全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2011, 46 (3): 285–292, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2011.00285
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收稿日期: 2010-10-18; 接受日期: 2011-01-14
基金项目: 国家自然科学基金(No.30900973)
* 通讯作者。E-mail: wzc@henu.edu.cn
甘露醇对拟南芥基因组DNA甲基化的影响
杜亚琼, 王子成*
河南大学生命科学学院植物种质资源与遗传工程实验室, 开封 475004
摘要 以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料, 研究不同浓度甘露醇处理下拟南芥幼苗生长发育及其基因组DNA的甲基化
水平和变化模式。结果表明, 用50、100、150和200 mmol·L―1甘露醇处理拟南芥种子会对拟南芥幼苗的形态特征和生长态
势产生影响; 甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)分析表明, 经50、100、150
和200 mmol·L―1甘露醇处理后, 基因组DNA甲基化比率分别为17.75%、21.15%、15.49%和46.10%。甘露醇处理使拟南
芥发生基于DNA甲基化水平和模式改变的表观遗传变异。与对照相比, 在50、100、150和200 mmol·L–1甘露醇处理下拟南
芥幼苗基因组DNA的甲基化和去甲基化比率分别为5.78%、15.48%、10.71%、33.73%及10.98%、5.36%、8.33%、7.69%。
由此推测, 5-甲基胞嘧啶百分含量随着甘露醇胁迫的增强而发生不同程度的变化。
关键词 拟南芥, DNA甲基化, 甘露醇, MSAP
杜亚琼, 王子成 (2011). 甘露醇对拟南芥基因组DNA甲基化的影响. 植物学报 46, 285–292.
甘露醇(mannitol)是一种植物组织相容性溶质,
对植物培养细胞无毒害, 在生理学研究中可被用作组
织液吸收剂, 被认为是比PEG26000更好的水分胁迫
因子(赵宇玮等, 2005)。研究发现, 甘露醇预处理比低
温预处理和对照能明显地提高大麦(Hordeum vulgare)
花粉粒存活率和质量, 有利于进一步分裂形成胚状体
和愈伤组织; 并能明显提高大麦花药培养愈伤组织诱
导率、绿苗分化率及绿苗产量(刘辉等, 2009)。甘露醇
高渗处理可促进根癌农杆菌对石斛兰(Dendrobium)的
转化效率(冯莹和赖钟雄, 2009)。在进行植物组织培养
时, 添加一定浓度的甘露醇可以抑制植物的生长, 因
而甘露醇被普遍用来保存种质资源, 保存时间为1–2
年。而Harding(1994)发现高渗透胁迫能够影响植物
DNA甲基化, 甘露醇处理可影响马铃薯(Solanum tu-
berosum)基因组DNA和rDNA的甲基化状态。
DNA甲基化是表观遗传学研究的热点之一。在生
物进化历程中, 甲基化参与了越来越多的生物学过
程, 包括基因的表达调控、胚胎发育、细胞分化、基
因组印迹、X染色体失活等(Zilberman, 2008)。植物
的表观遗传调控如DNA甲基化, 不改变DNA序列, 而
通过对基因组进行可塑性的修饰, 使植物能够相对快
速地适应新的环境条件(Causevic et al., 2005)。DNA
甲基化水平的降低对植物的一些重要性状会产生极
为重要的影响, 非生物胁迫能够造成全基因组和特定
位点胞嘧啶甲基化水平的升高或降低(Lukens and
Zhan, 2007)。植物在应对环境胁迫时甲基化水平的
改变是动态的, 如铝(Choi and Sano, 2007)、重金属
(Aina et al., 2004)和水分胁迫(Labra et al., 2002)也
会造成全基因组和特定位点胞嘧啶甲基化水平的增
加或降低(Zhao et al., 2010)。
目前, 有关甘露醇对植物基因组DNA甲基化的
影响尚未见报道。为此, 本文以拟南芥(Arabidopsis
thaliana)为材料, 通过用不同浓度甘露醇处理拟南芥
种子, 测定处理后植株的形态特征及生长态势, 并采
用甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive am-
plification polymorphism, MSAP)方法分析其对拟南
芥CCGG位点胞嘧啶甲基化水平和模式的变化造成
的影响, 为从DNA水平上揭示植物对甘露醇处理的
反应机制提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col-0生态型为实验
·研究报告·
286 植物学报 46(3) 2011
材料。甘露醇为分析纯, 购于天津市化学试剂三厂。
1.2 培养条件与处理方法
取干燥的种子经75%乙醇表面消毒30秒, 再用0.1%
升汞表面消毒5–8分钟, 用无菌水冲洗6–8次后, 点
种于MS固体培养基 (MS盐+3%蔗糖+0.6%琼脂 ,
pH5.8)上。于4°C条件下春化3天, 光照条件为16小
时光照/8小时黑暗, 温度18–22°C, 光照强度为150
μmol·m–2·s–1, 相对湿度为80%, 于培养间培养2周后
备用。将甘露醇直接加入MS培养基中, 甘露醇浓度分
别为50、100、150和200 mmol·L–1, 对照为无甘露醇
的普通MS培养基, 灭菌后使用。用甘露醇处理14天,
每个处理100株, 重复3次。 生长2周的幼苗从培养皿
转移到蛭石:营养土=1:1(v/v)的土壤中, 于培养间培
养。用透明塑料罩遮盖, 保持幼苗处于湿度较高的环
境。约2周后摘掉罩子, 9周后收获成熟种子。
1.3 生长状况测定
统计点种1–6天时的萌发率。甘露醇处理21天后, 测
定幼苗的形态特征和生长态势。每个处理100株, 重
复3次。
1.4 DNA提取
幼苗培养14天后进行DNA提取。每一处理分别取
30–40株幼苗的嫩叶混合。采用CTAB法(Micheli et
al., 1994)提取DNA。去除RNA纯化后的DNA质量和
浓度检测采用0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度
法。DNA样品于−20°C冰箱中保存备用。
1.5 MSAP分析
MSAP分析操作过程参照何艳霞等(2007)所述方法。
分子标记检测所用的接头及引物均由上海生工公司
合成。
2 结果与讨论
2.1 甘露醇对拟南芥幼苗生长发育的影响
统计不同浓度甘露醇处理后拟南芥种子的萌发率。结
果表明, 在50和100 mmol·L–1甘露醇处理下种子萌
发率与对照无显著差异, 而150和200 mmol·L–1甘露
醇处理则抑制种子萌发(图1)。甘露醇处理可影响拟南
芥幼苗的形态特征和生长态势(图2)。甘露醇处理造成
幼苗水分胁迫, 致使植株较矮, 株型紧凑; 叶面积小,
叶狭长, 叶片薄; 根毛显著伸长, 根系发达, 向四周



图1 不同浓度甘露醇处理的拟南芥种子萌发率

Figure 1 The germination rate of Arabidopsis seeds treated
by different concentrations of mannitol



图2 不同浓度甘露醇处理21天的拟南芥幼苗
(A) 0 mmol·L–1; (B) 50 mmol·L–1; (C) 100 mmol·L–1; (D) 150
mmol·L–1; (E) 200 mmol·L–1

Figure 2 Arabidopsis seedlings grown for 21 days treated
by different concentrations of mannitol
(A) 0 mmol·L–1; (B) 50 mmol·L–1; (C) 100 mmol·L–1; (D) 150
mmol·L–1; (E) 200 mmol·L–1
杜亚琼等: 甘露醇对拟南芥基因组 DNA 甲基化的影响 287
扩散的范围较大; 幼苗的抗旱能力增强。随着甘露醇
浓度的增加, 植株逐渐变矮。经甘露醇处理的拟南芥
在解除胁迫9周后, 株高与对照无显著差异。与对照
相比, 浓度大于100 mmol·L–1的甘露醇胁迫均延迟了
抽薹和开花时间, 且浓度越高抑制作用越显著。
2.2 甘露醇处理引起的甲基化水平变化
HpaII和MspI是一组同裂酶 , 二者均识别并切割5-
CCGG-3序列。HpaII对胞嘧啶的甲基化极其敏感, 它
不能切割任何1个或2个胞嘧啶均甲基化的序列, 但
是若只在单链发生甲基化, 它能够识别并切割。MspI
只对外部胞嘧啶的甲基化敏感。样品DNA经HpaII/
EcoRI(H)和MspI/EcoRI(M)酶切后通常产生4种甲基
化带型, 但是在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胶上只能检
测出3种甲基化带型。I型带是在EcoRI/HpaII和EcoRI/
MspI两种酶切组合中均出现的带, 表明CCGG位点
未发生甲基化 (图3中D1所示 ); II型带是在EcoRI/
HpaII酶切中不出现但在EcoRI/MspI酶切中出现, 表
明CCGG位点发生全甲基化(图3中D2所示); III型带
是在EcoRI/HpaII酶切中出现但在EcoRI/MspI中不出
现的带, 表明CCGG位点发生半甲基化(图3中D3所
示)。用EcoRI和HpaII–MspI的16对引物组合共扩增出
1 608条带。带型分布见表1。
利用不同的引物组合对来自对照和甘露醇处理
的拟南芥幼苗基因组DNA进行MSAP分析, 检测拟南
芥在响应甘露醇处理过程中的DNA甲基化模式变化。
甘露醇处理导致了拟南芥幼苗全基因组DNA胞嘧啶
甲基化水平的改变, 而且100和200 mmol·L–1甘露醇
处理组半甲基化率高于全甲基化率, 50和150 mmol·
L–1甘露醇处理组半甲基化率均低于全甲基化率(表
1)。由此推测, 拟南芥经甘露醇处理后存在基于DNA
甲基化水平和模式改变的表观遗传变异。对照所检测
到的内侧C完全甲基化水平高于外侧C半甲基化水平,
甘露醇处理材料所检测到的内侧C完全甲基化和外侧
C半甲基化水平均有升有降, 表现出不同程度的变异,
但无统一规律。用100和200 mmol·L–1甘露醇分别处



图3 甘露醇处理与对照之间拟南芥幼苗基因组的甲基化敏感性扩增结果
H1、H2、H3、H4和H5为HpaII/EcoRI酶切, M1、M2、M3、M4和M5为Mspl/EcoRI酶切; H1和M1泳道为对照组的MSAP带型; H2、
H3、H4、H5和M2、M3、M4、M5泳道为处理组的MSAP带型; A1–A4、B1–B4、C和D1–D3所示带型见表2。

Figure 3 Profiles of methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) in Arabidopsis seedlings between mannitol
treatments and control
H1, H2, H3, H4, H5 represent digestion with HpaII/EcoRI, and M1, M2, M3, M4, M5 represent digestion with Mspl/EcoRI; Lanes
H1 and M1 are MSAP patterns of the controls, while lanes H2, H3, H4, H5 and M2, M3, M4, M5 are those of mannitol treatments;
Band patterns of A1–A4, B1–B4, C and D1–D3 are referred to Table 2.

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表1 不同浓度甘露醇处理对拟南芥幼苗基因组DNA甲基化水平的影响
Table 1 Effects of different mannitol concentrations on the levels of genomic DNA methylation in Arabidopsis seedlings
Types of amplified bands
The CCGG loci of
methylated
The CCGG loci
of non-methylated
Fully methylated loci Half methylated loci

Mannitol
concentration
(mmol·L–1)
Type I Ratio
(%)
Type II Ratio
(%)
Type III Ratio
(%)
Total
amplified
bands
Total
methylated
bands
Methylated
bands ratio
(%)
0 (CK) 254 74.71 64 18.82 22 6.47 340 86 25.30
50 278 82.25 36 10.65 24 7.10 338 60 17.75
100 246 78.85 22 7.05 44 14.10 312 66 21.15
150 262 84.52 42 13.55 6 1.94 310 48 15.49
200 166 53.90 34 11.04 108 35.06 308 142 46.10
总扩增带数=类型I+类型II+类型III; 总甲基化带数=类型II+类型III; 完全甲基化比率=类型II/总扩增带数; 半甲基化比率=类型III/总扩
增带数; 甲基化带比=总甲基化带数/总扩增带数
Total amplified bands=Type I+Type II+Type III; Total methylated bands=Type II+Type III. Fully methylated loci ratio=Type II/
(Type I+Type II+Type III); Half methylated loci ratio=Type III/(Type I+Type II+Type III); Methylated bands ratio=(Type II+Type III)/
(Type I+Type II+Type III)


理时, 拟南芥基因组CCGG位点发生甲基化的方式以
双链半甲基化(mCCGG)为主; 用50和150 mmol·L–1甘
露醇分别处理时, 拟南芥基因组CCGG位点发生甲基
化的方式则以双链全甲基化(CmCGG)为主; 浓度达
375 mmol·L–1以上甘露醇处理组幼苗全部死亡。
2.3 甘露醇处理诱导甲基化状态的变化
利用不同的引物组合对4种不同浓度甘露醇处理和对
照样品DNA的HpaII/EcoRI(H)和MspI/EcoRI(M)的酶
切产物进行选择性扩增。通过比较分析MSAP电泳图
谱(图3), 可对某一特定CCGG位点的甲基化模式变
异进行分析。
甘露醇处理与对照的甲基化敏感性扩增共出现
12种带型。甲基化带型主要有多态性和单态性2类。
多态性即对照与处理在甲基化模式上不同, 表明CC-
GG位点甲基化状态在甘露醇处理后发生改变。该多
态性又有3种状态, 即甲基化(A型)、去甲基化(B型)
和不定类型(C型)。A型中的A1和A2为重新甲基化(对
照H和M泳道都有带, 而处理仅H或M泳道有带), A3
和A4为超甲基化(对照仅H或M有一条带, 而处理H和
M泳道都无带)。A型表明甘露醇诱导拟南芥幼苗基因
组DNA发生了甲基化水平增加的变化。B型含B1、B2、
B3和B4, 为去甲基化类型, B型甲基化状态与A型相
反, 表明甘露醇处理后基因组DNA甲基化水平下降。
C型为不定类型, 对照组与处理组中DNA甲基化程度
的差异无法确定。单态性即对照与处理之间有相同的
带型(D型), 表明甘露醇处理后CCGG位点的甲基化
状态未改变。D1型为未甲基化, D2和D3型为半甲基
化(李雪林等, 2009)。处理与对照的甲基化模式带型
A、B、C和D及相应的位点数见表2。
与对照相比, 用50、100、150和200 mmol·L–1
甘露醇处理的拟南芥幼苗基因组DNA甲基化(A型)位
点数分别占总甲基化多态性扩增位点数的5.78%、
15.48%、10.71%和33.73%; 去甲基化(B型)位点数分
别占总甲基化多态性扩增位点数的10.98%、5.36%、
8.33%和7.69%; 总甲基化多态性分别为17.92%、
21.43%、19.05%和47.33%(表3)。甘露醇处理使拟
南芥幼苗基因组DNA的甲基化状态发生了不同程度
的变化; 在扩增的甲基化位点中, 50 mmol·L–1甘露醇
诱导去甲基化的位点数稍高于发生甲基化的位点数,
100、150和200 mmol·L–1甘露醇诱导甲基化的位点数
均高于发生去甲基化的位点数 (图4), 同时基因组
DNA甲基化多态性也随之升高。拟南芥幼苗基因组
DNA甲基化和去甲基化之比随着甘露醇胁迫的增强
而发生不同程度的变化。
2.4 讨论
甘露醇作为一种生长延缓剂, 在组织培养过程中可以
杜亚琼等: 甘露醇对拟南芥基因组 DNA 甲基化的影响 289
表2 甘露醇处理拟南芥幼苗与对照的甲基化状态
Table 2 Patterns of DNA methylation in the mannitol-treated Arabidopsis seedlings
Digestion* Changes of methylation status Number of sites
H M H M Before treatment After treatment CK-50 CK-100 CK-150 CK-200
Band
pattern**
0 0 0 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
2 0 1 9 B3
0 0 1 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
2 1 1 2 B4
0 1 1 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
14 8 11 2 B1
1 0 1 1
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
1 0 1 0 B2
1 1 1 0
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
4 10 0 36 A2
1 1 0 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
0 0 5 1 A1
0 1 0 0
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
0 12 6 14 A3
1 0 0 0
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
6 4 7 6 A4
0 1 1 0
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
2 1 0 10 C
1 1 1 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
122 114 118 79 D1
1 0 1 0
CCGG CCGG
GGCC CCGG
CCGG CCGG
GGCC GGCC
4 7 3 4 D2
0 1 0 1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
16 11 15 6 D3
* H和M分别代表HpaII/EcoRI和MspI/EcoRI酶切 1: 有带; 0: 无带; ** 带型如图3所示; C和CC均表示甲基化的胞嘧啶
* H represented digestion with HpaII/EcoRI, M represented digestion with Mspl/EcoRI 1: Presence of band; 0: Absence of band;
** Band patterns were shown in figure 3; C and CC represented methylated cytosine



表3 不同浓度甘露醇处理对拟南芥幼苗基因组DNA甲基化状态的影响
Table 3 Effects of different concentrations of mannitol on the patterns of genomic DNA methylation in Arabidopsis seedlings
Polymorphism bands Monomorphism bandsMannitol
concentration
(mmol·L–1)
Methy-
lated
bands
Type
A
Ratio
(%)
Type
B
Ratio
(%)
Type
C
Ratio
(%)
Polymorphism
bands
Ratio
(%)
Type D Ratio
(%)
CK-50 173 10 5.78 19 10.98 2 1.16 31 17.92 142 82.08
CK-100 168 26 15.48 9 5.36 1 0.60 26 21.43 132 78.57
CK-150 168 18 10.71 14 8.33 0 0 32 19.05 136 80.95
CK-200 169 57 33.73 13 7.69 10 5.92 80 47.33 89 52.67
甲基化带数=类型A+类型B+类型C+类型D; 多态性带数=类型A+类型B+类型C; 总甲基化多态性比率=类型A+类型B+类型C/甲基化
带数; 单态性比率=类型D/甲基化带数
Methylated bands=Type A+Type B+Type C+Type D; Polymorphism bands=Type A+Type B+Type C; Methylated polymorphism
loci ratio=Type A+Type B+Type C/methylated bands; Monomorphism loci ratio=Type D/methylated bands

290 植物学报 46(3) 2011


图4 甘露醇处理引起的拟南芥幼苗基因组DNA甲基化和去甲
基化的变化趋势

Figure 4 Trends of genomic DNA methylation and demeth-
ylation changes in Arabidopsis seedlings treated by mannitol


造成植物形态的变化。用甘露醇处理马铃薯、黑豆等
都会影响其形态特征和生长态势(Harding, 1994; 杨
卫民等, 2010)。甘露醇处理导致拟南芥幼苗处于水分
胁迫状态, 其形态特征与生长状况发生了一系列适应
性变化: 株型紧凑、根系发达、叶面积减小等, 这样
可以减少水分的过度散失, 增强植株的抗旱能力。
在植物中, DNA甲基化的生物学作用主要体现在
基因表达调控和维持基因组的稳定性等方面 (Fin-
negan et al., 2000)。基因的甲基化可抑制基因的表
达, 当基因处于表达状态时, 甲基化水平往往很低,
随着生长发育的进行需要将某些基因关闭, 就会在该
基因的启动子或编码区发生重新甲基化, 使基因转录
受到抑制, 基因表达失活, 从而终止其表达(Wass-
enegger, 2000)。环境刺激和遗传会造成甲基化的改
变, 非生物胁迫诱导胁迫响应因子基因的甲基化发生
改变。盐胁迫通过刺激抗氧化系统来适应逆境胁迫,
诱导玉米 (Zea mays)幼苗zmPP2C甲基化下调和
zmGST表达上调的改变(Tan, 2010)。本研究中, 拟
南芥在甘露醇处理下存在基于DNA甲基化水平和模
式改变的表观遗传变异。50、100和150 mmol·L–1甘
露醇处理下的拟南芥幼苗基因组DNA甲基化水平均
低于对照(表1), 推测可能与基因表达有关。低甲基化
是一种简单且间接影响逆境胁迫的方式, 或是一种准
确调控基因表达的防御机制, 特异序列的甲基化异常
与基因表达改变相关(Labra et al., 2002)。
对不同浓度甘露醇处理下拟南芥基因组DNA甲
基化模式的分析表明, 50 mmol·L–1甘露醇处理下的
拟南芥幼苗基因组DNA去甲基化的比率高于甲基化
的比率, 其生长受到促进; 在100–200 mmol·L–1甘露
醇胁迫下, 拟南芥幼苗基因组DNA甲基化的比率高
于去甲基化的比率, 使其生长受到不同程度的影响。
研究表明, 某些逆境胁迫可提高DNA的甲基化水平,
如重金属(Cd和Pb)可以引起水稻(Oryza sativa)、小
麦(Triticum aestivum)、油菜(Brassica compestris)
等幼苗基因组中的总甲基化水平升高(Labra et al.,
2002; Ge et al., 2002)。本研究表明, 不同浓度甘露
醇处理下, 拟南芥幼苗基因组DNA甲基化模式的变异
有明显差异。甲基化变异模式以甲基化为主(5.78%–
33.73%), 去甲基化变异较少(5.36%–10.98%)(图4)。
这与其它逆境胁迫下的DNA甲基化模式变化趋势一
致(Kovalchuk et al., 2003)。经甘露醇处理后拟南芥
基因组DNA某些位点的甲基化状态发生变化, 可能
产生或启动对甘露醇胁迫的能动应激机制, 胁迫持续
增强时利用甲基化关闭相关基因而终止其表达, 从而
减少消耗以维持最低生长发育需要(Ge et al., 2002)。
通过MSAP检测到在不同浓度甘露醇处理下拟
南芥基因组中的胞嘧啶甲基化水平存在差异, 这些差
异的片段是否与拟南芥响应甘露醇胁迫有关, 具体涉
及哪些基因, 尚需进一步研究。只有更深入地理解甘
露醇处理下基因组DNA的甲基化及其逆境适应机制,
才能更加全面地分析非生物胁迫下的表观遗传现象,
并为作物的改良提供新的途径。
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292 植物学报 46(3) 2011
Methylation-sensitive Amplified Polymorphism Analysis of DNA
Methylation in Arabidopsis Under Mannitol Treatment
Yaqiong Du, Zicheng Wang*
Laboratory of Plant Germplast and Genetic Engineering, College of Life Science, Henan University, Kaifeng 475004, China
Abstract We aimed to assess the effect of mannitol treatment on plant growth, as well as genomic DNA methylation
levels and patterns in Arabidopsis thaliana by methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) analysis. Mannitol at
50, 100, 150 and 200 mmol·L–1 promoted the root length of Arabidopsis seedlings. MSAP analysis revealed that levels of
5-methyldeoxycytidine (5-mdC) in mannitol-treated seedlings were also altered significantly, from 17.75%, 21.15%,
15.49% to 46.10% in plants treated with 50, 100, 150 and 200 mmol·L–1 mannitol, respectively. Thus, mannitol caused
epigenetic changes in all samples based on different levels and patterns of DNA methylation. As the controls, methylation
and demethylation of DNA in the seeds treated with mannitol was 5.78%, 15.48%, 10.71%, 33.73% and 10.98%, 5.36%,
8.33%, 7.69%, respectively. Mannitol causes a dose-dependent and transient change in global 5-mdC levels in Arabi-
dopsis seedlings.
Key words Arabidopsis, DNA methylation, mannitol, methylation-sensitive amplified polymorphism
Du YQ, Wang ZC (2011). Methylation-sensitive amplified polymorphism analysis of DNA methylation in Arabidopsis un-
der mannitol treatment. Chin Bull Bot 46, 285–292.
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* Author for correspondence. E-mail: wzc@henu.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)