全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (2): 145–150, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00145
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收稿日期: 2012-09-12; 接受日期: 2012-12-27
基金项目: 国家自然科学基金(No.31170625)、三峡大学研究生科研创新基金(No.2011CX083)和硕士学位论文培优基金(No.2012PY069)
* 通讯作者。E-mail: chenfj616@163.com
红花玉兰MwAG基因在花发育不同时期的表达
景丹龙1, 马江1, 张博1, 韩逸洋1, 刘志雄2, 陈发菊1*
1三峡大学生物技术研究中心, 宜昌 443002; 2长江大学园艺园林学院, 荆州 434025
摘要 MwAG基因是调控红花玉兰(Magnolia wufengensis)雌雄蕊发育的关键转录因子。采用半定量RT-PCR、Northern
blot杂交和实时荧光定量PCR技术检测了MwAG基因在红花玉兰花芽形态分化几个关键时期表达的组织特异性和表达水平
的变化。研究结果表明, MwAG基因仅在红花玉兰雌雄蕊中表达, 而在幼叶、外轮花被和内轮花被中不表达。在花器官形态
分化过程中, MwAG基因在雌雄蕊原基分化期和雌雄蕊成熟期均维持在一个较高的水平, 且在雄蕊中的表达波峰早于雌蕊,
这与雌雄蕊形态分化的时间基本吻合; 在花芽分化早期, 相同大小的花芽, 瓣数越多, MwAG基因在雌雄蕊中的表达量越
低, 其结果与不同瓣数雌雄蕊分化的时间一致, 即瓣数越多, 雌雄蕊分化越晚。
关键词 红花玉兰, MwAG基因, 花发育, 实时荧光定量PCR
景丹龙, 马江, 张博, 韩逸洋, 刘志雄, 陈发菊 (2013). 红花玉兰MwAG基因在花发育不同时期的表达. 植物学报 48,
145–150.
红花玉兰(Magnolia wufengensis)是近年发现的
木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia)新种。其分
布范围狭窄, 仅分布于湖北省五峰县中西部地区。花
被片9–32片, 花色深红、粉红或浅红, 形态各异。其
特殊的地理分布及丰富的遗传变异, 使红花玉兰成为
研究木兰属植物分类、系统进化和发育演变的理想材
料(贺随超等, 2007; 贺随超和马履一, 2008; 贺窑青
等, 2010)。拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, AGA-
MOUS(AG)是重要的C类MADS-box基因, 在花发育
过程中具有促进花分生组织形成、参与调控雌雄蕊发
育和抑制A类基因活性等生理功能(Coen and Mey-
erowitz, 1991; Weigel and Meyerowitz, 1994; Krizek
and Fletcher, 2005)。许多研究表明, AGAMOUS同
源基因在模式植物、主要农作物和重要经济植物(花
卉)的花发育过程中有很强的保守性(Coen and Mey-
erowitz, 1991; Immink et al., 2010)。木兰科是原始的
被子植物基部类群 , 因此系统研究MwAG基因
(AGAMOUS(AG)同源基因)的表达模式和功能, 对研
究被子植物花器官形态控制的分子机制具有重要的
学术意义。


本研究采用半定量RT-PCR(semi-quantitative
RT-PCR)、Northern blot杂交和实时荧光定量PCR
(qRT-PCR)技术, 检测了MwAG基因在红花玉兰花芽
形态分化关键时期表达的组织特异性和表达水平的
变化, 并进一步分析了花芽分化早期不同瓣数的红花
玉兰雌雄蕊中MwAG基因的表达量。研究结果以期揭
示红花玉兰MwAG基因从花芽分化到花开过程中的
特异性表达变化特征, 进而推测该基因在红花玉兰花
发育雌雄蕊形态建成中的功能作用。
1 材料与方法
1.1 材料
红花玉兰 (Magnolia wufengensis L.Y.Ma et L.R.
Wang)在湖北省五峰县一般于6月开始花芽分化, 次
年3、4月花芽发育成熟(图1A)直至开花(图1B)。本实
验使用的红花玉兰花芽(分别于2011年6月、7月、8月、
9月、11月及2012年3月、4月)采自湖北省五峰县。
不同时间所采花芽的大小见表1。采摘的花芽先
放入液氮中保存, 然后置于–86°C冰箱中保存备用。


·研究报告·
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图1 红花玉兰
(A) 花芽期; (B) 开花期

Figure 1 The flower of Magnolia wufengensis
(A) Flower bud; (B) Flowering

1.2 方法
从NCBI网站上下载红花玉兰ACTIN基因和MwAG基
因序列(Wu et al., 2012)。用软件oligo 6设计半定量
RT-PCR、Northern blot杂交和qRT-PCR (quantita-
tive real-time PCR)的引物(表2)。

1.2.1 红花玉兰MwAG在花发育时期的组织表达特
异性检测
使用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒
(Aidlab, China), 分别提取红花玉兰幼叶及3月花芽
成熟期的外轮花被、内轮花被、雄蕊和雌蕊的总RNA,
用DNase I (Takara, Japan) 37°C反应30分钟, 消化
RNA中混有的DNA, 使用M-MLV反转录酶(Takara,
Japan)逆转录成cDNA。PCR反应程序为: 第1步,
94°C预变性5分钟; 第2步, 94°C30秒, 57°C30秒,
表1 红花玉兰花芽的采集时间和大小(平均值±标准误)
Table 1 The acquisition time and size of the flower buds of
Magnolia wufengensis (means±SE)
No. Date (year-month) Length of bud (mm)
1 2011-06 5.10±0.05
2 2011-07 12.10±0.06
3 2011-08 14.20±0.06
4 2011-09 15.26±0.09
5 2011-11 15.23±0.03
6 2012-03 35.23±0.09
7 2012-04 55.30±0.06
8 2012-04 76.23±0.15


表2 引物序列
Table 2 The sequences of primers
Primer name Primer sequences (5′→3′)
RTactinF GCCGTGACCTGACAGATGCTCTTAT
RTactinR CAGACTCGTCATACTCCGCCTTTG
RTagF GAGTTGCTGTTTGCTGAAATCGAG
RTagR CCACCACATTACCTTTTAGCCAAG
MwAGNF ACTGAGAACGAAAGAGCCCAAC
MwAGNR CACGAGTCTTATGACCATCTGC
qRTactinF AAGAACATCCCGTCCTCCTTACTG
qRTactinR ACCGGAATCAAGCACAATACCTGT
qRTagF ACGCCTTCCCGAATTG
qRTagR CTTCTTGAGGAGGCCATTAC


72°C30秒, 25个循环; 第3步, 72°C延伸10分钟。每个
cDNA样品设3个重复。反应结束后, 进行琼脂糖凝胶
电泳检测。
使用试剂盒提取红花玉兰3月花芽成熟期的花
被、雄蕊和雌蕊的总RNA, 用DNase I消化其DNA后,
置于–86°C冰箱中保存备用。Northern blot杂交技术
(Sambrook et al., 1989)采用DIG High Prime DNA
Labeling and Detection Starter Kit II (Roche, Ger-
many), 杂交探针所用引物为MwAGNF和MwAGNR
(表2)。PCR反应程序为: 第1步, 94°C预变性5分钟;
第2步, 94°C30秒, 57°C30秒, 72°C30秒, 30个循环;
第3步, 72°C延伸10分钟。将RNA样品电泳、转膜、
与探针杂交、洗膜、检测、压片和显色后拍照。

1.2.2 红花玉兰雌雄蕊中MwAG在花发育不同时期
的表达量检测
用试剂盒分别提取9瓣红花玉兰花发育不同时期(表1)
景丹龙等: 红花玉兰MwAG基因在花发育不同时期的表达 147
雌蕊和雄蕊的总RNA, 用DNase I反应30分钟, 消化
DNA, 之后用M-MLV反转录酶反转录成cDNA。

1.2.3 同时期不同瓣数红花玉兰雌雄蕊中MwAG的
组织表达量检测
用试剂盒分别提取同地区7月花芽大小相同 (12.1
mm)的9、12、15和18瓣红花玉兰雌蕊和雄蕊的总
RNA, 用DNase I反应30分钟 , 消化DNA, 之后用
M-MLV反转录酶反转录成cDNA。
利用伯乐IQ5 Real-time PCR System(参考SY-
BR Green qPCR Mix (Aidlab, China)试剂盒说明书),
采用三步法进行Real-time PCR扩增。PCR反应程序
为: 第1步, 94°C预变性3分钟; 第2步, 94°C30秒,
56°C20秒, 72°C30秒, 40个循环; 第3步, 95°C30秒,
之后温度降至65°C30秒 , 然后以每秒0.5°C升至
95°C, 61个循环。
根据得到的 Ct值 , 利用 Livak和 Schmittgen
(2001)报道的2– Ct△△ 方法, 分别计算MwAG基因在花
发育不同时期及同时期不同瓣数红花玉兰雌蕊和雄
蕊中的表达量。在研究不同时期MwAG基因的相对表
达量时, 将该基因在11月雌蕊中的表达量设为对照,
其它时期设为不同处理。在研究7月花芽大小相同的
9、12、15和18瓣红花玉兰中MwAG基因的相对表达
量时, 将该基因在18瓣红花玉兰雌蕊中的表达量设
为对照 , 其它雌、雄蕊设为不同处理。利用公式 :
Ct=(CtTarget–CtActin)处理–(CtTarget–CtActin)对照 , 分别计算
其它不同时期及同时期不同瓣数红花玉兰雌、雄蕊中
MwAG基因的2– Ct△△ 值。以上数据均使用Bio-Rad
IQ5 optical system software软件进行分析。
2 结果与讨论
2.1 红花玉兰MwAG基因表达的半定量RT-PCR
和Northern blot杂交分析
半定量RT-PCR分析结果(图2A)表明, MwAG基因仅
在红花玉兰的雄蕊和雌蕊中表达, 在幼叶、外轮和内
轮花被片中不表达。Northern blot杂交分析进一步显
示(图2B), MwAG基因的转录活性仅局限于雌、雄蕊
等可育性生殖器官, 不育的花被片中并未检测到转录
信号。其研究结果与半定量RT-PCR检测结果一致。



图2 红花玉兰不同组织中MwAG基因的半定量RT-PCR(A)和
Northern blot杂交分析(B)
le: 叶; ote: 外轮花瓣; ite: 内轮花瓣; te: 花被片; st: 雄蕊; ca:
雌蕊

Figure 2 Semi-quantitative PCR (A) and Northern blot
analysis (B) of MwAG gene in different tissues of Magnolia
wufengensis
le: Leaf; ote: Outer tepal; ite: Inner tepal; te: Tepal; st: Sta-
men; ca: Carpel

2.2 MwAG基因在红花玉兰雌、雄蕊发育过程中
的表达模式检测
用qRT-PCR技术分析MwAG基因在红花玉兰雌、雄
蕊发育不同阶段表达量的变化规律(图3)。MwAG基因
在雌、雄蕊原基早期分化阶段表达量最高, 之后随着
生长速度的减慢开始下降, 并在夏季 (8月)花芽休眠
时表达量降到极低水平; 9月天气转凉其表达量又开
始略有上升; 冬季的花芽中, 该基因的表达量相对较
低, 而且保持稳定; 次年4月随着气温的回暖, 雌、雄
蕊进入快速发育期并至成熟, 此时其表达量达到一个
较高水平。从表达波峰的波动情况来看, 雄蕊的波峰
出现的时间明显早于雌蕊, 其波峰出现的时间与花芽
分化过程中, 雌、雄蕊形态分化的时间基本吻合。
2.3 同时期不同瓣数红花玉兰雌、雄蕊中MAwu-
AG的表达量检测
同时期花芽长度相同(12.1 mm)的9、12、15和18瓣
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图3 红花玉兰MwAG基因在花芽不同生长时期的表达量

Figure 3 Real-time PCR analysis of MwAG expression in
different floral organs of Magnolia wufengensis at different
developmental stages




图4 同地区、同时期花芽大小相同的9、12、15和18瓣红花玉
兰MwAG基因的表达量

Figure 4 Expression level of MwAG gene in Magnolia
wufengensis flower buds of 9, 12, 15 and 18 petals at the
same region and size


红花玉兰的雌、雄蕊中, MwAG基因的表达分析结果
表明(图4): 在雌、雄蕊原基分化和发育早期, 随着瓣
数的增多, MwAG基因在雌、雄蕊中的表达量呈下降
趋势; 在花芽形态分化过程中, 瓣数越多, 雌、雄蕊
原基分化的时间也相对越晚; 当9瓣品种中MwAG基
因表达出现峰值或临近峰值时, 其它瓣数品种中该基
因的表达还处于一个依次向峰值靠近的过程, 而且
雌、雄蕊分化越早 , 靠近峰值的时间越短。因此 ,
MwAG基因表达水平会出现一个随瓣数增多而呈梯
度递减的过程。这也从另一角度证明了该基因的表达
水平与雌、雄蕊发育的快慢保持一致。
2.4 讨论
本研究结果表明, MwAG基因仅在红花玉兰的雌、雄
蕊中表达, 而在幼叶和花被片中不表达, 其表达的组
织特异性与模式植物拟南芥中AGAMOUS基因一致
(Krizek and Fletcher, 2005); 并与其它非模式植物,
如太行花(Taihangia rupestris)、玫瑰(Rosa rugosa)
和黑樱桃(Prunus serotina)中AGAMOUS同源基因的
表达模式相同(Kitahara et al., 2004; Lü et al., 2007;
Liu et al., 2010)。拟南芥中, AGAMOUS (AG)是重要
的C类MADS-box基因, 在花发育过程中具有促进花
分生组织形成及参与调控雌、雄蕊发育的功能(Coen
and Meyerowitz, 1991; Weigel and Meyerowitz,
1994; Krizek and Fletcher, 2005)。相对于草本植物
而言, 木本植物生长周期长、遗传转化困难且生长发
育方式独特, 因此对于木本植物, 特别是较原始木本
植物的发育基因的功能分析, 目前多数仅通过分析其
表达模式进行推测(Soltis et al., 2006)。本研究中, 红
花玉兰MwAG基因的表达量与其雌、雄蕊发育的快慢
有很强的相关性, 说明MwAG基因与其同源基因功能
类似, 可能是调控红花玉兰雌、雄蕊发育的关键基因。
Wu等(2012)对木兰科植物AG同源基因的功能验证
再次支持了这一观点。
在红花玉兰的花发育过程中, 花芽的分化和生长
与MwAG基因的表达量高低密切相关。MwAG基因在
红花玉兰花发育的整个过程中均有表达, 且其表达量
随着花发育时期的不同而有所差异, 尤其是在其花芽
发育初期和开花期表现得尤为明显。这是因为花发育
初期, 花芽迅速伸长, 该基因的表达量很高。此后,
红花玉兰的花芽发育成熟, 花芽长度保持不变, 该基
因也维持在相对稳定的水平。在开花期, 随着花芽的
伸长, 该基因的表达量相应增高。而在其它相关研究
中, 玉簪hpAG基因在其花发育不同时期和大小不同
的花芽中, 表达量差异也较大(Wang et al., 2012)。
不同瓣数红花玉兰花芽形态分化早期, 花芽长度
相同的红花玉兰的雌、雄蕊中, MwAG基因的表达量
随瓣数的增加呈递减趋势。造成这种差异的原因, 一
方面可能因为在花芽形态分化过程中 , 瓣数越多 ,
雌、雄蕊原基分化的时间也相对越晚, 当9瓣品种中
MwAG基因表达出现峰值或临近峰值时, 其它瓣数品
种中该基因的表达还处于一个依次向峰值靠近的过
景丹龙等: 红花玉兰MwAG基因在花发育不同时期的表达 149
程; 而且, 靠近的时间长短会随雌、雄蕊原基分化的
先后呈反向变化, 即雌、雄蕊分化越早, 靠近峰值的
时间越短, 因此, 其表达水平会出现一个随瓣数增多
而呈梯度递减的过程。另一方面, 前人的研究结果也
显示, AG同源基因的表达区域和表达量对花瓣数量
有明显的影响, 如重瓣月季(Rosa hybrids)中, RhAG
的表达区域越小, 月季瓣数增加越多(Dubois et al.,
2010); 毛茛科 (Ranunculaceae)唐松草 (Thalictrum
thalictroides)中 , 单瓣唐松草的AG直系同源基因
ThtAG被沉默后会变成重瓣(Galimba et al., 2012)。
有关红花玉兰瓣数增多是否与MwAG基因表达量的
降低相关, 仍需进一步深入研究。
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Expression Analysis of MwAG in Different Organs and
Developmental Stages of Magnolia wufengensis
Danlong Jing1, Jiang Ma1, Bo Zhang1, Yiyang Han1, Zhixiong Liu2, Faju Chen1*
1Biotechnology Research Center, China Three Gorges University, Yichang 443002, China; 2College of Horticulture and
Gardening, Yangtze University, Jingzhou 434025, China
Abstract The function gene MwAG as a key transcription factor that plays crucial roles in the development of Magnolia
wufengensis by regulating the development of the stamen and carpel. Semi-quantitative RT-PCR, Northern blot and
quantitative RT-PCR methods were used to identify the spatial and temporal expression patterns of MwAG in M. wufen-
gensis at several important stages of the morphological differentiation of flower buds. MwAG was expressed specially in
the stamen and pistil, with no detectable expression in outer and inner whorls of the perianth and leaves. The expression
was highest at the primordium and mature stages of stamen and pistil during morphological differentiation of organs. The
expression peaked earlier in the stamen than in the pistil, and the time of expression was the same as with morphological
differentiation of the stamen and pistil. At the early stage of the differentiation of flower buds, the expression was low when
flower buds had more petal numbers of the same size, and the time of expression was consistent with the development
and differentiation of the stamen and pistil in different flower buds (i.e., the more the petal numbers, the later the time of
differentiation of stamen and pistil). MwAG may play a crucial role in stamen and carpel development of M. wufengensis.
Key words Magnolia wufengensis, MwAG gene, flower development, qRT-PCR
Jing DL, Ma J, Zhang B, Han YY, Liu ZX, Chen FJ (2013). Expression analysis of MwAG in different organs and de-
velopmental stages of Magnolia wufengensis. Chin Bull Bot 48, 145–150.
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* Author for correspondence. E-mail: chenfj616@163.com
(责任编辑: 孙冬花)