全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (6): 684–693, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2013.00684
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收稿日期: 2013-01-26; 接受日期: 2013-08-05
基金项目: “十二五”国家科技支撑计划(No.2012BAD01B01)
* 通讯作者。E-mail: xmsun@caf.ac.cn
针叶树基因组特征及其序列资源挖掘进展
许晨璐, 孙晓梅＊, 张守攻
中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局林木培育重点实验室, 北京 100091
摘要 针叶树是裸子植物中最大也是分布最广的一支。作为多年生木本植物, 针叶树不仅为工业提供建筑、造纸等重要原
料和其它可再生能源, 而且在北半球的生态平衡中也起着重要作用。因其独特的分类地位、重要的经济价值和生态价值, 针
叶树序列资源挖掘备受重视。然而其庞大且复杂的基因组阻碍了这一进程, 截至2013年4月, 尚无获得全基因组序列的针叶
树种。随着第2代测序技术的出现及生物信息学的快速发展, 针叶树序列资源挖掘也从转录组过渡到全基因组测序, 后者已
在松属(Pinus)、云杉属(Picea)和黄杉属(Pseudotsuga)部分树种中开展。该文首次归纳了针叶树基因组特征, 回顾了针叶
树序列资源挖掘进程, 并重点介绍了火炬松(Pinus taeda)、欧洲云杉(Picea abies)和白云杉(Picea glauca)的全基因组测序
项目。
关键词 针叶树, 基因组, 研究进展, 转录组, 全基因组测序
许晨璐, 孙晓梅, 张守攻 (2013). 针叶树基因组特征及其序列资源挖掘进展. 植物学报 48, 684–693.
球果目(本文称之为针叶树)是裸子植物(Gymno-
sperm)四大分支中最大也是分布最广的一支[其它3
支为苏铁目(Cycadales)、银杏目(Ginkgoales)和买麻
藤目(Gnetales)], 包含6科[松科(Pinaceae)、南洋杉
科(Araucariaceae)、罗汉松科(Podocarpaceae)、金
松科(Sciadopityaceae)、柏科(Cupressaceae)和红豆
杉科 (Taxaceae)]69属 605种 (Christenhusz et al.,
2011)。从与被子植物分离算起, 针叶树已独立进化
了约3亿年(Troitsky et al., 1991), 其分类地位十分重
要。针叶树虽然树种不多, 却主宰着北半球温带和寒
带大部分陆地生态系统, 在全球碳循环中扮演着重要
角色。同时, 针叶树多为重要造林树种, 经济价值巨
大。鉴于针叶树重要的分类地位和生态、经济价值, 其
序列资源挖掘研究受到生物进化学家、生态学家以及
林木育种学家的高度重视, 获取针叶树全基因组序列
对于更好地认识针叶树的起源与进化、维护针叶林生
态健康 (Neale, 2007)及加速基因组学辅助育种
(genomics-assisted breeding)进程(许晨璐等, 2012)
均具有重要意义。
针叶树基因组的进化机制及其组成、结构与被子
植物显著不同(Kinlaw and Neale, 1997)。由于在现有
测序技术条件下, 基因组序列中基因分布特征、重复
序列的数量、复杂度和分布直接影响到测序数据结果
的输出, 基因组特征成为针叶树全基因组测序项目必
须考虑的内容。本文总结了针叶树基因组特征, 依次
介绍了目前已开展的针叶树转录组和全基因组测序
项目, 以期为其它针叶树全基因组测序项目的开展提
供参考。
1 针叶树的基因组特征
早期对针叶树基因组特征的研究多集中于其巨大的
基因组本身。Gymnosperm DNA Cvalues数据库显
示 , 141个松科植物单倍体DNA含量高达9.5–36
Gb(Murray et al., 2012), 平均含量为23.68 Gb, 是
拟南芥(Arabidopsis thaliana)的190倍, 毛果杨(Po-
pulus trichocarpa)的49倍。Zonneveld(2012)测定的
64个属、172个针叶树种的基因组值为8.1–72 Gb, 仅
罗汉松科和落叶松属(Larix)基因组相对较小(平均含
量均为13.2 Gb)。与被子植物不同, 针叶树基因组没
有表现出明显的多倍性(柏科除外)(Cui et al., 2006;
Nystedt et al., 2013), 但不排除古多倍性(paleopoly-
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许晨璐等: 针叶树基因组特征及其序列资源挖掘进展 685
ploidy)的可能。如白云杉(Picea glauca)古基因(被子
植物和裸子植物共有基因)复制事件出现的频率是针
叶树特有基因复制事件出现频率的8倍(Pavy et al.,
2012); 欧洲云杉(Picea abies)基因组中可能发生过
古全基因组复制(ancient whole genome duplication)
事件(Nystedt et al., 2013)。针叶树核型较被子植物保
守, 其体细胞染色体基数介于7–19之间, 多集中于
10–12条(Zonneveld, 2012), 如松科约有240个种的
染色体基数为12, 仅北美黄杉(Pseudotsuga menzi-
esii)为13。
1.1 针叶树的基因特征
1.1.1 基因序列含量
针叶树中真正编码蛋白质的序列仅占全基因组的很
小一部分。欧洲云杉中仅有不足3%的序列与基因序
列同源(Ingvarsson, 2012); 火炬松(Pinus taeda)中
仅有1%是编码蛋白质的序列(Kovach et al., 2010)。
由于基因组巨大, 针叶树基因密度较小, 对白云杉2
条细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,
BAC)序列(长度分别为172 kb和94 kb)进行测定, 各
发现1个基因 , 基因密度仅为拟南芥、水稻(Oryza
sativa)、毛果杨和葡萄 (Vitis vinifera)的十分之一
(Hamberger et al., 2009); Kovach等(2010)对总长接
近1 Mb的10个火炬松富集基因的BAC文库进行测序,
也仅发现18个编码蛋白质的基因(其中15个可能是假
基因)。与拟南芥等基因组含量相对较小的被子植物
相比, 基因富含区域(gene-rich regions)在针叶树基
因组中并不常见, 即使在基因富含区域, 基因密度也
仅比非基因富含区域高出1倍(Pavy et al., 2012)。
尽管许多基因同时存在于针叶树和被子植物中,
但并不能据此准确推算出针叶树中编码蛋白质基因
的数量。有研究表明, 针叶树中表达的基因数量可能
与许多被子植物非常相似。如Rigault等(2011)估测白
云杉核基因组含32 720个表达基因, 序列总长为47.3
Mb; 欧洲云杉中被强力支持的基因(well-supported
gene)数为28 354个(Nystedt et al., 2013), 这与拟南
芥和水稻的转录组大小相似。

1.1.2 基因特征
针叶树单个基因的长度大于被子植物中的同源基因
(Kinlaw and Neale, 1997), 其原因可能是内含子较
长, 如最长的内含子为68 kb(Nystedt et al., 2013)。
除转录因子外(Rigault et al., 2011), 针叶树拥有相对
较大的基因家族(Kinlaw and Neale, 1997; Futamura
et al., 2008; Morse et al., 2009), 这使得针叶树在应
对环境变化时更具优势。假基因在针叶树中较为常见
(García-Gil, 2008; Kovach et al., 2010; Nystedt et
al., 2013), 它们可能参与大基因家族的形成(Kinlaw
and Neale, 1997)。
针叶树蛋白质编码区域的进化速率较慢, 如松科
不同种间的核苷酸替换速率仅为被子植物的十分之
一(Buschizzo et al., 2012; Chen et al., 2012)。松科
不同种间基因的同线性(synteny)和共线性(colline-
arity) 较强 (Krutovsky et al., 2004; Pavy et al.,
2012), 如糖松 (Pinus lambertiana)和火炬松虽隶
属不同亚属, 但共线性却高达93%(Jermstad et al.,
2011)。
1.2 针叶树重复序列特征
1.2.1 重复序列类型
针叶树中的重复序列包括串联重复序列(tandemly
repeated sequence)和散布重复序列(dispersed re-
peated sequence)两种。前者包括SSR(simple se-
quence repeat)、小卫星DNA(minisatellite DNA)、卫
星DNA(satellite DNA)、核糖体RNA基因和端粒重复
序列等类型 ; 后者主要包括可移动元件 (transpos-
able element), 亦称转座子 (transposon)。 Ingvar-
sson (2012)研究发现, 欧洲云杉基因组中超过99%
的序列是功能未知的中度或高度重复序列。也有研究
认为, 针叶树基因组中约有75%是由重复序列构成,
20%–30%是由单拷贝序列构成(Kriebel, 1985), 按
此比例计算, 单拷贝序列含量超过3 Gb, 远远超出基
因表达所需要的100 Mb。后续研究证实, 这部分单拷
贝序列可能也是重复序列(Elsik and Williams, 2001),
只不过由于进化时间过长, 导致分化严重而表现为单
拷贝序列特征。如松属(Pinus)基因组中低拷贝非基因
序列部分主要由极其发散的可移动元件构成(Morse
et al., 2009; Kovach et al., 2010)。
转座子是针叶树中主要的重复序列类型。根据其
转座机制不同 , 转座子可分为DNA转座子 (DNA
transposon)和反转座子(retrotransposon)两类。DNA
转座子是以DNA-DNA方式转座的转座子 , 可通过
686 植物学报 48(6) 2013
DNA复制或直接切除两种方式获得可移动片段, 重
新插入基因组DNA中, 导致基因突变或重排, 但一般
不改变基因组的大小。反转座子则首先转录成RNA,
然后以RNA为模板反转录合成新的转座子拷贝, 再
插入新的DNA序列中。反转座子可分为两类, 即长末
端重复序列反转座子 (long terminal repeat retro-
transposon, LTR-RTs)和非长末端重复序列反转座
子(non-LTR-RTs)。其中, LTR-RTs包括Ty1/Copia和
Ty3/Gypsy两个亚家族; non-LTR-RTs包括长散在重
复(long interspersed element, LINEs)、短散在重复
(short interspersed element, SINEs)和微型反向重
复转座子 (miniature inverted repeat transposable
elements, MITEs)。研究发现 , 反转座子 (特别是
LTR-RTs)在针叶树中广泛存在且数量众多(Friesen
et al., 2001; Ahuja and Neale, 2005; Nystedt et al.,
2013), 原因可能是针叶树缺乏有效的反转座子消除
机制(Nystedt et al., 2013)。Hamberger等(2009)发现
白云杉BAC文库中转座子占全部序列的20%; Ty3/
Gypsy类反转座子的全部序列总长甚至超过拟南芥
整个基因组的长度(Bennett et al., 2003)。欧洲云杉
等6种针叶树中 , Ty3/Gypsy亚家族的数量远大于
Ty1/Copia(Nystedt et al., 2013)。相比数量庞大的反
转座子, 针叶树中DNA转座子的数量有限。

1.2.2 重复序列特征
与被子植物不同, 针叶树基因组中的重复序列较为古
老, 彼此之间差异较大, 且形式多样(Morse et al.,
2009; Kovach et al., 2010; Magbanua et al., 2011;
Liu et al., 2011)。例如Kovach等(2010)的研究发现,
在总长接近1 Mb的火炬松BAC序列中包含近600种
重复元件, 包括SSR、反转座子和DNA转座子等, 且
任一重复序列占基因组的比例均不超过2%, 欧洲云
杉中超过86%的LTR-RTs以单拷贝形式存在, 表明
分化十分严重(Nystedt et al., 2013)。Parchman等
(2010)的研究发现, 扭叶松(Pinus contorta)中的反转
座子具有很高的转录活性; 也有研究认为所有的重复
序列似乎累积了大量的突变、插入/缺失位点以及重排
变异, 表明这些重复序列可能已失去功能。针叶树转
座子结构比较复杂, 如火炬松中PtIFG7-2可能以巢
式存在于众多特征未知的Copia类元件中(Kovach et
al., 2010)。反转座子具有种属特异性, 如某些Ty3/
Gypsy类LTR-RTs仅在云杉属中存在(Friesen et al.,
2001)。
虽然有研究发现重复序列拷贝数量与基因组大
小无显著相关性(Sarri et al., 2011), 但散布于整个基
因组的串联重复和反转座子扩增 (retrotransposon
expansion) 的确构成了针叶树基因组的复杂性
(Morse et al., 2009)。此外, 转座子插入还被认为与
长的内含子和假基因产生有关(Nystedt et al., 2013)。
2 转录组测序项目
鉴于EST测序可以快捷且高效地捕获基因, 现已成为
全基因组测序最有效的替代方法(Rudd, 2003)。自
1998年首例高通量EST测序项目在火炬松中开展以
来, 多数针叶树种开展了EST或FL-cDNAs(full leng-
th cDNAs)测序项目(表1)。随着测序通量的增加, 研
究思路也从挖掘组织特异表达基因过渡到获取基因
目录(gene catalogues)(Ralph et al., 2008; Rigault
et al., 2011), 相应的cDNA文库构建也从单组织过渡
到多组织。为了尽可能获得更多的转录本, 有些甚至
对 cDNA 文库进行了均一化 (normalization) 处理
(Rigault et al., 2011)。测序方法逐渐从传统的Sanger
测序技术过渡到第2代测序技术, 如Roche 454技术
和Illumina HiSeq技术等。
此外, 旨在利用第2代测序技术完成约1 000种
植物转录组测序和组装的“千种植物转录组研究计
划”(The 1000 Plant Transcriptome Project)已经对
70个针叶树种进行了转录组测序。这些转录组测序项
目极大地丰富了针叶树基因组资源。目前, DFCI (Dana
Farber Cancer Institute)数据库中收录的针叶树转录
本已达156 735条(其中包括松属77 326条和云杉属
79 409条)。TreeGenes数据库中收录的松属和云杉
属EST序列达1 021 388条。NCBI(National Center
for Biotechnology) dbEST数据库中收录针叶树EST
序列已达1 113 993条。这些EST序列的获得为针叶
树全基因组测序的开展奠定了坚实的基础。
3 全基因组测序项目
尽管第1张林木全基因组序列草图早在7年前就已获
得 , 然而针叶树全基因组测序却进展缓慢。2004
年, 美国农业部林务总局林木遗传研究所(Institute of
许晨璐等: 针叶树基因组特征及其序列资源挖掘进展 687
表1 近年来针叶树转录组测序的成果
Table 1 Conifer transcriptome sequencing programs reported since 1998
树种 主要完成单位 组织 通量 测序方法 参考文献
火炬松(Pinus taeda) 北卡州立大学(美国); 明尼苏达大学
(美国)
木质部 833 Sanger Allona et al., 1998
火炬松(Pinus taeda) 北卡州立大学(美国); 明尼苏达大学
(美国)
木材形成组织 20 377 Sanger Kirst et al., 2003
日本柳杉(Cryptomeria
japonica)
林业及林产品研究所(日本) 种子和小孢子
叶球
1 173 Sanger Ujino-Ihara et al., 2003
火炬松(Pinus taeda) 乔治亚大学(美国) 根 6 202 Sanger Lorenz et al., 2006
白云杉(Picea glauca) 拉瓦尔大学(加拿大); 明尼苏达大学
(美国)等
各种组织 16 578 Sanger Pavy et al., 2005
北美云杉(Picea pungens)
等
英属哥伦比亚大学(加拿大) 各种组织 46 745 Sanger Ralph et al., 2008
日本柳杉(Cryptomeria
japonica)
林业及林产品研究所(日本) 雄球花 36 011 Sanger Futamura et al., 2008
辐射松(Pinups radiata) CSIRO Plant Industry(澳大利亚) 木质部 3 304 Sanger Li et al., 2009
扭叶松(Pinus contorta) 怀俄明大学(美国) 针叶和小球果 303 450 454测序 Parchman et al., 2010
海岸松(Pinus pinaster) 马拉加大学(西班牙) 多个组织 55 322 Sanger/45
4测序
Fernández-Pozo et al.,
2011
白云杉(Picea glauca) Gydle公司(加拿大); 拉瓦尔大学(加拿
大)等
各种组织 27 720 Sanger/45
4/RNA-seq
Rigault et al., 2011
南方红豆杉(Laxus malrel) 大连交通大学(中国)等 叶、干和根 36 493 Illumina Hao et al., 2011
火炬松(Pinus taeda)等① 乔治亚大学(美国); 俄亥冈州立大学
(美国)等
枝条、针叶和
茎尖
– 454测序 Lorenz et al., 2012
北美黄杉(Pseudotsuga
menziesii)
霍恩海姆大学(德国); 多伦多大学密西
沙加分校(加拿大)等
针叶和木材 170 859 454测序 Müller et al., 2012
欧洲云杉(Picea abies) 乌普萨拉大学(瑞典); 瑞典农业科学大
学(瑞典)等
针叶 38 419 Illumina Chen et al., 2012
扭叶松(Pinus contorta)和
因蒂里厄云杉(Picea
engelmani x Picea glauca)
英属哥伦比亚大学(加拿大) 顶芽、根和干 33 746;
40 862
第2代测
序技术
Yeaman et al., 2013
北美黄杉(Pseudotsuga
menziesii)
美国农业部林务总局西北太平洋研究
站等
针叶 90 730 RNA-seq Cronn et al., 2013
油松(Pinus tabulaeformis) 北京林业大学(中国) 多个组织 46 584 454测序 Niu et al., 2013
冷杉(Akjes fabri) 马尔堡大学(德国)等 一年生苗 25 149 454测序 Roschanski et al., 2013
① 包括糖松、北美黄杉、欧洲云杉、大西洋雪松、粗榧、长叶松、罗汉松、金松、北美红杉、欧洲红豆杉和瓦勒迈杉。
① Other species include Pinus lambertiana, Pseudotsuga menziesii, Picea abies, Cedrus atlantica, Cephalotaxus harringtonia,
Pinus palustris, Podocarpus macrophyllus, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Taxus baccata and Wollemia nobilis.


Forest Genetics, USDA Forest Service)和加州大学
戴维斯分校(UC Davis)联合发起了世界上第1个针叶
树基因组测序项目——火炬松基因组项目(The Lob-
lolly Pine Genome Project)。该项目以获得火炬松
EST序列及全长蛋白质编码序列资源为首要目标, 也
包含构建BAC文库、完整的物理图谱和高密度的遗传
图谱, 由此奠定了火炬松作为针叶树基因组学研究模
式物种的地位。这一项目现已进行到松树参考序列项
目阶段(表2)。现阶段, 已经开展全基因组测序的针叶
树种还包括欧洲云杉、白云杉、糖松、海岸松(Pinus
688 植物学报 48(6) 2013
表2 针叶树全基因组测序项目
Table 2 Conifer whole genome sequencing projects
项目名称 树种 预期目标(基因组测序部分) 参与项目的科研机构 测序策略 测序方法
松树参考序
列项目
火炬松(Pinus taeda)
糖松(Pinus lambertiana)
北美黄杉(Pseudotsuga
menziesii)
湿地松(Pinus elliotii)
(1) 获得火炬松高质量参考基因组序列
(2) 为基因挖掘、注释和组装服务的转录
组测序
(3) 充实Dendrome和TreeGenes数据库
加州大学戴维斯分
校、马里兰大学和
印第安纳大学等
BAC文库和
全基因组鸟
枪法
Sanger/Illu
mina/454
测序
云杉基因组
项目
欧洲云杉(Picea abies) (1) 获得一个基因型的全基因组序列
(2) 获得不同组织基因的表达谱信息,
确定其中部分基因的功能
瑞典植物科学中心和
SciLifeLab(瑞典)等
Fosmid pool
和全基因组
鸟枪法
Illumina
SMarT-
Forests
白云杉(Picea glauca) (1) 获得白云杉基因组序列草图
(2) 对基因组序列进行注释, 确认基因编
码序列及针叶树特有基因
拉瓦尔大学、英属
哥伦比亚大学和阿
尔伯塔大学
全基因组鸟
枪法
Illumina
ProCoGen 海岸松(Pinus pinaster)
欧洲赤松(Pinus sylvestris)
(1) 获得海岸松和欧洲赤松的参考基因
组序列
阿尔卡拉大学(西班
牙)和INIA-CIFOR(法
国)等
基因组重测
序
第2代测序
技术


pinaster)、欧洲赤松(Pinus sylvestris)和北美黄杉。
这些项目均由多家科研机构合作开展(表2)。
3.1 全基因组测序项目简介
由加州大学戴维斯分校联合另外6家科研机构共同实
施的松树参考序列项目(Pine Reference Sequences)
是由火炬松基因组项目发展而来。它以火炬松为主要
研究树种 , 采用 Illumina双末端测序技术 (Pair-end
sequencing)对混合片段(大小包括500 bp、5 kb和40
kb)文库进行测序, 预期先发布覆盖度为21倍的全基
因组鸟枪法 (whole genome shotgun sequencing,
WGS)序列和初始组装结果(包括富集基因的部分和
全基因组), 随后2年内再发布具更高覆盖度(180倍)
的组装结果, 之后再对糖松、湿地松(Pinus elliottii)
和北美黄杉进行全基因组测序。这一项目的最新研究
成果将在http://pinegenome.org/pinerefseq/网站上
及时发布(其最新的组装版本(V1.0)已于2013年8月6
日发布)。作为较早开展的全基因组测序项目, 松树参
考序列项目也把探索适合其它针叶树的全基因组测
序方法、技术平台和生物信息学软件, 及提高针叶树
全基因组测序的速度和降低其成本作为预期目标。
瑞典植物科学中心(Umea Plant Science Cen-
ter)联合10家科研机构(包括瑞典、加拿大、意大利和
比利时等)共同开展的云杉基因组项目(The Spruce
Genome Project)以获取欧洲云杉全基因组序列(包
括核基因组和叶绿体及线粒体基因组)为主要目标,
其它目标包括获得各组织基因的表达谱信息, 确定其
中部分基因的功能、重要表型变异及与基因(或分子
标记)的关联等信息, 以期为瑞典欧洲云杉的改良提
供强大的基于基因组学的育种工具 (genomics-as-
sisted breeding tools)。该项目主要采用第2代测序技
术对来自同一基因型的单倍体和双倍体进行同步测
序, 最新的组装结果已于2013年5月22日在Nature上
发表。
由加拿大3所高校共同发起的SMarTForests项
目(http://www.smartforests.ca/)是在原有的Arborea
项目(由拉瓦尔大学主持)和Treenomix项目(由英属哥
伦比亚大学主持)的基础上开展的。它以获得白云杉
的全基因组序列为首要目标, 同时评估全基因组的基
因拷贝数量变异(copy number variation, CNV)和存
在缺失变异(presence-absence variation, PAV), 以
期为比较基因组学和关联研究打下基础。此外, 该项
目还将开展白云杉与欧洲云杉的属内比较基因组学,
以及云杉与火炬松、糖松和北美黄杉的属间比较基因
组学研究。目前, 借助Illumina HiSeq2000平台, SM-
arTForests项目已对来自白云杉的双倍体基因型
(PG29)的21个paired-end文库进行了测序, 覆盖度
高达63倍。借助ABySS软件进行序列组装, 共获得
600万条大于500 bp的重叠群(contig), 重叠群最大
值高达78 855 bp, N50为4 234 bp, 序列组装总长度
许晨璐等: 针叶树基因组特征及其序列资源挖掘进展 689
为15.2 Gb。序列数据和首次组装结果(V1.0)已发布在
NCBI(Bioproject PRJNA83435, Accession ALWZ-
0000000000)网站上(Birol et al., 2013), 更新的组装
结果将会陆续发布。
由欧盟组织和西班牙牵头, 联合法国、瑞典和比
利时多家科研机构实施的ProCoGen项目(Promoting
a Functional and Comparative Understanding of the
Conifer Genome-implementing Applied Aspects for
More Productive and Adapted Forests), 以挖掘对
气候变化和林木生产力有影响的基因及基因调控网
络为主要目标(Díaz-Sala and Cervera, 2011), 但目
前公开发表的信息不多。
3.2 全基因组测序策略选择
针叶树全基因组测序首要的问题是选择合适的测序
策略。鸟枪法测序(shotgun sequencing)以目的DNA
随机打断成的大小不等的片段进行测序, 之后再利用
计算机将这些片段序列连接起来。该方法现已成为大
基因组测序项目普遍采用的测序策略。Green(2001)
将该策略又细分为逐步克隆法(clone-by-clone shot-
gun sequencing)和全基因组鸟枪法两种途径。实际
应用时 , 也可以采取基于这两种方法的混合策略
(mixed strategy sequencing)。
逐步克隆法(亦称之为hierarchical shotgun se-
quencing或BAC-based shotgun sequencing)是拟南
芥、水稻和玉米(Zea mays)全基因组测序采用的方
法。该方法遵守“先作图, 后测序”的原则, 需要精
细的物理图谱作支撑。构建物理图谱的克隆系统包括
酵母人工染色体载体(yeast artificial chromosome,
YAC)、BAC和PAC(P1 artificial chromosome)等。其
中BAC由于其插入片段大、稳定性好、嵌合体比例低
和操作简单等优点已被广泛应用到人、动植物及微生
物的基因组学研究, 成为基因组学研究的一个非常重
要的工具。针叶树BAC文库的构建始于2007年, 到目
前为止已对海岸松(Bautista et al., 2007)、火炬松
(Morse et al., 2009; Kovach et al., 2010; Magbanua
et al., 2011)、落羽杉(Taxodium distichum)(Liu et al.,
2011)和白云杉(Hamberger et al., 2009)进行了BAC
文库的构建, 并以此为基础进行了基因组序列特征的
研究。然而, 鉴于针叶树的基因组非常巨大, 其不适
合使用传统的BAC-based测序方法。以白云杉(基因
组大小为23 Gb)为例, 如果要构建一个基因组覆盖
率为1倍(95%的可能性)、插入片段为107 kb的白云杉
BAC文库, 则需要643 941个克隆, 工作量巨大。目
前, 针叶树BAC克隆的构建都是为了分析针叶树基
因组的结构特征(Bautista et al., 2007; Hamberger et
al., 2009; Kovach et al., 2010), 而不是以全基因组
测序为目的。
全基因组鸟枪法最早被用来对含重复序列较少
的微生物基因组进行测序。该方法由于理论上不需要
再构建物理图谱, 故迅速被多个植物全基因组测序项
目所采用(Feuillet et al., 2011)。最近发布的植物基因
组序列(玉米除外)都是借助全基因组鸟枪法获得的。
经不断改进, 全基因组鸟枪法也成为适合针叶树全基
因组测序的方法(Kovach et al., 2010; Birol et al.,
2013)。针叶树应用此方法时, 一般是对100–800 bp
的DNA片段双末端进行测序, 由于800 bp的DNA片
段不足以覆盖针叶树中大部分的重复序列, 故需借助
片段长度更长(10–20 kb)的跨步文库(jumping librar-
ies)。对于重复序列更长的序列, 还可辅以Fosmid和
BAC克隆末端测序(BAC-end sequence)或对Fosmid
混合池(fosmids pools)的测序方法, 但WGS更依赖
强大的数据处理软件支持(Miller et al., 2010)。
4 研究展望
尽管大基因组物种的序列拼接和组装面临很大的困
难(Claros et al., 2012), 但大豆(Glycine max)(1.1
Gb)、玉米(2.73 Gb)、大麦(Hordeum vulgare)(5.1
Gb)和小麦(Triticum aestivum)(A、D基因组及部分B
基因组 )全基因组测序的完成 , 以及最近大熊猫
(Ailuropoda melanoleuca)(2.4 Gb)全基因组序列的
发表对针叶树全基因组测序项目的开展具有很强的
借鉴意义。第2代测序技术不仅使DNA测序成本7年间
降为万分之一(Shendure and Aiden, 2012), 而且让
基因组测序这项以前专属大型测序中心的“特权”能
够被众多研究人员享用。目前, 第2代测序技术(如
Illumina公司推出的读长高达2×300 bp的MiSeq测序
仪 )已使WGS很容易地实现对针叶树全基因组
50–100倍的覆盖。第3代单分子测序技术在测序过程
中省略了克隆步骤, 具有样品准备过程和数据分析流
程简单、测序读长较长、测序精度高且能同时进行多
690 植物学报 48(6) 2013
个样品分析等优点, 极大地提高了测序速度, 测序成
本也降低了几个数量级(Delseny et al., 2010; Thudi
et al., 2012)。由于读长更长, 获得的重叠群长度是第
2代测序技术的2倍(Schatz, 2012), 这势必对未来其
它针叶树全基因组测序项目的开展产生重要影响。
与基因组的巨大性相比, 高复杂性对全基因组测
序造成的困难更大。如针叶树中广泛存在的转座子对
序列的组装构成了极大的障碍, 特别是在短序列测序
技术条件下, 准确发现并处理这些高复杂度或低复杂
度的重复区域成为全基因组测序至关重要的问题
(Schatz et al., 2010)。重复序列会导致比对及组装时
出现空缺(gap), 或出现模棱两可的情况甚至无法直
接比对和组装, 而简单删除重复序列也不可取, 因为
这有可能删除有重要生物学功能的区域。
相对这些困难, 针叶树基因组共线性强的特点成
为测序及组装的有利条件, 如多个物种的序列联合组
装(joint assembly)可以提升组装的能力。对单倍体组
织测序可以避免等位基因差异对序列组装的影响, 起
初人们认为单倍体DNA含量较少, 可能不足以支持
测序, 但后来发现这一问题有可能通过组织培养技术
获得成功解决。针叶树中有相当比例的重复序列比较
古老, 分化较为严重(Kovach et al., 2010), 故针叶树
基因组中重复序列较多可能并不是序列组装困难的
原因, 真正的困难可能是高昂的测序经费。
针叶树基因组资源挖掘已进入一个重要和多产
的时期, 首幅针叶树全基因组序列草图已于今年发
布。这一里程碑事件将使针叶树基因组研究进入后基
因组时代, 同时也为主要针叶树树种的重测序及其它
针叶树全基因组测序项目的开展打开了大门。相信在
不久的将来, 会有更多的针叶树树种列入全基因组测
序项目中。
致谢 瑞典植物科学中心的Par K. Ingvarsson教授
在成文过程中给予了大力支持, 特此致谢！
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Chenlu Xu, Xiaomei Sun*, Shougong Zhang
Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese
Academy of Forestry, Beijing 100091, China
Abstract Conifers are the largest and most ubiquitous group of gymnosperms. They are woody perennials that shape
many northern hemisphere ecosystems and support large industries through the provision of wood, fiber, and energy.
Sequencing conifer genomes is relevant because of their taxonomic position, ecological significance, and economic im-
portance. However, the large and complex genomes of conifers have hindered the mining process, and by April 2013, no
whole-genome sequences for conifer have been obtained. With the emergence of next-generation sequencing and rapid
development of bioinformatics, the conifer sequence resources mining project has transitioned from the transcriptome to
whole-genome sequencing projects, initiated in Pinus, Picea and Pseudotsuga genus. This review summarizes the
characteristics of the conifer genome, reviews the current status of genome sequencing of conifers and outlines the cur-
rent state of knowledge concerning the genomes of conifer (Pinus taeda, Picea abies and Picea glauca).
Key words conifers, genome, research progress, transcriptome, whole genome sequencing
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———————————————
* Author for correspondence. E-mail: xmsun@caf.ac.cn
(责任编辑: 孙冬花)