全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (3): 344–353, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00344
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收稿日期: 2012-09-14; 接受日期: 2012-12-27
基金项目: 国家自然科学基金(No.30772712)
* 通讯作者。E-mail: xutao1998cn@yahoo.com.cn; qllang@lc-bio.com
降解组测序技术在植物miRNA研究中的应用
董淼1, 黄越1, 陈文铎1, 徐涛1*, 郎秋蕾2*
1浙江理工大学生命科学学院, 杭州 310018; 2杭州联川生物技术有限公司, 杭州 310018
摘要 目前, 利用芯片技术和miRNA测序可快速、准确地检测到物种中所含有的miRNA。随着越来越多的miRNA被发现,
miRNA靶基因的确定已成为研究miRNA生物学功能的关键。传统的miRNA靶基因的寻找主要依赖生物信息学预测、AGO
蛋白免疫共沉淀和荧光素酶法等。随着高通量测序技术的持续革新, 出现了一种新的miRNA靶基因的检测方法, 即降解组
测序(degradome sequencing)法, 该方法拥有高通量测序技术、生物信息学分析和RACE验证三者的优势, 并已成功应用于
拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)和小立碗藓(Physcomitrella patens)等模式植物miRNA靶基因的检测。
基于已发表的相关文献和联川生物降解组测序平台, 该文对降解组测序技术应用于植物miRNA靶基因的研究进展及其实验
原理进行了综述, 同时对运用该技术可进行的更深入研究进行了讨论。
关键词 降解组测序, 高通量测序, miRNA, 靶基因
董淼, 黄越, 陈文铎, 徐涛, 郎秋蕾 (2013). 降解组测序技术在植物miRNA研究中的应用. 植物学报 48, 344–353.
MicroRNA(miRNA)是一类长度为22 nt左右的内
源性非编码小RNA, 其前体具有发夹结构, 广泛存在
于动物、植物和病毒等有机体中(Bartel and Bartel,
2003; Lim et al., 2003)。自1993年, Lee等首次发现
miRNA至今, 已有193个物种的21 264条miRNA发夹
前体序列和25 141条miRNA成熟序列收录于Sanger
microRNA序列数据库中(miRBase 19.0)(Pepper et
al., 2004)。miRNA之所以备受关注是因为其成熟体
可通过碱基互补配对原则定位结合于靶基因mRNA
的侧翼区域或编码区域 (Jones-Rhoades et al.,
2006)。通过剪切mRNA ORF区域或结合在UTR区可
对其mRNA翻译过程进行抑制, 并在转录后水平上调
控基因的负表达(Zhang et al., 2007)。大量研究表明,
miRNA参与动植物的细胞增殖、凋亡、分化、代谢、
肿瘤和生长发育(张俊红等, 2012)以及逆境响应(包括
干旱、高盐和营养胁迫等)的多种生物学过程(Bartel,
2004; Hwang and Mendell, 2006)。
目前, 科研人员可通过芯片技术和高通量测序快
速高效地检测并鉴定miRNA。从miRBase数据库可以
看出, 利用这些技术已发现了海量的miRNA。然而对
于这些miRNA所作用的靶基因以及所行使的功能却
知之甚少, 造成这一现象的根本原因在于很难高通量
地检测并验证miRNA的靶基因。传统的miRNA靶基
因的寻找主要依靠生物信息学预测(Kim et al., 2006;
Cheng and Li, 2008)、AGO蛋白免疫共沉淀(Beit-
zinger et al., 2007)、miRNA过表达(Lim et al., 2005)
和荧光素酶法(Liu et al., 2008)等。然而这些方法都存
在一定的局限性。例如生物信息学预测虽然可大量地
检测出miRNA的靶基因但其结果却存在大量的假阳
性; AGO蛋白免疫共沉淀和荧光素酶法等生物学方法
操作繁琐, 且耗时费力, 不能大量检测miRNA的靶标
(表1)。随着高通量测序(high throughput sequencing)
技术的发展以及植物miRNA在调控靶基因的表达时
通常与靶mRNA进行几乎完全的配对这一特点, 出现
了一种结合了高通量测序技术、生物信息学分析和
RACE验证三者优势的新的检测方法, 称为降解组测
序技术(degradome sequencing)。该技术已成功应用
于拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Addo-Quaye et al.,
2008)、水稻(Oryza sativa)(Li et al., 2010)、小立碗
藓(Physcomitrella patens)(Addo-Quaye et al.,
2009b)、葡萄(Vitis vinifera)(Pantaleo et al., 2010)、
大豆(Glycine max)(Song et al., 2011)、玉米(Zea

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董淼等: 降解组测序技术在植物miRNA研究中的应用 345
表1 降解组测序与传统寻找miRNA靶基因方法的比较
Table 1 The comparison of degradome sequencing with
traditional methods

降解组
测序
荧光素
酶法
生物信息学
预测
AGO蛋白
免疫共沉淀
通量 高 低 高 低
操作方法 简易 繁琐 简易 繁琐
实验周期 短 长 短 长
准确性 较高 高 低 较高

mays)(Zhao et al., 2012)和黄瓜 (Cucumis sati-
vus)(Mao et al., 2012)等植物的miRNA靶基因的检
测。鉴于降解组测序技术所基于的原理使其更适用于
植物miRNA靶基因的检测, 因此本文侧重概述目前
降解组测序技术在植物研究中的进展, 介绍降解组测
序的文库构建和运行原理, 并着重阐述运用降解组测
序技术可进行的研究内容。
1 降解组测序原理
有研究表明, miRNA通过与靶基因(mRNA)部分或完
全配对, 引起基因的翻译抑制或miRNA内切酶的剪
切以实现对基因的表达调控(Bartel, 2004)。在动物体
内, 以基因的翻译抑制居多且miRNA与靶基因之间
的配对程度不高; 在植物体内, miRNA通常与靶基因
进行完全或几乎完全配对, 引起mRNA的剪切, 从而
调控基因的表达。Agarwal等(2010)和Joshi等(2010)
利用植物miRNA的这一特征对植物miRNA的靶基因
进行了生物信息学预测, 并获得了许多有意义的研究
成果。然而, 由于预测方法无法区分预测靶基因的真
伪, 有可能花费了大量的时间和精力验证了一些错误
的预测结果(通常使用RACE去验证预测结果), 极大
地影响了靶基因的探索效率。同时, 当miRNA与靶基
因间存在较高错配时, 预测方法可能会丢失许多真实
的靶基因。
伴随高通量测序的出现, German等(2008, 2009)
首次运用降解组测序检测了miRNA的靶基因。该方法
结合了生物信息学分析、cDNA末端快速扩增技术(ra-
pid amplification of cDNA ends, RACE)和高通量测
序技术三者的优势。降解组测序大体可分为3步: (1)
构建文库; (2) 高通量测序; (3) 生物信息学分析。其
原理见图1。植物中大部分miRNA与靶基因间完全或
几乎完全互补配对, 并在互补位点的第10或11位核
苷酸上发生切割作用以调控靶基因的表达。切割后会
产生2个片段, 5剪切片段和3剪切片段。其中, 5剪切
片段包含5帽子结构和3羟基; 3剪切片段则包含自由
的5单磷酸和3polyA尾巴。他们利用5adapter这一特
殊接头(可与5单磷酸RNA连接而与含有帽子结构的5
剪切片段或其它缺少5单磷酸基团的RNA无法连接)捕
获了miRNA的切割产物。随后使用oligo(dt)3-adapter
将连接有5-adapter的3切割产物反转录成cDNA。扩增
cDNA后, 利用限制性内切酶Mme I对PCR产物进行酶
切, 酶切产生长度为20–21 nt的片段。将酶切后的产物
与3双链DNA adapter连接并进行PCR扩增, 最终产物
进行凝胶纯化后, 建立一个包含经miRNA切割产生的
靶基因3端剪切片段的文库。该文库将被用于下一步的
高通量测序。
高通量测序后得到的数据去除adapter序列得到目
的序列, 应用CleaveLand分析软件(Addo-Quaye et
al., 2009a)将目的序列与测序物种的genome或cDNA
进行比对(图2), 记录匹配上的序列, 舍弃未比对上的
序列。这一步的主要目的是将降解组测序得到的序列配
对上测序物种的mRNA, 从而可得到被切割mRNA的
完整序列信息。从计算机分析结果可以直观地发现, 在
mRNA序列的某个位点可出现1个波峰, 而该处正是候
选的miRNA剪切位点。为了进一步确定miRNA的靶基
因, 鉴于植物miRNA的切割常常发生在互补位点的第
10或11位(Elbashir et al., 2001)核苷酸上, 故取波峰上
游和下游各15 nt核苷酸序列产生一个30 nt的序列
(t-signature)。将该序列反向互补并与测序物种的小
RNA数据库匹配, 符合要求的匹配即为确定了的潜在
miRNA的靶基因, 然后画出t-plot图。
2 降解组测序的应用
2.1 鉴定miRNA的靶基因
降解组测序最主要的应用是检测miRNA的剪切基因。
当我们利用该技术检测到miRNA剪切的基因后, 可
得知下游受影响的基因路径, 结合Gene Ontology
(GO)和Pathway分析, 可帮助我们进一步了解植物
miRNA的调控。因此利用降解组测序, 可以摆脱生物
信息学预测的限制, 真正实现从实验中寻找miRNA
346 植物学报 48(3) 2013

图1 降解组测序文库的构建

Figure 1 Schematic depiction of degradome sequencing library construction


图2 CleaveLand程序的运行流程

Figure 2 Schematic description of the cleaveLand pipeline


的作用靶基因。
German等(2008)首次使用降解组测序鉴定出模
式植物拟南芥miRNA的靶标。以拟南芥的花组织(wt
和xrn4)为研究对象, 运用降解组测序得到了包括800
董淼等: 降解组测序技术在植物miRNA研究中的应用 347
万个非冗余标签的2.7万个转录本信息。对测序数据
分析后, 发现100个已公开被证实的拟南芥miRNA靶
基因中, 分别在wt和xrn4的拟南芥降解组文库中检测
到了其中的94个和98个靶基因。而在124个通过计算
机预测但未被证实的miRNA靶基因中, 分别在wt和
xrn4的降解组文库中发现了31个(25%)和42个(34%)
靶基因与其一致。为了进一步验证降解组测序得到的
靶基因结果的正确性, 他们从降解组测序数据中的
t-plots内筛选出13个之前未证实也未被计算机预测
到的miRNA靶基因, 进行传统的5RACE实验验证。
结果表明, 其中的12个miRNA靶基因被证实确认。如
此高的鉴定率表明, 应用降解组测序并结合其t-plots
作为筛选标准可以有效地避免假阳性靶基因。
Li等(2010)运用该技术也检测到水稻中53个mi-
RNA家族中的160个靶基因。其中 , 9个水稻保守
miRNAs具有23个非保守靶基因, 而29个水稻特有的
miRNA检测出了56个靶基因。在对这些靶基因数据进
行分析时, 发现miR398的靶基因中有1个保守靶基因
之前从未报道过。之前的研究表明, 在单子叶和双子
叶植物中, miR398具有保守的靶基因Cu/Zn SODs
(Sunkar et al., 2006; Dugas and Bartel, 2008)。然而
运用降解组测序却发现了1个新的miR398的靶基因
CCS1, 并在随后的RACE实验中验证了该靶基因的
真实存在。为什么之前的研究一直未发现而通过降解
组测序却发现了这一靶基因呢？他们认为, 出现这一
现象的原因是CCS1与miR398的配对分数仅为5.5
分。目前, 计算机预测靶基因设置的配对分数多为3
或3.5分。我们低估了保守miRNA与靶基因的互补配
对能力, 这使得在运用计算机预测靶基因时遗落了一
些配对程度不高但是却真实存在的靶基因。不过实验
也发现有些miRNA的靶基因之前是经过实验验证的,
但并未被降解组测序检测到, 这可能是因为该实验降
解组测序应用的材料是水稻的种子, 在种子中有些
miRNA或者靶基因不表达。因此, 在进行降解组测序
时最好收集不同组织和发育阶段以及其它环境条件
下的实验材料, 混样后对其进行降解组测序, 这样就
比较容易发现那些保守或非保守miRNA的靶基因。
国内的相关研究进展也很迅速。Zhou等(2010)
运用降解组测序技术鉴定了粳稻93-11幼嫩花序中
small RNA的靶标; 得到87个miRNAs中的177个靶
基因, 并通过RACE实验验证了40个sRNA的靶基因。
该研究组通过比对实验获得的水稻和拟南芥中保守
miRNAs的靶基因, 发现约有70%(82个中有52个)为
转录因子, 表明这些miRNA在水稻基因调控中起着
重要作用。相比之下, 不保守的miRNA的靶基因则多
种多样, 这从侧面为生物提供了一个复杂的调控网
络。Mao等(2012)利用该方法确认了黄瓜中21个已知
的miRNA的靶mRNA, 并通过GO注释发现这些靶基
因与生长发育、活性氧清除、信号转导和转录调控密
切相关。在动物中也有类似的研究。例如Yang等
(2012)对不同处理方式下8个对虾(Marsupenaeus ja-
ponicus)RNA文库进行了miRNA测序 , 以寻找与先
天免疫系统有关的miRNA, 并运用最新的降解组测
序技术寻找其miRNA对应的靶基因, 结果检测出9个
miRNA的靶基因, 其中2个miRNA(miR-1和 let-7)与
先天免疫系统相关, 其切割的靶基因分别为核酸内切
逆转录酶和跨膜蛋白14C-like。从上述例子可以看出,
降解组测序被更多地应用于植物miRNA靶基因的研
究, 并且在一些已有完整基因组数据的物种(拟南芥
和水稻等)中, 得到了很好的结果。此外, 与生物信息
学预测相比 , 降解组测序不但同样能高通量发现
miRNA的靶基因, 而且可以更进一步缩小后续的研
究范围, 且其结果更易被验证。
2.2 研究miRNA前体的加工模式
German等(2008)在对拟南芥降解组测序数据分析时
意外地发现一些pri-miRNA也有可能被切割降解。根
据降解组数据匹配到拟南芥pri-miRNA的丰度和分布
的不同, 他们将其分为5种切割模式: (1) miRNA末端
匹配; (2) miRNA前端匹配; (3) miRNA*末端匹配; (4)
miRNA*前端匹配; (5) 随机分布。并认为这一特殊的
分布形式主要由DCL酶的切割加工产生, 然而为什么
这些由DCL酶切割产生的片段会在建库时被捕获？
这就需要追溯到其前体加工形成的过程。根据经典的
植物miRNA生物加工过程, DCL1首先切割茎环Pri-
miRNA(初级miRNA)的末端 , 并将其加工成 pre-
miRNA(miRNA前体 ), 然后切割 pre-miRNA产生
miRNA/miRNA*duplex (Voinnet, 2009)。DCL1是具
有双链RNA特异性结合的RNase III-like酶的一种
(Jiao et al., 2008)。在miRNA加工过程中, DCL1介导
的序列切割发生在miRNA前体的茎环区域, 产生5端
磷酸基团和3端悬臂结构的双链miRNA/miRNA*。具
348 植物学报 48(3) 2013
有功能的miRNA随后与AGO(ARGONAUTE)蛋白结
合形成RISC(RNA诱导沉默复合体), 大部分miRNA*
则通常会被马上降解(Jones-Rhoades et al., 2006)。
从上述miRNA的加工过程我们不难看出, 经过DCL
酶的切割可产生5端磷酸基团的RNA, 而这种RNA可
被5adapter捕获进入测序文库。据此科研人员可以通
过降解组测序更深入地研究MIRNA前体的加工模式。
Li等 (2010)利用降解组测序验证了水稻的mi-
RNA靶基因, 同时对来自miRNA前体的降解组片段
进行了相关研究。通过分析水稻降解组测序数据, 对
DCL1介导的切割miRNA前体模式进行了探寻。鉴于
没有确切的关于pri-miRNA序列的信息, 因此将来自
水稻降解组数据的短片段匹配到前体miRNA, 检测
到6种不同的匹配模式: (1) miRNAs的5端; (2) 3端;
(3) miRNA*s的5端; (4) 3端; (5) miRNA或miRNA*的
中间; (6) 其它随机位置。他们仔细分析后认为, 前4
种模式由DCL1介导的切割产生, 后2种模式可能为
AGO介导的或一些其它类型的切割反应。这些数据为
研究DCL1介导的miRNA前体的2步切割提供了有价
值的线索。此外, 实验中也发现了一个有趣的现象。
降解组测序数据表明, DCL1介导的茎环结构2个臂上
的第1步切割很可能不是同步的。其3端具有poly A的
产物可被克隆建库并进入下一步的降解组测序, 不含
poly A的产物则不能进行下一步的实验。依照上述原
理, 切割信号应该绝大多数匹配到miRNA*s的5端和
miRNAs的3端(或miRNAs的5端和miRNA*s的3端)。
但是有 2/3切割信号精确地匹配到了miRNA-left/
miRNA*-right pre-miRNAs的成熟mi- RNA的5端, 意
味着这部分前体在水稻pre-miRNA中占主要部分。然
而根据miRBase 14.0的数据, 他们发现水稻的451个
成熟miRNA中仅有 190个其前体序列为miRNA-
left/miRNA*-right pre-miRNAs, 这与上述的结论相
悖。因此还需要更多的降解组测序实验加以验证。
Addo-Quaye等(2008)通过对小立碗藓的降解组
测序数据分析, 发现了27个不同的miRNA家族的52
个靶基因, 其中多数miRNA靶基因的作用为编码调
控蛋白。此外, 该研究也发现, 在降解组序列中有
MIRNA发夹结构加工后的残留序列。对降解组测序数
据分析后, 发现MIR319基因家族的加工模式与一般
的MIRNA不同。传统的DCL1首先介导切割茎环结构
的末端, MIR319前体最初的切割则发生在茎环上端。
降解组测序数据表明, 被DCL切割后的MIR319片段
序列匹配到茎环结构的上端位置后便终止, 这意味着
其最初的切割发生在茎环的上端, 而不是茎环的末
端。因此, 不需要产生miR319/miR319* duplex也能
形成成熟的miR319。他们将这种新发现的特殊前体
加工模式称为loop-first模式。
2.3 miRNA的自我调控研究
German等(2008)在对降解组测序数据进行更深入的
挖掘后 , 发现一些miRNA的前体序列可被其成熟
miRNA切割 , 如pri-miRNAs (At5g14545-miR398b,
At2g38325-miR390a)可被miR398b和miR390a剪切。
但奇怪的是, 虽然这些miRNA前体可被其自身成熟
体精确切割加工, 但大多数切割位点并不在其10–11
nt处。仅有1个pri-miR172b的成熟miRNA- miR172在
其10 nt处对pei-miRNA172b具切割作用。因此利用
5RACE(传统实验方法)对该miRNA前体进行验证 ,
结果表明miRNA172b对其前体pri-miR172b具切割
作用。为什么会出现自身的成熟体切割其前体现象
呢？他认为 , 发生成熟体切割前体的现象是由于
miR172的前体具有一个不稳定的茎环结构 (∆G=
–36.4 kcal·mol–1), 该茎环结构导致miRNA可通过竞
争切割其自身前体。
Meng等(2010)对该现象进行了更进一步的研究。
通过分析水稻的降解组数据 , 发现匹配到pre-mi-
RNAs中的miRNA或miRNA*编码位点中间几乎没有
切割信号, 表明在水稻中miRNA或miRNA*介导的对
前体的自我调控并不多见。然而利用降解组测序技术,
他们发现在拟南芥中确实存在该自我调控效应。
Nakano等(2006)利用MPSS数据库(http://mpss.udel.
edu/rice_pare/)中更多的水稻降解组测序数据证明了
水稻和拟南芥在此方面的差异。对大量的水稻降解组
数据分析后, 发现在水稻中确实存在miRNA的自我
调控作用, 如ath-MIR161和osa-MIR445d分别可切
割其自身前体序列。他们认为miRNA与其前体之间存
在这种反馈调节是为了保持体内miRNA的表达稳定,
即当成熟miRNA过多时, miRNA会对其前体序列进
行切割降解, 以降低前体序列的数量, 进而从源头上
遏制产生更多的成熟miRNA以维持体内整个miRNA
表达量的平衡。虽然这种自我调控并不十分普遍, 但
是从目前的研究推测它不仅存在于水稻和拟南芥中,
董淼等: 降解组测序技术在植物miRNA研究中的应用 349
而且可能也广泛存在于其它植物中。
2.4 确定miRNA与靶基因的关系
在生物体内, 同一miRNA家族的不同亚型可能切割
同一靶基因上的2个位点或1个部分重叠的位点。使用
5RACE虽能验证其靶基因, 但却不能对这些miRNA
介导切割的靶基因进行定量分析, 因此就不能确定哪
一个位点是其主要的切割作用位点。降解组测序则很
好地解决了这些问题, 使其靶基因序列定量化。如
miR444家族包括miR444a–e、b.2和c.2等几个亚型
(Sunkar et al., 2005; Lu et al., 2008), 这些亚型的靶
基因存在明显的重叠。Li等(2010)运用降解组测序证
实, 不同的miR444亚型可切割4个MADS-box基因的
多个不同位点, 虽然切割的基因相同但是其切割产生
的序列数目却不同, 存在一个主要的优先切割位点。
由miR444b.2/c.2介导的对Os02g36924靶基因C1位
点的切割所产生的序列数最多, 而miR444b.1在该基
因C2位点上的切割丰度却比C1处低很多, 这一降解
组测序结果可以使我们清楚地了解到切割位点的优
先顺序, 这是其它检测方法所无法实现的。也有实验
结果显示, 2个不同的miRNA可同时作用一个靶基
因。例如, 水稻中的miR156和miR529b存在一定的
序列同源性(中间的16个核苷酸序列重叠, 其中14个
是完全相同的), 可共同作用于Os11g30370。实验结
果表明, 虽然这2个miRNA共同作用于同一靶基因,
然而降解组测序给出的切割后丰度显示其切割效率
完全不同, miR156对Os11g30370进行主要的切割
作用。
水稻的降解组测序实验结果显示 , 不同的mi-
RNA家族存在明显的靶基因序列丰度差异(Mallory
and Vaucheret, 2006)。例如 , osa-miR160切割
ARFs(Os06g47150)所产生的序列丰度是最丰富的,
而osa-miR156切割SBP(Os08g39890)所产生的序列
丰度却要低很多。Li等(2010)认为, 造成不同miRNA
介导切割不同的靶基因产生不同数量的切割产物的
原因可能有两个: 一个是miRNA本底数量水平的差
异; 另一个是靶基因序列本底数量水平的差异。因此,
他们通过对水稻的小分子RNA印迹可定量miRNA的
本底表达水平。结果显示, 在水稻幼苗中miR156、
miR159、miR160、miR169和miR172的表达水平只
有轻微的差异, 该差异不可能导致其切割产物量的巨
大变化。随后采用实时定量PCR对其相应的靶基因进
行相对定量评估, 通过分析得到的数据, 发现这些靶
基因间的数量差异并不能说明其切割产物的差异, 进
而证明了水稻中miRNA的表达量和其靶标剪切片段
与产生的切割片段之间并无任何关系。在拟南芥中则
早已证明miRNA的丰度与靶基因表达之间没有明显
的相关性(Jiao et al., 2008)。
2.5 鉴定新的miRNA
目前, 使用miRNA芯片、高通量测序、Northern blot
以及qPCR等技术可以快速、准确地发现新的mi-
RNA。运用降解组测序则可逆向地从miRNA的剪切靶
标入手, 鉴定和确认新的miRNA, 并可得到miRNA
及其对应的靶基因。
众所周知, 现已发现了大量的拟南芥miRNA。然
而German等(2008)通过降解组数据又寻找到了新的
miRNA。具体方法如下: 首先从WT和xrn4的降解组
文库中去除sanger miRBase中已知的miRNAs以及
对应靶基因, 随后去除10以下TP10M的序列, 基于
候选miRNA的二级结构及其丰度筛选出7个miRNA,
并通过DCL突变子对其进行验证。结果表明, 在Col-0
和dcl2, 3, 4突变子中检测到ATH-miR1886、ATH-
miR1887和ATH-miR1888, 但在DCL1–7突变子中却
未检测到 , 这与miRNA的特征一致 ; 而Small13、
Small5和Small74在所有3个突变子中均未检测到 ,
表明其不是miRNA。在证明ATH-miR161.2时, 发现
其在所有突变子中都有表达。他们认为产生这一结果
的原因是 , ATH-miR161.2可能是由多个Dicer酶
(DCL)产生的一种siRNA; 也可能是由多种DCL切割
产生的一种miRNA。有趣的是, 他们发现2个候选mi-
RNA(ATH-miR161.2和small74)是由已知的miRNA
前体(miR161和miR447a)产生的, 并且都具有相对
较高的丰度(〜2 500和130的TPM和靶标)。German
等(2008)认为产生这一现象的原因是单个miRNA前
体在不同的状态下产生不同的miRNA以剪切不同的
靶基因来适应环境。因此通过降解组测序技术Ger-
man发现并验证了3个新的miRNA, 即ATH-miR-
1886、ATH-miR1887和ATH-miR1888。这种通过降
解组测序从靶基因的角度识别新的miRNA代表了一
种与预测方法不同的新技术 , 该方法不但能提供
miRNA, 而且还可得到其靶基因的实验数据。
350 植物学报 48(3) 2013
2.6 ta-siRNA的研究应用
众所周知, 生物体内存在许多内源的小RNA, 它们在
生长发育的不同时期发挥着重要调控作用。ta-siRNA
(Allen et al., 2005; Vaucheret, 2005; Garcia et al.,
2006)就是其中一种比较特别的siRNA。其产生需要
miRNA剪切TAS RNA前体, 并在RDR6的协同下将
剪切后的单链复制形成双链结构, 再经过DCL4酶的
切割加工形成21 nt大小的ta-siRNA, 随后与AGO1或
AGO7(Jouannet et al., 2012)形成复合体, 该复合体
切割mRNA抑制基因表达。
Allen等(2005)通过对拟南芥4个miR173靶基因
(At2g27400、 AtIg50055、At2g39675和At2g39680)
的序列进行分析, 发现miR173能够介导产生一类si-
RNA。由miRNA引发并能产生siRNA的基因分别被命
名为TAS1和TAS2。对miR390的靶基因进行研究后
得到At3g17185, 该基因是一个 ta-siRNA的产生位
点 , 不编码蛋白 , 被命名为TAS3。Rajagopalan等
(2006)的研究发现, TAS4初始转录本在被miR828识
别后, 引导切割并产生相应的ta-siRNA。
从上述ta-siRNA产生的原理可知, 其前体需要经
过miRNA的剪切才能产生成熟体, 因此通过降解组
测序可以检测和发现测序物种中所含的ta-siRNA。
Addo-Quaye等(2009b)在应用降解组测序检测拟南
芥的小RNA靶基因时, 发现miR173和miR390的靶基
因分别为TAS1、TAS2和TAS3。这与Allen的观点一
致。通过应用降解组测序数据研究ta-siRNA后, 发现
切割后的TAS位点的降解片段特别丰富 , 远高于
miRNA切割的其余靶基因片段。Addo认为出现这一
现象的原因是TAS基因是一种特殊的miRNA靶基因,
3TAS剪切产物的多少直接影响下游 ta-siRNA的形
成。高丰度的TAS剪切产物反映了最初的TAS转录本
的含量以及被miRNA切割加工后稳定的序列数量。因
此, 与miRNA切割靶基因后将其切割产物分解不同,
生物体需要一个稳定的TAS切割片段以产生siRNA。
这就是TAS切割产物含量高的原因, 或许高丰度的
miRNA切割产物是siRNA加工途径的一个特点。
Zhou等(2010)使用降解组测序方法对水稻indica
cultivar 93-11株系的小RNA靶标进行了全面鉴定。不
但检测到87个Unique miRNA对应的177个靶标, 还
意外地发现水稻中osa-miR390的靶基因与拟南芥中
的一样均为TAS3。此外, 发现由osa-miRNA390切割
产生的 ta-siRNA可作用于 5个生长素应答因子
(ARFs)。他们经查阅文献后了解到Liu等(2007)在研
究osdcl4-1突变子时, 发现ta-siRNA大幅度的减少导
致了ARF基因(Os01g48060、Os01g54990、Os05g-
43920和Os05g48870)表达上调。此外, Zhu等(2008)
通过实验发现3个ARF基因(Os01g48060、Os05g-
43920和Os01g70270)均可被ta-siRNA所切割。基于
上述文献, 他们进一步运用RLM 5′-RACE验证降解
组测序得到的ta-siRNA的5个ARF靶基因, 结果与降
解组测序一致, 所有这些靶基因位点均被ta-siRNA所
切割。
3 结论与展望
植物中的miRNAs是一类重要的调控分子, 通过剪切
靶mRNA调节基因的表达, 具有调控植物生长发育、
胁迫应答和新陈代谢等多种功能。目前, 通过芯片技
术和miRNA高通量测序可检测植物中的miRNA。但
发现大量的miRNA后, 大多数miRNA的靶基因尚不
明确, 这为研究miRNA的功能机制带来了困难。随着
高通量测序平台的发展, 降解组测序技术的出现突破
了目前研究手段上的局限性, 研究人员可从生物学实
验入手对样本中miRNA的靶基因进行高通量测序。降
解组测序还提供了更加灵活和深入的研究分析方法,
其所检测到的靶基因相对于生物信息学预测准确率
高, 大大缩小了后续验证实验的范围, 这是传统的研
究方法所无法比拟的。通过降解组测序得到的大量数
据可帮助我们确认上游miRNA的剪切基因, 进而得
知下游影响基因的路径。此外, 我们还可结合生物信
息Gene Ontology (GO)和Pathway分析及外表性状,
对植物miRNA的调控由上而下进行整体性分析; 并
运用降解组数据进一步探讨miRNA的特异性调控、
ta-siRNA的切割作用、miRNA前体的加工过程以及
miRNAs和靶mRNAs之间的进化关系等。经过近几年
的发展, 降解组测序技术已形成了一个系统的平台,
从样品制备、文库构建、高通量测序到后期的数据处
理都有了标准化的流程, 成为一种非常稳定可信的实
验技术, 可为广大研究者所运用。
致谢 杭州联川生物技术有限公司在降解组测序建
董淼等: 降解组测序技术在植物miRNA研究中的应用 351
库和软件分析中提供了很多帮助, 特此致谢！
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董淼等: 降解组测序技术在植物miRNA研究中的应用 353
Use of Degradome Sequencing in Study of Plant MicroRNAs
Miao Dong1, Yue Huang1, Wenduo Chen1, Tao Xu1*, Qiulei Lang2*
1College of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China
2LianChuan-Biotechnology, Hangzhou 310018, China
Abstract MicroRNA (miRNA) chip and sequencing have been used to detect miRNAs in species. With the discovery of
more miRNAs, miRNA target genes are the key to study miRNA biological function. Finding miRNA target genes mainly
relies on computational prediction, AGO protein co-immunoprecipitation and luciferase. Deep sequencing, or degradome
sequencing, can be used for high-throughput identification of targets of miRNAs. The method includes deep sequencing,
bioinformatic analysis and 5-rapid amplification of cDNA ends. It has been successfully used for global identification of
miRNA-target RNA pairs in Arabidopsis thaliana, Oryza sativa and Physcomitrella patens. This paper reviews research
progress in degradome sequencing in plant miRNA target study and discusses trends in further application of degradome
sequencing.
Key words degradome sequencing, high-throughput sequencing, miRNA, target gene
Dong M, Huang Y, Chen WD, Xu T, Lang QL (2013). Use of degradome sequencing in study of plant MicroRNAs. Chin
Bull Bot 48, 344–353.
———————————————
* Authors for correspondence. E-mail: xutao1998cn@yahoo.com.cn; qllang@lc-bio.com
(责任编辑: 孙冬花)

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国际植物生物技术联合会(简称IAPB)简介

国际植物生物技术联合会(简称IAPB)的原名是国际植物组织培养和生物技术联合会(简称IAPTC&B), 现有会员2000多
人, 分布于85个国家。IAPB首届大会于1963年在美国召开。从1970年开始, 每4年召开1次, 承办大会的有美国、日本、加
拿大、意大利、以色列等国家。2006年8月, 由中国主办的第11届大会在北京顺利召开, 时任北京大学校长许智宏院士任联
合会主席, 中国科学院副院长李家洋院士、中国科学院遗传与发育生物学研究所所长薛勇彪研究员分别任大会秘书长、In
Vitro Plant杂志副主编。第12届大会于2010年6月在美国密苏里州圣路易斯市召开。第13届大会将于2014年8月在澳大利亚
墨尔本举行。
IAPB会员需要每年交纳会员费250元, 每年可以免费获得2期In Vitro Plant的合刊。如果会员参加由国际植物生物技术
联合会中国分会主办的学术研讨会, 将获得会议费优惠。IAPB联合会主页http://www.iapb2014.org/home
会员费交纳方式: 银行或邮政汇款(请务必附言: 姓名+IAPB注册费)
邮编: 100093
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