1. 4. 2摇 ROS水平测定
ROS水平测定参照 Curtin等[16]的方法稍加改进,首先进行线粒体的粗提取,尽可能减小细胞质环境其它
氧化物质如 SOD等酶类对 DCFH鄄DA氧化的影响,取 1000 r / min匀浆上清液 0. 5 mL,4益下以 10000 r / min离
心 15 min,沉淀物即线粒体。 将沉淀用冰浴生理盐水按质量体积比 1颐9 重悬。 反应体系为:190 滋L线粒体液,
10滋LDCFH鄄DA(1 mmol / L),混匀,置于酶标仪中 37 益温浴 30 min,以 485 nm 为激发光,于 530 nm 处测荧光
强度(FI)值,单位为 mg(以蛋白质计)表示。
1. 4. 3摇 蛋白质羰基(PCO)含量测定
取一侧精巢在冰浴生理盐水中漂洗,滤纸吸干称重,按质量体积比 1颐19 加入冰浴 HEPES 缓冲液,4 益冰
浴匀浆,在 4 益下 3000 r / min离心 15 min,取上清。 加入 0. 1 g / mL 硫酸链霉素溶液使之终浓度为 0. 01 g /
mL,室温放置 10 min后,4 益下 3000 r / min离心 10 min,取上清备用。
蛋白质羰基含量的测定采用 2,4鄄二硝基苯肼(DNPH比色法) [17]。 在 100 滋L 上述上清液中加入 400 滋L
的 10 mmol / L DNPH(用 2 mol / LHCl溶解),并设一组空白对照,即不含 DNPH的 2 mol / L HCl 溶液。 将各个
反应体系置于黑暗中放置 1 h,每隔 10 min迅速漩涡混匀 1 次。 反应完毕后加入 500 滋L 0. 2 mg / L 三氯乙酸
溶液,沉淀蛋白质腙衍生物,4 益下 12000 g离心 15 min,弃上清。 将沉淀用 1 mL乙醇 /乙酸乙酯混合物(体积
比 1颐1)洗涤 3 次,最后的沉淀用 1. 25 mL 6 mol / L盐酸胍溶解(37 益水浴 15 min)。 室温 12000 g离心 15 min,
取上清备用。 在紫外可见分光光度计 370 nm下测定吸光值,羰基浓度用摩尔消光系数 22. 0 mmol·L-1·cm-1计
算。 羰基含量用每 mg蛋白中含有多少 nmol的羰基来表示。 蛋白质含量的测定参考考马斯亮蓝试剂盒。
1. 4. 4摇 DPC含量的测定
根据 Zhitkovich[18]和 Merk O[19]所提出的 KCI鄄SDS 沉淀法并加以改进。 取一侧精巢称重,按质量体积
比 1 颐19 加入磷酸缓冲液(PBS,pH值 7. 5),用眼科小剪剪成糜状,4 益下 1500 r / min离心 5 min,去掉上清液,
用 0郾 5 mLPBS(pH值 7. 5)重悬细胞,调整细胞密度在 105—106 个 / mL。
细胞裂解:在制备好的细胞悬液中分别加入 0. 5 mL 2%的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液并轻微振荡,然后
在 65 益水浴中加热 10 min,待用。
游离 DNA的分离:取出水浴后裂解好的细胞,加入 100 滋L 1. 0 mol / L KCl(20 mmol / LTris鄄HCl 配制,pH
值 7. 5),将混合液 6 次穿过 1 mL 的枪头,从而使 DNA 长度一致。 然后待混合液在冰上冷冻 5 min 后,形成
SDS鄄K+沉淀,再在 4 益下 10000 r / min离心 5 min收集沉淀,将上清液转入另一 5 mL离心管中。 沉淀中加入 1
mL的清洗缓冲液(0. 1 mol / L KCl,0. 1 mmol / L EDTA,20 mmol / L Tris鄄HCl,pH值 7. 5)以重悬浮,65 益水浴 10
min,冰上骤冷 5 min,重复离心和清洗步骤 3 次,每次均将上清液转入 5 mL离心管中。
DPC中结合 DNA的分离:最终的沉淀重悬浮于 0. 5 mL 的清洗缓冲液中,然后加入 0. 5 mL 的蛋白酶 K
(0. 4 mg / mL,溶于清洗缓冲液中配制),50 益水浴消化 3 h,再在冰上骤冷 5 min,然后 4 益下 12000 r / min 离
心 10 min,收集上清液即为 DPC中的 DNA。
DPC的定量:先制作 DNA 浓度的标准曲线。 用清洗缓冲液配制最终浓度分别为 0、100、300、500、750、
1000、1500、2000、3000、5000 ng / mL的小牛胸腺 DNA标准液,紧接着加入 1 mL新鲜配制的 400 ng / mL荧光染
1024摇 13 期 摇 摇 摇 曹慧摇 等:镉暴露对黑斑蛙精巢 ROS的诱导及其蛋白质氧化损伤作用机理 摇
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料 Hoechst33258,使荧光染料的终浓度为 200 ng / mL,置于暗处 30 min,用荧光分光光度计(激发波长 350 nm,
发射波长 450 nm)测定各标准浓度的荧光值,制备标准曲线。 按上述操作测定各样品的自由 DNA 和交联
DNA的荧光值。 根据标准曲线来定量交联 DNA和自由 DNA,再计算 DPC系数 浊。
浊= A
A+B
伊100%
式中, A为交联 DNA; B为原液中自由 DNA。
1. 5摇 数据处理
实验所得数据采用 SPSS 11. 5 统计软件包中的 t检验,分析各处理组与对照组之间的差异性, P<0. 05 为
显著差异,所有的结果均以平均值依标准误来表示。
2摇 结果与分析
2. 1摇 不同浓度镉暴露对黑斑蛙精巢 ROS的诱导
由图 1 可知,与对照组相比,0. 005 mg / L至 0. 1 mg / L 浓度范围内 ROS 无显著差异(P>0. 05);0. 5、1. 0
mg / L镉暴露组的黑斑蛙精巢组织 ROS升高,具有显著差异(P<0. 05)。
2. 2摇 不同浓度镉暴露对黑斑蛙精巢 PCO的影响
由图 2 可知,与对照组相比,0. 005 mg / L至 0. 1 mg / L浓度范围内 PCO无显著差异(P>0. 05);0. 5 mg / L
暴露组 PCO升高,差异显著,1. 0 mg / L暴露组 PCO升高,差异显著(P<0. 01)。
摇 图 1摇 黑斑蛙精巢组织 ROS水平随镉暴露浓度的变化(n=10, 与
对照组比较, * P<0. 05 )
Fig. 1 摇 The level of ROS in the testes of Rana nigromaculata
exposed to Cd (n=10; * Compared with the control, P<0. 05)
摇 图 2摇 黑斑蛙精巢组织 PCO水平随镉暴露浓度的变化(n=10, 与
对照组比较, * P<0. 05, **P<0. 01 )
Fig. 2 摇 The level of PCO in the testes of Rana nigromaculata
exposed to Cd (n=10; * Compared with the control, * P<0. 05,
**P<0. 01 )
2. 3摇 不同浓度镉暴露对黑斑蛙精巢 DPC的影响
由图 3 可知,与对照组相比,在 0. 005 mg / L至 0. 1 mg / L镉暴露浓度下,DPC无显著性变化(P>0. 05);在
0. 5 mg / L、1. 0 mg / L镉暴露浓度下 DPC显著高于对照组(P<0. 05)。
2. 4摇 镉暴露浓度与 PCO、DPC交联率间的回归分析
对镉暴露浓度与 PCO、DPC分别作回归分析(表 1),可知镉暴露浓度与 PCO、DPC间均存在线性相关,R2
表 1摇 PCO、DPC与 Cd暴露浓度的回归统计结果
Table 1摇 Results of statistic analysis to PCO contents, DPC coefficient and Cadmium concentration
指标 Item 回归方程 Regression equation R2 P
PCO Y=1. 686x+1. 211 0. 9603 P<0. 05
DPC Y=2. 738x+8. 5413 0. 909 P<0. 05
2024 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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摇 图 3摇 黑斑蛙精巢组织 DPC交联随镉暴露浓度的变化(n=10, 与
对照组比较, * P<0. 05 )
Fig. 3摇 The DPC coefficient in the testes of Rana nigromaculata
exposed to Cd (n=10; * Compared with the control, P<0. 05)
值分别为 0. 9603、0. 909,镉暴露浓度与 PCO、DPC 间有
明确的浓度鄄效应关系(P<0. 05)。 说明蛋白质氧化损
伤与 DNA 损伤对镉污染比较敏感,可能是镉致雄性生
殖系统氧化损伤的重要机理。
2. 5摇 黑斑蛙精巢 ROS、PCO、DPC交联率之间的关系
对黑斑蛙精巢 ROS 与 PCO 做非线性回归方程拟
合,相关系数 R2 =0. 5547,且相关系数检验具有显著性,
黑斑蛙精巢 PCO 含量与 DPC 交联率做线性回归方程
拟合,相关系数 R2 = 0. 8394,且相关系数检验具有显著
性(图 4)。 表明黑斑蛙精巢 PCO的变化会对 DPC产生
影响。
3摇 讨论
活性氧自由基的产生是早期镉中毒的表征[20],在
体内正常的生理生化反应过程中,细胞会通过各种途径
产生 ROS,他们既包括了氧自由基,又包括了一些含氧
图 4摇 镉暴露下黑斑蛙精巢组织 ROS、PCO、DPC三者之间的关系
Fig. 4摇 Relationship among ROS level, PCO content and DPC coefficient of Rana nigromaculata testes exposed to Cd
的非自由基衍生物。 Watkin 研究表明,重金属镉能够通过 ROS 的产生进而间接影响个体的分子功能机
制[21]。 精巢是镉的主要蓄积部位,也是镉毒作用的主要靶器官之一[22]。 本研究表明,重金属镉暴露,能够引
起黑斑蛙精巢组织细胞线粒体 ROS 的水平升高,与对照组相比差异显著(P<0. 05)(图 1),表明低剂量镉长
期暴露能够引起黑斑蛙精巢组织 ROS蓄积。 镉诱导机体产生 ROS 可能是镉致毒的主要机制,ROS 积累进而
会导致各种损害作用产生。 造成 ROS蓄积的原因,一方面可能是由于蛙类皮肤的特殊渗透性结构,致使环境
溶液中的镉通过皮肤渗透进入体内,进而在精巢组织中不断积累。 另一方面,可能由于镉通过对抗氧化物的
消耗作用以及对其他金属离子,如钙、锌的拮抗作用,抑制机体的抗氧化酶系统活性,使机体抗氧化能力显著
下降,从而导致自由基的大量堆积。 Bolduc 和 Shih 研究报道,镉能够消耗体内 GST,阻碍线粒体电子传递链
的运转,使得过氧阴离子大量产生,进而影响到解毒蛋白酶的功能,最终导致 ROS 的产生和积累[23鄄24]。 另有
研究表明,镉致毒机制是通过干扰酶活性和诱导自由基生成两方面作用形成,镉能够取代钙结合蛋白中的钙,
从而抑制甚至终止钙结合蛋白的活性,使得氧化应激反应产生,自由基大量形成[25]。 Casalino研究认为,镉能
够取代酶反应中锌的作用位点,进而影响到能够清除氧自由基的抗氧化酶系统功能,导致自由基不能被及时
清除从而造成其大量积累,对机体造成损伤[26]。
蛋白质是 ROS的主要靶分子,在自由基作用下,某些蛋白质的特定氨基酸残基发生变化,导致蛋白质结
3024摇 13 期 摇 摇 摇 曹慧摇 等:镉暴露对黑斑蛙精巢 ROS的诱导及其蛋白质氧化损伤作用机理 摇
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构和功能的改变[27]。 ROS一方面能够直接作用于蛋白质分子,通过氧化蛋白质氨基酸残基侧链,使其形成酮
或醛类衍生物;另一方面 ROS能够与糖类和脂质大分子反应,产生活性羰基类物质然后作用于蛋白质,形成
羰基蛋白[28]。 羰基的形成能够使蛋白质功能永久性丧失,而且在蛋白质氧化损伤的反应中,许多都涉及到蛋
白质羰基的形成[29]。 因而,蛋白质羰基可以作为生物体损伤特征指标之一,通过测量羰基类物质能够很好的
估计过氧化损伤的程度,包括氧化应激、毒物的介入和病毒引起一系列蛋白质氧化损伤等[30]。 此外,与其它
氧化反应产物相比,ROS诱导的蛋白质羰基化反应是不可逆反应,而且蛋白质羰基的产生时间比其他氧化反
应产物更早,并且更为稳定[31]。 因此,蛋白质羰基含量通常被认为是蛋白质氧化损伤的标志物,这一观点目
前越来越得到国内外相关研究人员的认可[32鄄34]。 本实验结果表明,在低浓度镉溶液中暴露 30d,黑斑蛙精巢
组织蛋白质羰基含量升高,回归分析表明,PCO与镉暴露浓度呈现明显的浓度鄄效应关系,说明镉可引起细胞
蛋白质产生氧化损伤作用。 进一步分析精巢组织蛋白质羰基含量与活性氧自由基的关系可知,精巢 PCO 含
量与 ROS水平呈二次曲线关系(R2 =0. 5547)(图 4);在低浓度镉暴露下,精巢线粒体 ROS 水平明显升高,但
精巢 PCO含量并未同步升高,这可能是由于精巢某些抗氧化酶活性因代偿性应激反应而不断升高以清除自
由基伤害。 但随着镉暴露浓度的增加,抗氧化酶活性可能受到镉的抑制,由此造成精巢中 ROS 的大量积累,
并引起精巢 PCO含量的明显升高,导致精巢蛋白质氧化损伤。 由此可见,镉诱导产生的 ROS,引起了组织蛋
白质氧化损伤,这可能是镉对蛋白质毒作用的一种主要机制。
DNA鄄DNA交联和 DNA鄄蛋白质交联(DNA鄄protein crosslinks, DPC)是致癌物和诱变剂对 DNA损伤的一种
重要形式。 DPC是 DNA与蛋白分子之间形成的一种稳定的共价结合物,结合牢固。 镉、镍、铬等过渡金属能
直接介导蛋白质氨基酸残基的功能基团与 DNA分子中的碱基共价结合形成 DPC[35]。 正常个体体内 DPC 的
出现并不一定代表接触毒物毒效应的产生,如果体内毒物能够在体内被消除、降解或排泄,DPC 通常会下
降[36],而超量的 DPC就会对细胞产生严重危害,且比其他 DNA 损伤更加难以修复[37]。 Kuykendall 研究结果
表明,六价铬和二价镍能够造成鱼类红细胞 DNA蛋白质交联[38]。 在本研究中,随镉染毒浓度的增大,高浓度
镉暴露导致黑斑蛙精巢 DPC上升,与对照组相比高浓度组有显著差异(P<0. 05)(图 3),且呈明显的浓度鄄效
应关系(表 1)。 SO2 对小鼠神经细胞 DPC的影响研究也表明,DPC对于外源性化学物质较为敏感,具有损伤
指示作用[39]。 本研究将精巢 DPC 与 PCO 做回归分析发现,精巢 PCO 与相应 DPC 呈线性关系,且相关系数
具显著性(P<0. 01),随 PCO的改变,DPC随之上升,说明蛋白质氧化损伤与 DPC 的产生存在一定的关联性
(图 4)。 Arita研究表明,尽管镉不能形成 DNA加合物,但镉能够导致个体的氧化应激反应进而间接对 DNA
造成损伤[40]。 羰基化蛋白极易相互交联聚集为大分子,至于镉导致 DPC 的形成机理是由于自由基的大量堆
积导致,还是镉直接介导蛋白质氨基酸与 DNA分子上的碱基共价结合,从而诱发 DPC 的形成,还有待于进一
步研究。
致谢:感谢杭州师范大学生命与环境科学学院生态毒理学实验室老师和同学的帮助。
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6024 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 32,No. 13 July,2012(Semimonthly)
CONTENTS
Responses of sandy beach nematodes to oxygen deficiency: microcosm experiments HUA Er, LI Jia, DONG Jie, et al (3975)………
Allometric relationship between mean component biomass and density during the course of self鄄thinning for Fagopyrum esculentum
populations LI Lei, ZHOU Daowei, SHENG Lianxi (3987)………………………………………………………………………
Automatic site selection of sight鄄seeing route in ecotourism destinations based on landscape perception sensitivity
LI Jifeng, LI Renjie (3998)
……………………
…………………………………………………………………………………………………………
Emergy evaluation for sustainability of Biogas鄄linked agriculture ecosystem: a case study of Gongcheng county
YANG Jin, CHEN Bin, LIU Gengyuan (4007)
………………………
……………………………………………………………………………………
Spatial heterogeneity of vegetation coverage and its temporal dynamics in desert steppe, Inner Mongolia
YAN Liang, ZHOU Guangsheng,ZHANG Feng,et al (4017)
………………………………
………………………………………………………………………
Soil conservation value flow processes of two typical grasslands PEI Sha,XIE Gaodi, LI Shimei,et al (4025)…………………………
Spatial distribution of carbon storage in a 13鄄year鄄old Pinus massoniana forest ecosystem in Changsha City, China
WU Tao, PENG Chonghua, TIAN Dalun, et al (4034)
…………………
……………………………………………………………………………
Colonization rate and diversity of AM fungi in the rhizosphere of seven medicinal plants in Xiamen
JIANG Pan, WANG Mingyuan (4043)
……………………………………
………………………………………………………………………………………………
Effects of Cd,Low Concentration Pb / Cd on the contents of phenolic acid and simple glucides exudating from winter wheat seedlings
root and the relationship between them and rhizosphere soil microbial activity
JIA Xia, DONG Suiming, ZHOU Chunjuan (4052)
……………………………………………………
…………………………………………………………………………………
The community structure of laccase鄄like multicopper oxidase鄄producing bacteria in soil of Liangshui Nature Reserve
ZHAO Dan, GU Huiqi, CUI Daizong,et al (4062)
…………………
…………………………………………………………………………………
Effects of soil rhizosphere microbial community and soil factors on arbuscular mycorrhizal fungi in different salinized soils
LU Xinping, DU Qian,YAN Yongli, et al (4071)
……………
…………………………………………………………………………………
The effects of inoculation with phosphate solubilizing bacteria Bacillus megaterium C4 in the AM fungal hyphosphere on soil organic
phosphorus mineralization and plant uptake ZHANG Lin, DING Xiaodong, WANG Fei, et al (4079)…………………………
Soil carbon, nitrogen and phosphorus ecological stoichiometry of Phragmites australis wetlands in different reaches in Minjiang
River estuary WANG Weiqi, WANG Chun, ZENG Congsheng, et al (4087)……………………………………………………
Dynamics of soil microbial biomass during early fine roots decomposition of three species in alpine region
WU Zhichao, WU Fuzhong, YANG Wanqin, et al (4094)
……………………………
…………………………………………………………………………
Effects of simulated precipitation on apparent carbon flux of biologically crusted soils in the Gurbantunggut Desert in Xinjiang,
Northwestern China WU Lin, SU Yangui, ZHANG Yuanming (4103)……………………………………………………………
Changes in photosynthetic properties, ultrastructure and root vigor of Dendrobium candidum tissue culture seedlings during
transplantation PU Xiaozhen, YIN Chunying, ZHOU Xiaobo, et al (4114)………………………………………………………
Analysis of dry matter accumulation and translocation for winter wheat cultivars with different yields on dryland
ZHOU Ling, WANG Zhaohui,LI Fucui, et al (4123)
………………………
………………………………………………………………………………
Impact evaluation of low temperature to yields of maize in Northeast China based on crop growth model
ZHANG Jianping, WANG Chunyi, ZHAO Yanxia,et al (4132)
………………………………
……………………………………………………………………
Spatiotemporal variations in the reference crop evapotranspiration on the Loess Plateau during 1961—2009 LI Zhi (4139)…………
Eco鄄physiological responses of Phragmites australis to different water鄄salt conditions in Momoge Wetland
DENG Chunnuan, ZHANG Guangxin, LI Hongyan, et al (4146)
……………………………
…………………………………………………………………
Comparative study of different earthworm sampling methods FAN Ruqin, ZHANG Xiaoping, LIANG Aizhen, et al (4154)…………
Geographic variation in longevity and fecundity of the Asian corn borer, Ostrinia furnacalis Guen佴e (Lepidoptera: Crambidae)
TU Xiaoyun,CHEN Yuansheng, XIA Qinwen, et al (4160)
………
………………………………………………………………………
Analysis on grasshopper spatial heterogeneity and pattern of natural grass in upper reaches of Heihe
ZHAO Chengzhang, LI Lili, WANG Dawei, et al (4166)
…………………………………
…………………………………………………………………………
Inhibition effects of ethyl acetate extracts of Momordica charantia leaves on the experimental population of Spodoptera litura
LOU Ying, LING Bing, XIE Jiefeng, et al (4173)
…………
…………………………………………………………………………………
Feeding habits of Lateolabrax maculatus in Yangtze River estuary HONG Qiaoqiao, ZHUANG Ping, YANG Gang, et al (4181)……
Genetic structure of Gymnodiptychus pachycheilus from the upper reaches of the Yellow River as inferred from mtDNA control
region SU Junhu, ZHANG Yanping,LOU Zhongyu, et al (4191)…………………………………………………………………
Toxicity mechanism of Cadmium鄄induced reactive oxygen species and protein oxidation in testes of the frog Rana nigromaculata
CAO Hui, SHI Cailei, JIA Xiuying (4199)
……
…………………………………………………………………………………………
The diversity of scarab beetles in grassland cattle dung from North China
FAN Sanlong, FANG Hong, GAO Chuanbu, et al (4207)
………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
Spatial relationships among Empoasca vitis (Gothe) and Toxoptera aurantii (Boyer) and natural enemies in tea gardens of autumn鄄
winter season in Hefei suburban YANG Lin, GUO Hua, BI Shoudong, et al (4215)……………………………………………
Effects of vegetation, elevation and human disturbance on the distribution of large鄄 and medium鄄sized wildlife: a case study in
Jiuzhaigou Nature Reserve ZHANG Yue, LEI Kaiming, ZHANG Yuke, et al (4228)……………………………………………
Research of typical EIPs based on the social network analysis YANG Lihua, TONG Lianjun (4236)…………………………………
Exergy鄄based life cycle accounting of household biogas system: a case study of Gongcheng, Guangxi
QI Jing, CHEN Bin, DAI Jing, et al (4246)
…………………………………
………………………………………………………………………………………
Review and Monograph
The effects of changes in hydrological regimes and salinity on wetland vegetation: a review ZHANG Guangxin (4254)………………
Advances in research on the seed bank of a saline鄄alkali meadow in the Songnen Plain
MA Hongyuan, LIANG Zhengwei, L譈 Bingsheng, et al (4261)
………………………………………………
……………………………………………………………………
A new landscape expansion index: definition and quantification WU Pengfei, ZHOU Demin, GONG Huili (4270)…………………
Scientific Note
Response of photosynthetic characteristics of Psathyrostachys huashanica Keng to drought stress
LI Qian, WANG Ming, WANG Wenwen, et alg (4278)
………………………………………
……………………………………………………………………………
The antifouling activities of Callyspongia sponge extracts CAO Wenhao, YAN Tao, LIU Yonghong,et al (4285)……………………
《生态学报》2012 年征订启事
《生态学报》是中国生态学学会主办的自然科学高级学术期刊,创刊于 1981 年。 主要报道生态学研究原
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法、新技术介绍;新书评介和学术、科研动态及开放实验室介绍等。
《生态学报》为半月刊,大 16 开本,280 页,国内定价 70 元 /册,全年定价 1680 元。
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生摇 态摇 学摇 报
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第 32 卷摇 第 13 期摇 (2012 年 7 月)
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