全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2015, 50 (6): 754–764, www.chinbullbotany.com
doi: 10.11983/CBB14173
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收稿日期: 2014-09-22; 接受日期: 2015-01-14
基金项目: 国家自然科学基金(No.31230050)和转基因生物新品种培育重大专项(No.2014ZX0800929B)
* 通讯作者。E-mail: xli@genetics.ac.cn
盐胁迫下大豆根组织定量PCR分析中内参基因的选择
姜琼1, 2 , 王幼宁1, 王利祥1, 2, 孙政玺1, 2, 李霞1*
1中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心, 石家庄 050021; 2中国科学院大学, 北京 100049
摘要 实时荧光定量PCR已广泛用于基因表达的分析, 适当的内参基因选择是获得准确分析结果的关键。在大豆(Glycine
max)分子生物学研究中, 逆境响应基因和microRNA (miRNA)表达的内参辅助检测基因均有哪些目前尚不清楚。该研究选
用不同盐梯度和时间点组合处理的大豆根组织为材料, 对已报道的其它条件下表达相对稳定的内参基因(ACT、ACT2/7、
CYP2、ELF1A、ELF1B、F-Box、TUA和UBC2)以及miRNA内参基因(U6、miR1515a、miR1520c、miR1520d、miR171a
和miR171b)的表达情况进行了全面检测; 并采用∆-Ct、Bestkeeper、NormFinder和Genorm四种方法对检测结果进行了综
合分析, 发现ELF1B和CYP2适合作为大豆根系盐胁迫响应基因研究的内参基因, miR1515a和U6适合作为盐胁迫下大豆根
组织miRNA研究的内参。上述研究结果为大豆盐胁迫响应基因和miRNA表达及其进一步的功能研究奠定了基础。
关键词 miRNA, qRT-PCR, 内参基因, 根组织, 盐胁迫, 大豆
姜琼, 王幼宁, 王利祥, 孙政玺, 李霞 (2015). 盐胁迫下大豆根组织定量PCR分析中内参基因的选择. 植物学报 50,
754–764.
实时定量PCR由于灵敏度高、重复性好以及定量
准确等优点, 已成为现今研究基因表达的最强有力的
技术手段。但是在实验过程中, 许多因素(如起始的样
本量、RNA提取的效率、RNA降解、样本质量的不同、
取样误差或者cDNA合成效率的差异等)都会对基因
表达产生影响(Bustin, 2002)。为了准确检测目的基因
特异性表达的差异, 需要使用内参基因进行标准化
(Brunner et al., 2004)。在最初的研究中, 人们一直采
用传统的持家基因作为内参基因, 但后来的研究陆续
证明, 持家基因的表达并不是在所有条件下都保持恒
定, 不同的组织、细胞类型或者生理状态也会导致持
家基因的表达差异(Lee et al., 2002; Doroudi et al.,
2005; Kozera and Rapacz, 2013)。因此 , 使用
qRT-PCR研究基因表达时, 对于不同的实验条件或
者实验材料, 选择合适的内参基因就显得尤为重要。
目前, 各个研究领域关于内参基因的报道很多,
例如, 在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,
Czechowski等(2005)对不同发育时期、组织器官、营
养缺乏(包括硫、磷和碳源)和非生物胁迫(包括激素、
盐、甘露醇和冷处理)条件下稳定表达的内参基因进
行了研究 , 发现APT1和UBQ5的稳定性最好 , 而
TUB6的稳定性最差。在生物胁迫下(不同植物病毒侵
染的拟南芥)比较稳定的内参基因是F-box、EF1α、
SAND和 PDF2, 而 Actin8最不稳定 (Lilly et al.,
2011)。对于水稻(Oryza sativa)不同发育阶段、不同
组织以及紫外线处理的条件下比较稳定的内参基因
是UBQ5、EF1α和18S rRNA (Kim et al., 2003; Jain
et al., 2006)。种子发育研究可选的内参基因是eIF-4α
和ACT1 (Li et al., 2010), 花药发育过程中可选用
UPF3、eIF4A-3、GAPDH和PPP6作为内参基因(Ji et
al., 2014)。这些对不同实验条件和实验材料内参基因
的研究结果, 为各个时期调控基因的表达和功能研究
提供了很好的参考。
miRNAs作为生物基因调控网络中的重要成员,
自发现之日起就掀起了研究热潮。分子克隆技术、生
物信息学分析以及高通量测序技术为发现和克隆新
的miRNA提供了有效的方法。尽管现在对miRNA的
研究取得了很大的进展, 但是对于均一化miRNA表
达的内参基因研究还相当匮乏。在植物中对miRNA
内参基因的系统研究目前还比较少, 拟南芥中通常用
U6作为内参检测miRNA的表达(Ramachandran and
Chen, 2008)。在对水稻的miRNA进行表达分析时,
·技术方法·
姜琼等: 盐胁迫下大豆根组织定量 PCR分析中内参基因的选择 755

通常用5S tRNA作为内参基因(Jiao et al., 2010)。目
前 , 已经在小麦 (Triticum aestivum) (Feng et al.,
2012)、桃树 (Prunus persica) (Luo et al., 2014)、柑
橘(Citrus sinensis) (Kou et al., 2012)以及大豆(Gly-
cine max) (Kulcheski et al., 2010)中对研究不同条件
下miRNAs的表达模式时适合作为内参的miRNA进
行了一定的探讨。
大豆是重要的粮食和油料作物, 随着大豆分子生
物学研究的深入, 不同研究条件下内参基因的确定也
成了一个重要环节。Jian等(2008)对不同大豆品种在
不同光周期以及不同发育时期下的组织器官中的持
家基因ACT、ACT2/7、CYP2、ELF1A、ELF1B、
UBQ10、G6PD、TUB、TUA和UBC2表达稳定性进
行了分析, 发现ELF1B和CYP2比较稳定。然而, 伤
害、激素以及锈病处理后不同发育时期的大豆组织中
表达比较稳定的是ABC-transporter、F-box家族基因
以及CDPK蛋白激酶基因(Libault et al., 2008)。目前,
对于大豆在干旱(Stolf-Moreira et al., 2011)、脱水、
高盐、冷、ABA (Le et al., 2012)、镉处理(Wang et al.,
2012)以及缺氧(Nakayama et al., 2014)等非生物胁
迫条件下基因表达的研究也有相应的内参基因可供
参考。针对大豆中miRNAs的功能研究, 利用茎环引
物检测成熟miRNAs的方法为分析miRNAs的表达水
平提供了便捷且准确的技术手段(Chen et al., 2005)。
目前, 对于不同大豆品种的不同组织在干旱以及锈病
处理条件下的内参miRNAs也有了一定的研究(Kul-
cheski et al., 2010), 证明在此条件下, miR1520d表
现出更高的稳定性, 适合作为内参。Turner等(2013)
研究发现, U6和miR1515在不同组织或根瘤菌侵染条
件下比较适合作为大豆的内参基因。
众所周知, 盐胁迫严重影响植物的生长发育, 其
中盐胁迫抑制主根生长主要是由于根尖分生区细胞
的分裂不能正常进行, 分生能力下降以及根尖细胞不
能伸长所致(Galvan-Ampudia and Testerink, 2011),
但是对植物根系响应及适应不同浓度盐胁迫的生理
和分子机理的研究尚少。与此同时, 大豆根系对盐胁
迫响应和适应性发育虽然被认为是作物耐盐高产的
重要性状, 但对其调控的生理和分子机制的了解还不
透彻。李亮(2010)利用抑制差减杂交技术对大豆耐盐
和敏盐品种的表达差异进行了研究, 获得了2个候选
耐盐基因GmPIP和GmANI, 发现分别过表达正调控
基因GmPIP和敲除负调控基因GmANI能提高大豆毛
状根的耐盐性。Zhou等(2014)以GmACTIN为内参基
因研究发现, GmPIP1;6在盐胁迫下大豆根中表达量
很高, 过表达GmPIP1;6能提高转基因大豆的耐盐性,
影响盐胁迫下Na+的吸收和外排。Guan等(2014)图位
克隆了耐盐基因GmSALT3, 发现GmSALT3在盐胁
迫的根中表达量较高, 并介导了地上部分Na+的外
排。许硕(2011)以耐盐野生大豆ZYD3474为材料, 对
盐处理和对照样本进行了研究, 发现miR160、mi-
R169、miR2109、miR319、miR394和miR4359上
调表达, 而miR164、miR167、miR4340和miR4361
下调表达。开展大豆盐胁迫相关的分子机制研究必然
需要确定适合作为内参的持家基因或者miRNA。但
是, 目前针对大豆幼苗期根组织在不同盐梯度以及
短时间点处理条件下稳定的内参基因或者miRNA尚
未确定。
本研究选取比较稳定的8个持家基因 (ACT、
ACT2/7、CYP2、ELF1A、ELF1B、F-Box、TUA和
UBC2)以及6个miRNA内参基因(U6、miR1515a、
miR1520c、miR1520d、miR171a和miR171b), 利用
实时荧光定量PCR技术对盐胁迫下内参基因的表达
水平进行检测, 应用∆-Ct、Bestkeeper (ver. 1.0)、
NormFinder (ver. 0.953)和Genorm (ver. 3.5)软件对
所得数据进行分析, 采用RefFinder在线软件进行综
合评价, 旨在筛选出大豆根尖在盐胁迫下表达水平
最稳定的持家基因和miRNA, 以期为更深入研究盐
胁迫下大豆基因的表达提供理论依据与数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本的选择
选用已测序的大豆(Glycine max (L.) Merr)品种威廉
姆斯82 (Williams 82, W82), 播种到B5固体培养基(1
xGAMBORG B-5 BASAL (Phyto Technology La-
boratories), 2%蔗糖, 0.8%琼脂粉(Sigma), pH调至
5.7左右)上萌发生根至长出侧根, 分别在NaCl浓度为
0、50、75和100 mmol·L–1的B5液体培养基中处理1
小时; 之后在含有75 mmol·L–1 NaCl的B5液体培养基
中分别处理0、0.5、1、3、6、12和24小时, 取根尖
1.5 cm样品, 于液氮中冻存, 样品使用前均保存在
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–80°C冰箱中。

1.1.2 主要试剂及仪器
RNA提取试剂TRIpure购自百泰克生物公司(北京),
反转录试剂盒和荧光定量试剂盒均购自天根科技(北
京), 引物由Invitrogen (上海)有限公司北京分公司合
成。荧光定量仪器为ABI (美国)公司生产的ABI7500
实时荧光定量PCR仪。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取
总RNA提取采用Trizol法, 按照试剂盒使用说明书的
步骤进行, 所有样品至少50 mg。RNA的完整性用2%
的琼脂糖凝胶溴化乙锭染色检测, 28S核糖体RNA的
亮度是18S核糖体RNA亮度的1.5–2倍, 且没有弥散
条带才能用于后续实验。RNA浓度的测定在NanDrop
ND-2000分光光度计上测OD260的值确定。OD260/280
和OD260/230的值用来确定所有RNA样品的纯度。只有
OD260/280比值介于1.8–2.0之间, OD260/230在2.0以上
的RNA样品才能用于后续研究。

1.2.2 cDNA的合成与定量
取2 μg总RNA用于cDNA的合成 , 第1步在gDNA
buffer的作用下去除DNA污染, 第2步进行反转, 按照
试剂盒说明书步骤操作, 42°C孵育15分钟, 然后在
95°C使反转录酶失活, 之后4°C降温。cDNA样品于
–20°C保存备用。

1.2.3 PCR引物设计及qRT-PCR扩增
引物序列如表1所示。用1 μL cDNA (20 ng·μL–1)进行
定量PCR, 反应体系20 μL: 正反向引物各0.4 μL、
2×SuperReal PreMix (含SYBR Green I) 10 μL、
50×ROX Reference Dye 0.4 μL和RNase-Free dd-
H2O 7.8 μL。扩增程序为: 95°C15分钟; 95°C10秒,
60°C34秒, 40个循环; 95°C15秒, 60°C1分钟, 95°C
15秒, 60°C15秒。

1.2.4 定量数据分析
根据公式Q=E∆Ct, 对各个扩增样品的Ct值计算每个
内参基因的相对表达量。其中, E为基因扩增效率,
∆Ct=Ctmin–Ct样品 (Ctmin为样品中最低的Ct值; Ct样品为
每个样品的Ct值)。根据各个内参基因在盐胁迫大豆
根尖中的表达计算得到相对表达量, 分别应用∆-Ct、
Bestkeeper (ver.1.0)、NormFinder (ver.0.953)和
Genorm (ver.3.5)程序对候选内参基因的表达稳定性
进行分析, 然后通过RefFinder在线软件对4种方法综
合分析, 筛选合适的内参基因。
2 结果与讨论
2.1 扩增特异性分析
提取0、50、75及100 mmol·L–1 NaCl处理1小时以及
75 mmol·L–1 NaCl处理0、0.5、1、3、6、12及24小
时的大豆根尖总RNA, 随后分别以随机引物反转成
cDNA, 用miRNA反转引物 (miRNA stem-loop re-
verse primers)反转特异的miRNA (表1)。然后以大豆
根尖总cDNA以及特异的miRNA反转产物为模板扩增
得到各个内参基因片段, PCR产物经2%琼脂糖凝胶
电泳检测。结果表明, 所得目的条带大小与理论值一
致, 除miR171b的扩增产物有杂带外, 其它内参基因
均不存在非特异性扩增(图1)。但是, 只根据RT- PCR
的结果不能充分说明扩增产物是否特异, 需要结合定
量PCR结果进行综合分析。通过进一步分析定量PCR
结果的溶解曲线, 发现8个持家基因都只产生单一的
溶解峰, 各重复样品间的曲线重复性好(图2); 而6个
miRNA内参基因中, miR1520c和miR171b的溶解曲
线有杂峰, 说明引物特异性不好(图3)。上述结果说明,
除miR1520c和miR171b外, 其它所设计引物扩增产
物特异性良好, qRT-PCR反应的专一性高, 结果准确
可靠。
2.2 候选内参基因的表达水平
Ct值与基因的表达水平成反比, 通过分析全部样品中
内参基因的Ct值, 可以了解内参基因在样品中的表达
丰度以及变异情况。根据qRT-PCR结果得到的Ct值,
分析比较8个持家基因和6个miRNA内参基因在盐胁
迫下大豆根尖的表达量情况。对14个内参基因的Ct
值比较结果显示, 在不同盐浓度梯度和不同时间点处
理下, 大豆根尖各个内参基因的表达水平存在一定的
差异。从图4可以看出, 8个持家基因的表达丰度均比
较高, Ct值为18–23。而6个候选miRNA内参基因的Ct
值差异较大, 平均Ct值约为12, 其中U6的Ct值最低,
姜琼等: 盐胁迫下大豆根组织定量 PCR分析中内参基因的选择 757


758 植物学报 50(6) 2015


图1 14种内参基因的PCR扩增产物

Figure 1 PCR products of fourteen reference genes
M: DNA marker; 1: ACT; 2: ACT2/7; 3: CYP2; 4: ELF1A; 5: ELF1B; 6: F-Box; 7: TUA; 8: UBC2; 9: U6; 10: miR1515a; 11:
miR1520c; 12: miR1520d; 13: miR171a; 14: miR171b


表2 持家基因的稳定性排序
Table 2 Stability ranking of candidate reference genes
Stability (high→low) Method
1 2 3 4 5 6 7 8
∆-CT methods CYP2 ACT ELF1B UBC2 ACT2/7 ELF1A F-Box TUA
Bestkeeper ELF1B TUA UBC2 CYP2 ACT ACT2/7 ELF1A F-Box
NormFinder CYP2 ACT ELF1B UBC2 ELF1A ACT2/7 F-Box TUA
Genorm ELF1B /UBC2 CYP2 ACT ACT2/7 F-Box ELF1A TUA
Recommended
comprehensive ranking
ELF1B CYP2 UBC2 ACT ACT2/7 TUA ELF1A F-Box


但其表达丰度最高; miR171b的Ct值最高, 但其表达
丰度最低。
2.3 持家基因的稳定性分析
为筛选出表达稳定的内参基因, 本研究利用∆-Ct、
Bestkeeper、NormFinder和Genorm软件分别对8个
持家基因和6个miRNA内参基因进行统计分析。并通
过RefFinder软件进行综合分析, 结果表明(表2), 用
∆-Ct和NormFinder方法得出CYP2和ACT的稳定性
较好, 而用Bestkeeper和Genorm软件分析得出ELF-
1B的稳定性最高。综合4种算法发现, ELF1B的稳定
性最高, F-Box的稳定性最差, 说明ELF1B基因最适
合作为不同盐梯度和时间点处理下大豆根尖的内参
基因。
2.4 miRNA的稳定性分析
表3显示, ∆-Ct、NormFinder和Genorm软件分析都得
出miR1520c的表达最稳定, 而Bestkeeper分析得出
miR1515a是最优的miRNA内参。从综合排序来看,
miR1520c的稳定性最高, 其次是miR1515a, 但是由
于miR1520c的扩增产物不特异, 综合考虑产物的特
异性以及稳定性, 得出不同盐梯度和时间点处理下,
大豆根尖成熟miRNA表达检测更适合的内参基因是
miR1515a。
2.5 讨论
理想的内参基因是在生物体的不同器官或组织中组
成型表达, 且表达不受细胞周期、生物以及非生物胁
迫等因素的影响(Thellin et al., 1999; Schmittgen
and Zakrajsek, 2000)。通常, 内参基因都选用持家基
因, 其编码的蛋白是参与生命活动所必需的, 比如组
成细胞骨架的肌动蛋白编码基因ACTIN, 糖酵解过程
中的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因GAPDH, 核糖体
亚基合成基因rRNA, 及参与蛋白降解的泛素基因
姜琼等: 盐胁迫下大豆根组织定量 PCR分析中内参基因的选择 759



图2 盐胁迫处理大豆根的8个持家基因Real-time PCR溶解曲线

Figure 2 Real-time PCR melting curves of eight reference genes in soybean roots under salt stress
(A) ACT; (B) ACT2/7; (C) CYP2; (D) ELF1A; (E) ELF1B; (F) F-Box; (G) TUA; (H) UBC2


UBQ等, 这些基因一般在所有的细胞和生理状态下
都能够稳定表达(Dheda et al., 2004; Jain et al.,
2006)。近年来的研究结果表明, 在不同实验条件或
者不同类型的细胞组织中, 部分持家基因作为内参基
因并不稳定, 例如在烟草(Nicotiana tabacum)发育过
程中, ACTIN作为内参基因是不稳定的(Schmidt and
Delaney, 2010)。所以, 在做qRT-PCR之前对内参基
因的稳定性进行重新评估显得尤为重要 (袁伟等 ,
2012)。进一步研究发现, 在拟南芥中, 综合考虑不同
发育时期、组织器官、营养缺乏(包括硫、磷和碳源)
和非生物胁迫(包括激素、盐、甘露醇和冷处理)条件
时, SAND (At2G28390)、TIP41 (At4G34270)以及一
个未知功能基因(At4G34270)的稳定性比较好, 而比
较熟知的持家基因EF1α、ACT2和转录因子bHLH的
760 植物学报 50(6) 2015



图3 盐胁迫处理大豆根的6个miRNAs Real-time PCR溶解曲线

Figure 3 Real-time PCR melting curves of six miRNAs in soybean roots under salt stress
(A) U6; (B) miR1515a; (C) miR1520c; (D) miR1520d; (E) miR171a; (F) miR171b


稳定性较差(Czechowski et al., 2005)。在水稻不同发
育时期的不同组织器官中 , Jain等(2006)研究发现
UBQ5和EF1α的稳定性最高, 适合作为该条件下基因
表达研究的内参基因。该结果也进一步说明, 针对不
同的材料和不同的处理条件应该考虑选择适合的内参
基因, 从而为获得真实的基因表达模式打下基础。
近几年的研究结果显示, miRNAs在诸多生长发
育过程中发挥着非常重要的作用。miRNA在不同组织
材料中的表达水平检测是对其开展深入研究的重要
环节。因此, 选择适合的内参miRNA至关重要。在模
式植物拟南芥中通常用U6作为内参检测miRNA的表
达(Ramachandran and Chen, 2008), 对水稻miRNA
的表达研究可以用U6或者5S tRNA作为内参基因
(Jiao et al., 2010)。在非生物以及生物胁迫处理的小
麦中 , 可以用miR167或miR159作为miRNA表达研
究的内参基因(Feng et al., 2012)。当分析干旱、盐和
涝害等胁迫处理的不同桃树组织中miRNA的差异表
达时, miR5059和miR5072比较适合用于非生物胁迫
下桃树的miRNA功能研究(Luo et al., 2014)。这些结
果进一步说明, 内参miRNA的确定对于最终的实验
结果和数据分析具有非常重要的作用。
目前, 筛选最优的内参一般有以下几种算法。
∆-Ct法是通过比较每两个内参基因在所有RNA样本
中的∆-Ct值变化来计算稳定性最高的内参基因。根据
在31个样本中基因表达的重复性, Silver等(2006)确
定GADPH是网织红细胞中最稳定的持家基因。应用
姜琼等: 盐胁迫下大豆根组织定量 PCR分析中内参基因的选择 761

表3 miRNA的稳定性排序
Table 3 Stability ranking of candidate miRNA
Stability (high→low) Method
1 2 3 4 5 6
∆-CT methods miR1520c miR1515a miR171a U6 miR1520d miR171b
Bestkeeper miR1515a miR1520c U6 miR171a miR1520d miR171b
NormFinder miR1520c miR1515a miR171a U6 miR1520d miR171b
Genorm U6/miR1520c miR1515a miR171a miR1520d miR171b
Recommended
comprehensive ranking
miR1520c miR1515a U6 miR171a miR1520d miR171b




图4 候选内参基因在盐胁迫处理大豆根尖的表达水平
1–14同图1。

Figure 4 Expression level of all candidate reference genes
in soybean roots under salt stress
1–14 see Figure 1.

Bestkeeper软件对各样品中内参基因进行配对相关
分析, 通过标准偏差和变异系数来确定内参基因的稳
定性(Pfaffl et al., 2004)。将NormFinder软件与各内
参基因的组合和组间方差相结合来对内参基因的稳
定性进行评价(Andersen et al., 2004)。利用Genorm
软件对给定的生物样本, 在内参基因和生物样本的矩
阵内进行成对比较和几何平均算法来确定基因表达
的稳定性(M), M值越小, 说明该内参基因的稳定性越
高(Vandesompele et al., 2002)。李冉等(2013)使用
Genorm软件确定了水稻在害虫二化螟、稻纵卷叶螟、
褐飞虱、白背飞虱和机械损伤等不同处理下各自最稳
定的内参基因。在不同条件下内参基因的确定实验中,
人们一般采用两种或多种算法综合考虑确定最优的
内参基因。刘金泊等 (2014)运用Genorm和Norm-
Finder两种软件分析发现, 磷化氢诱导下赤拟谷盗
(Tribolium castaneum)中相对适合的内参基因是
RPS18和RPL13a。在对龙眼树(Dimocarpus longan)
体细胞胚发生过程最优的内参基因研究时, 发现用
Genorm软件分析得出EF-1a/UBQ是最稳定的内参基
因; NormFinder软件分析得出EF-1a表达最稳定; 而
用Bestkeeper软件分析得出ACTB和UBQ最稳定。综
合3种算法确定UBQ最适合作为龙眼树体细胞胚发育
过程的内参基因(Lin and Lai, 2010)。苏晓娟等(2013)
运用Genorm、NormFinder和Bestkeeper 3个程序分
析发现, 在毛果杨(Populus trichocarpa)的不同组织
以及锌胁迫下的组培苗中, 不同算法内参基因的稳定
性排序有一定的差异, 综合3种算法确定最稳定的内
参基因为actin、 ubiquitin、EF1α和 18S rRNA。
RefFinder软件整合了上述4种算法 , 是基于Cotton
EST Database网站(http://www.leonxie.com/)的一个
综合分析工具。黄真池等(2013)利用RefFinder软件研
究确定桉属植物中较为合适的内参基因是RTEF。这
一系列研究结果表明, 在确定不同条件下进行基因表
达模式分析的内参基因时需要综合不同的算法进行
分析, 从而使获得的相应候选内参基因更为可靠。
盐碱是影响我国大豆产量的主要逆境因素之一。
仅东北大豆主产区就有约3.6×106 hm2盐碱地, 而且
由于不合理耕作及人为原因, 大豆耕地的盐碱化在进
一步扩大(Doran, 2002; 陈百明和周小萍, 2004)。盐
胁迫严重影响了大豆的生长发育, 尤其是根系的生
长。对盐胁迫下根系可塑性发育的分子机制研究将为
通过分子手段改良大豆的耐盐性提供新的途径。根系
发育分子机制研究中内参基因和miRNA的选择是非
常重要的一环。近年来, ELF1B和CYP2被证明适合用
作大豆不同品种、组织器官和发育时期条件下进行基
因表达分析的内参。目前, 在大豆中对多个非生物胁
762 植物学报 50(6) 2015

迫处理下内参基因的选择已有一定的研究, 脱水处理
下 , 在大豆幼苗组织表达更稳定的是Fbox/ABC和
Fbox/60s。缺氧环境下的大豆根组织可以选用ELF1B
和ACTB作为内参基因(Nakayama et al., 2014)。
Kulcheski等(2010)对干旱胁迫、锈病感染以及不同品
种和组织大豆中的miRNA内参进行了筛选 , 发现
miR156b和miR1520d表达比较稳定, 可以用作该条
件下的内参miRNA。为了深入分析大豆根系在盐胁迫
下可塑性发育的分子机制, 我们首先分析了不同盐梯
度和时间点处理的大豆根尖材料中候选内参基因的
稳定性。本研究所选的8个持家基因的表达丰度都比
较高, 根据综合分析结果, ELF1B和CYP2在不同盐
梯度和时间点处理的大豆根尖表达更稳定, 可以用于
相应实验条件下的内参。同时, 研究发现在不同盐梯
度和时间点处理的大豆根尖中, miR1515a的表达更
稳定, 适合作为该条件下的内参, 其次是U6、miR-
171a和miR1520d。另外, 在选择内参基因时, 内参
基因与所检测基因之间的Ct值差异越小, 扩增效率对
计算结果的影响也会越小, 计算的结果会更加准确
(Czechowski et al., 2005)。在我们的研究中, 所选的
6个miRNA内参基因的表达丰度均较低 , 大多数
miRNA基因的Ct值约为30。这些表达丰度较低的内参
基因可以用于检测qRT-PCR实验中丰度较低的转录
本。
本实验结果为不同盐梯度和时间点处理下大豆
根尖定量PCR检测基因表达提供了一定的依据, 但
是对于其它不同的实验条件或者材料, 还需要通过系
统的实验分析重新确定合适的功能基因或者miRNA
作为内参基因。
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Validation of Reference Genes for Quantitative RT-PCR Analysis in
Soybean Root Tissue under Salt Stress
Qiong Jiang1, 2, Youning Wang1, Lixiang Wang1, 2, Zhengxi Sun1, 2, Xia Li1*
1Center of Agricultural Research Resources, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sci-
ences, Shijiazhuang 050021, China; 2University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) is a robust and commonly used technique to study gene expression. How-
ever, the reference genes and microRNA (miRNA) that can be used in soybean molecular research, in particular the
stress responsive genes and miRNA in roots, are not well characterized. In this study, we systematically analyzed the
expression stability of eight widely used reference genes (ACT, ACT2/7, CYP2, ELF1A, ELF1B, F-Box, TUA and UBC2)
and miRNA internal references (U6, miR1515a, miR1520c, miR1520d, miR171a, and miR171b) in root tissues treated
with different NaCl concentrations at specified times. The ∆-Ct method, Bestkeeper 1.0, NormFinder 0.953 and Genorm
3.5 were used to analyze the data, then the web-based tool RefFinder was used to integrate the results obtained.
ELF1B/CYP2 and miR1515a/U6 were the most suitable genes for qRT-PCR analysis of soybean gene and miRNA ex-
pression analysis under salt stress, respectively. The highly ranked reference genes and miRNAs identified from this
study can be used for detecting differences in expression rates of genes and miRNAs in response to salt stress in soy-
bean.
Key words miRNA, qRT-PCR, reference genes, root tissue, salt stress, soybean
Jiang Q, Wang YN, Wang LX, Sun ZX, Li X (2015). Validation of reference genes for quantitative RT-PCR analysis in
soybean root tissue under salt stress. Chin Bull Bot 50, 754–764.
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* Author for correspondence. E-mail: xli@genetics.ac.cn
(责任编辑: 孙冬花)