全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (3): 286–291, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00286
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收稿日期: 2011-10-28; 接受日期: 2012-03-15
基金项目: 广东省科技计划(No.2007B020801007)和广州市科技计划(No.11A63030233)
* 通讯作者。E-mail: hqtian@jingxian.xmu.edu.cn
五唇兰合子与原胚的分离
伍成厚1, 2, 李冬妹3, 田惠桥1*
1厦门大学生命科学学院, 厦门 361005; 2广州市园林科学研究所, 广州 510405
3顺德职业技术学院, 顺德 528300
摘要 分离合子和原胚可以为植物受精和胚胎发生提供很好的研究材料, 因此具有重要意义。用酶解-振荡法分离出五唇兰
(Doritis pulcherrima)受精后胚囊, 然后以显微解剖获得合子和原胚。酶解液组成为0.7%–1.3%纤维素酶、0.6%–1.0%果胶
酶和10%甘露醇, pH值为5.8, 酶解时间0.5–3.0小时。在分离的早期原胚和接近成熟的球形胚中, 珠孔端均有较发达的胚柄
吸器。实验获得了对五唇兰胚胎发育的新认识, 合子和原胚的成功分离也为进一步的细胞学和分子生物学研究打下基础。
关键词 五唇兰, 显微解剖, 原胚, 胚柄吸器, 合子
伍成厚, 李冬妹, 田惠桥 (2012). 五唇兰合子与原胚的分离. 植物学报 47, 286–291.

受精和胚胎发生是植物发育的一个重要过程。植
物通过一系列的细胞融合、伸长、分裂和分化, 完成
器官分化。通过分离合子和原胚可以为植物受精和胚
胎发生提供很好的研究材料。合子的分离在水稻
(Oryza sativa)(Zhao et al., 2000)、玉米(Zea mays)
(Mòl et al., 1995)、小麦(Triticum aestivum)(Kumlehn
et al., 1998)、烟草(Nicotiana tabacum)(傅春梅等,
1996)、蓝猪耳(Torenia fournieri)(陈素红等, 2005)等
少数植物上已取得成功, 并在此基础上开展了大量的
细胞学和分子生物学研究。近年来, 人们利用分离的
植物早期原胚还开展了水稻(陈绍荣等, 2000; Wang
et al., 2002)、玉米(Meyer et al., 2007)、小麦(Wang
and Zhao, 2003)、烟草(Li et al., 2001)、拟南芥
(Arabidopsis thaliana)(Zou et al., 2002; Hu et al.,
2006)等植物的胚胎发生和杂交优势预测等研究。
五唇兰(Doritis pulcherrima)为兰科五唇兰属植
物, 是产于我国海南岛的一种野生兰花, 其花型和株
型均优, 具有广阔的开发应用前景(唐源江等, 1998;
Wu et al., 2004)。本文采用酶解-振荡法分离五唇兰
受精后的胚囊, 然后以显微解剖分离出合子及原胚。
本实验不仅获得比石蜡切片法更加直观的结果, 丰富
了五唇兰胚胎发育的知识, 而且为进一步的细胞学和
分子生物学研究打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
五唇兰(Doritis pulcherrima Lindl.)开花植株引自中国
科学院华南植物园, 在广州市园林科学研究所的水帘
温室内栽培。在开花期间进行人工授粉, 每个花葶授
基部2朵花, 并将花葶其余部分剪除, 对授粉后的植
株进行常规管理。授粉后45–90天, 取正常发育蒴果
内的胚珠作为实验材料。
1.2 方法
五唇兰合子及原胚的分离实验在厦门大学进行。解剖
分离液的基本成分为: 5 mmol·L–1 CaCl2, 5 mmol·L–1
KH2PO4, 0.7 mmol·L–1MaSO4, 3 mmol·L–12-N-吗啡
啉乙磺酸(MES), 10%(w/v)甘露醇。在基本分离液中,
加入果胶酶(Serva)和纤维素酶(Onozyka R-10), 配
成含酶的分离液(pH5.8)。为解除珠被细胞的阻碍, 进
行了3个浓度酶解实验: (1) 0.7%纤维素酶+0.6%果胶
酶; (2) 1.0%纤维素酶＋0.9%果胶酶; (3) 1.3%纤维
素酶+1.0%果胶酶。
将不同时期、不同处理的材料置于微振荡仪上室
温酶解0.5–3.0小时。之后在倒置显微镜(Leica DM
IRB)下, 将分离的胚囊置于10%甘露醇中, 用自制玻
·技术方法·
伍成厚等: 五唇兰合子与原胚的分离 287
璃针直接解剖胚囊, 使合子与原胚分离。
应用显微操作仪(Leica DC-180)收集分离的合子
和原胚, 用1 mg·mL–14,6-二氨基-2-苯基吲哚(4′,6-
diamidino-2-phyenylindole, DAPI)并以1/100的量染
色细胞核。在荧光显微镜(Leica DM R-60)下观察, 采
用蓝色光激发观察荧光。采用数码成像系统进行观察
并拍照。
2 结果与讨论
2.1 酶解对胚囊分离的影响
五唇兰的胚珠在酶解-振荡0.5小时后, 即有珠被细胞
被分离出来。随着酶解时间的延长, 珠被细胞被大量
分离。酶解3小时, 3个处理分离出来的珠被细胞原生
质体均完好, 呈球形, 细胞核居中或靠边, 并有个别
仅具有1层不完整珠被细胞的胚囊酶解出来。胚珠在
上述酶液中浸泡14小时, 在3个处理中均很少见裸露
的胚囊分离出来。
2.2 合子的分离
五唇兰为正常双受精, 花粉管通过一个退化的助细胞
进入胚囊后释放出2个精子, 分别与极核和卵细胞融
合, 完成双受精。用浓度(2)酶液处理0.5–2小时, 结合
人工解剖法, 从授粉后45–60天的五唇兰胚珠均可以
分离出合子。
刚受精的胚囊在珠孔端具有一个“尾巴”状的结
构, 这一结构似花粉管通过胚珠珠孔端进入胚囊的通
道。刺破胚囊侧壁, 可以分离出合子, 此时助细胞和
反足细胞尚存或虽退化亦有痕迹, 初生胚乳核则开始
发育(图1A)。 受精后, 合子有15天左右的休眠期。在
此期间合子体积增大, 由近圆球形(图1B, C)转变为
扁球形(图1D), 极性加强。初生胚乳核体积迅速增大,
占整个胚囊体积的80%以上(图1B, C), 之后即开始
退化(图1D)。此时合子尚未分裂, 但DAPI染色后显示
初生胚乳核已经没有荧光, 仅合子显示较强的荧光
(图1E)。在合子休眠期间, 助细胞及反足细胞均退化、
萎缩至完全消失。
在分离液甘露醇浓度为10%时, 五唇兰分离的合
子近圆球形, 细胞质浓稠, 细胞核近中央稍偏一侧,
可用自制的玻璃针在倒置显微镜下收集(图1F)。
2.3 原胚的分离
应用酶解+解剖分离五唇兰的胚, 酶解需要的时间随
胚的发育程度而相应缩短。早期原胚需要酶解0.5–
1.0小时, 而近成熟的球形胚不经酶解, 直接解剖就
可以被分离出来。
授粉后70天, 胚已经发育成多个细胞, 在珠孔端
还形成了一个很发达的吸器(图2A)。授粉后85天, 五
唇兰种子已接近发育成熟, 但胚仅仅是一团没有分化
的细胞, 并不具备子叶、胚根等器官, 即仍停留在球
形胚时期; 在其珠孔端也可以看到一个很发达的吸器
(图2B)。DAPI荧光染色显示, 胚柄吸器处的荧光比胚
体细胞的荧光更为强烈(图2C)。
2.4 讨论
2.4.1 五唇兰合子分离的应用前景
被子植物合子的分离是其培养与遗传转化研究的前
提, 也是由此构建其cDNA文库开展受精前后基因表
达研究的起点, 具有重要的意义。但由于珠被细胞的
阻碍, 其分离技术相对困难, 迄今为止仅在少数植物
获得成功。目前已采用酶解-研磨法从烟草受精后胚
珠中分离出胚囊, 之后通过解剖由胚囊分离出合子
(傅春梅等 , 1996)。对于大麦 (Hordeum vulgare)
(Holm et al., 1994)和小麦(Kumlehn et al., 1998)则
是采用非酶处理直接解剖出合子。在水稻(韩红梅等,
1998; Zhang et al., 1999; Zhao et al., 2000; 赵洁等,
2002)、玉米(Hoshino et al., 2004)、小麦(赵洁等,
1998, 2002; Kumlehn et al., 1998, 1999; Wang and
Zhao, 2003)、烟草(Li and Yang, 2000; He et al.,
2004)等植物中, 不仅已成功地开展了合子的分离,
还在细胞生物学和分子生物学研究中取得新的进展。
五唇兰的蒴果内含有数以万计发育基本同步的胚珠,
可以为合子的分离提供丰富的材料。虽然授粉后需要
45–50天才能形成合子, 但其受精后合子通常有一段
较长的休眠时间(约15天), 这给合子分离以充裕的时
间, 同时也便于研究合子在休眠期的一系列变化及如
何从休眠状态启动细胞分裂等生命起源的基本问题。

2.4.2 支持五唇兰胚发育的营养来源
胚和胚乳同是双受精的产物, 它们在发育过程中有着
密切的关系。胚最后成为新一代独立生活的孢子体,
288 植物学报 47(3) 2012


图1 五唇兰合子的分离(珠孔端均朝下)
(A) 酶解后从刚受精的胚囊中解剖出合子, 示胚乳开始发育, 2个助细胞一个完好, 一个已经退化, 反足细胞尚有存在的痕迹; (B)
解剖的合子及发达的胚乳; (C) 解剖的合子及开始退化的胚乳; (D) 解剖的合子和退化的胚乳; (E) DAPI荧光染色显示(D)中合子的
核; (F) 应用显微操作仪吸取合子。Bar=10 μm。An: 反足细胞; EN: 胚乳核; S: 助细胞; Z: 合子

Figure 1 Isolation of zygote in Doritis pulcherrima (Micropylar downward in all figures)
(A) Zygote dissected from a just fertilized embryo sac after enzymatic maceration, showing the developing endosperm, two
synergids one was well and another degenerated, the antipodals were still at the chalazal end; (B) Dissected zygote and de-
veloped endosperm; (C) Dissected zygote and degenerating endosperm; (D) A dissected embryo sac containing zygote and
degenerated endosperm; (E) The fluorescence of DAPI showing the nucleus of zygote (D); (F) Zygote drawing by the glasstube
of a micromanipulator. Bar=10 μm. An: Antipodals; EN: Endospermal nucleus; S: Synergid; Z: Zygote

伍成厚等: 五唇兰合子与原胚的分离 289



图2 五唇兰原胚的分离(珠孔端均朝下)
(A) 多细胞胚和胚柄吸器(Bar=10 μm); (B) 接近成熟的球形胚和胚柄吸器(Bar=25 μm); (C) DAPI荧光染色显示球形胚的核(Bar=25
μm)。PE: 原胚; SH: 胚柄吸器

Figure 2 Isolation of proembryo in Doritis pulcherrima (Micropylar downward in all figures)
(A) Multicellular embryo and its developed suspensor haustorium(Bar=10 μm); (B) Maturing spherical proembryo and its sus-
pensor haustorium(Bar=25 μm); (C) The fluorescence of DAPI showing the nuclei of the spherical proembryo(Bar=25 μm). PE:
Proembryo; SH: Suspensor haustorium


而胚乳则是作为一种特殊的营养组织, 或迟或早被胚
的发育所吸收而最终消失。唐源江等(1998)报道五唇
兰为正常双受精, 2个精细胞中1个与卵细胞融合形成
合子, 另1个则与2个已融合的极核(次生核)融合形成
初生胚乳核, 初生胚乳核体积急剧膨大, 但胚乳核经
过一个时期的膨大后即开始退化。本实验中五唇兰胚
乳核体积膨大一段时间后即停止发育, 并在合子分裂
前退化。本研究结果与唐源江等(1998)报道的结果基
本一致。
在缺少胚乳的植物(如兰科、河苔草科和菱草科)
中常常存在一种特殊的结构来代替胚乳的作用, 以保
证胚发育的营养来源(胡适宜, 1982)。五唇兰分离的
早期原胚(图2A)和接近成熟的球形胚(图2B)中, 珠孔
端均可见发达的胚柄吸器。在五唇兰种子发育后期珠
被细胞先后发生程序性死亡, 而珠孔端的体细胞在接
近成熟种子的球形胚时期仍未退化(图2C), 显示胚柄
吸器作为给幼胚发育提供营养的通道而一直存在, 从
另一侧面也验证了胚柄吸器这一特殊结构对兰花幼
胚发育的价值。
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伍成厚等: 五唇兰合子与原胚的分离 291
Isolation of Zygotes and Proembryos in Doritis pulcherrima
Chenghou Wu1, 2, Dongmei Li3, Huiqiao Tian1*
1School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China; 2Guangzhou Institute of Landscape Gardening,
Guangzhou 510405, China; 3Shunde Polytechnic, Shunde 528300, China
Abstract The isolation of zygotes and proembryos would provide invaluable material for the study of plant fertilization
and embryogenesis. We isolated zygotes and proembryos by manual microdissection from Doritis pulcherrima embryo
sacs with only one layer of integument cells after pretreatment combining enzymatic maceration with shaking to the
ovules. The enzymatic maceration was with 0.7%–1.3% cellulase, 0.6%–1.0% pectinase, and 10% mannitol, pH5.8, for
one-half to 3 hours. Suspensor haustorium was discovered on the micropylar end from early proembryo to maturing
spherical proembryo stages. The successful isolation of zygotes and proembryos in D. pulcherrima provides a novel ap-
proach to study embryogenesis and is a valuable experimental tool for further detailed research at the cellular and mo-
lecular levels.
Key words Doritis pulcherrima, microdissection, proembryo, suspensor haustorium, zygote
Wu CH, Li DM, Tian HQ (2012). Isolation of zygotes and proembryos in Doritis pulcherrima. Chin Bull Bot 47, 286–291.
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* Author for correspondence. E-mail: hqtian@jingxian.xmu.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)