全 文 ：第 26卷第 8期
2006年 8月
生 态 学 报
ACTA EC0L0GICA SINICA
V01．26．No．8
Aug．，2006
糖蜜草(Melinis minutiflora Beauv．)
内生固氮茵分离鉴定
王华荣 ，彭桂香 ，张国霞 ，侯 伟 ，谭志远 ’
(1．广东省植物分子育种重点实验室，广州 510642；2．华南农业大学 农学院，广州 510642；
3．华南农业大学 资源环境学院，广州 510642)
摘要 ：糖蜜草 (Melinis rainutiflora Beauv．)是热带地区的一种优 良牧草 。采用选择性培养基在厌氧 和好氧两种培 养条件下 ，从糖蜜
草根 、茎 中都可分离 得到具有较 强 固氮酶活性的菌株 。通过 SDS-PAGE全细胞蛋白电泳技 术快速 聚类 分析表 明 ，来源 于糖蜜草
中的菌株为同一类群。16S rDNA序列分析和总 DNA的 G+c％含量进一步确定糖蜜草 中所分离的菌株 属于 固氮螺菌属
(Azospirilum)，与产脂 固氮螺菌 (Azospirilum zipD厂eⅢm)亲缘关系较近。BIOLOG板测定 结果显示 ，糖蜜 草菌株 TMCY243对多种碳
源具有很强的适应性，与产脂固氮螺菌(A．1ipoferum)的模式菌株 DSM 1691存在着较大的差异。以上结果表明，糖蜜草内生固
氮菌为 固氮螺菌属 的一个新类群 。
关键词 ：内生 固氮菌 ；糖蜜草 ；固氮螺菌 ；BIOLOG；系统 发育
文章编号：1000．0933(2OO6)08．2566．06 中图分类号 ：s511 文献标 识码 ：A
Characterization of endophytic diazotrophs isolated from molasses grass
W ANG Hua．Rong 一 ，PENG Gui．Xiang ，ZHANG Guo-Xia 一 ，HOU W ei 一 ，TAN Zhi-Yuan ’ ’ (1．GW ，lg Pr w f研 6
ofPlantMolecularBreding，South China Ag廊 ．Univ．，Guangzhou 510642，China ；2．Colege ofAgricuhure，South ChinaAg廊 ．Univ．，Guangzhou 510642，
China ；3．Colege ofResources and Environment，South China A ．Univ．，Guangzhou 510642，China)．Acta Ecoiogica Sinica，20O6，26(S)：2566—2571．
Abstract：Molasses grass(Melinis minutiflora Beauv．)is a good fodder in tropical area．In this study，endophytic bacteria with
high nitrogenase activity were isolated from the roots and stems of molasses grass grown in Guangdong province by using a selective
medium under anaerobic or aerobic conditions．SDS-PAGE of whole-cell proteins clustered al the 15 isolates into a single group．
1 6S rDNA sequence analysis showed that these isolates belonged to the genus Azospirillum ，and were closely related to A．
1ipoferum．BIOLOG test indicated that the representative strain，TMCY243，from molasses grass was able to utilize a wider range
of carbon sources than the type strain DSM 1691 of A．1ipoferum．Based on these results，we concluded that the endophytic
diazotrophs isolated from molasses grass represented a new species of Azospirilum ．This bacterium distributed widely in association
with its host plant in the subtropic regions of China．
Key words：endophyte diazotroph：molasses grass(Melinis minutiflora Beauv．)；Azospirillum；BIOLOG；Phylogeny
生物固氮为全球的植物提供75％的氮素，是生命科学中的重大研究课题 。Dfbereiner等 人对禾本科
植物共生 固氮菌研究发现，固氮螺菌(Azospirilum)大多聚集于植物根 表，部分侵入根的皮层或 中柱内，形成
“原始”的共生，是介 于根 际 自生固氮和结 瘤 固氮的过渡类型 ，称这种 固氮类 型为联合共生 固氮 (associative
基金项目：国家自然科学基金资助项 目(30300001，30470002)；国家教育部科学技术研究重点资助项目(205111)；华南农业大学校长基金资助项目
收稿 日期：2005．05．28；修订 日期 ：2006．03．15
作者简介：王华荣(1980～)，男，江苏昆山人，硕士生，主要从事分子遗传育种研究．E．mail：wanghr1980@tom．com
*通讯作者 Coresponding author E—mail：zytan@scan．edu．cn
Foundation item：The project was suppoaed by National Natural Science Foundation of China(No．3030000 1，30470002)；Key Pmject of Chinese Ministry of
Education(No．205 1 1 1)and Presidential Foundation of South China Asrlcultural University
Received date：2005—05—28：Accepted da te ：2006—03—15
Biography：WANG Hua—Rang，Master candidate，mainly engaged in molecular breeding of genetics．E·mail：wanghr1980@tom．com
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8期 王华荣 等：糖蜜草(Melinis minutiflora Beauv．)内生固氮菌分离鉴定
symbiotic nitrogen fixation)。作为生物固氮的一部分．植物内生固氮菌 的发现和研究显现 了一个新的固氮系统 ，
深化了根际联合共生固氮的研究。植物体内存在着大量细菌，它们的存在不但对宿主植物生长不造成危害，
相反地，这些内生菌通过至少 3个 因素来进一步促进植物生长 ：植物生长调节剂的分泌 、植物病原体的抗性 以
及生物固氮 。其中植物内生固氮菌(Endophytic diazotrophs)定殖在植物体内，并能起固氮作用，为宿主提供
氮元素。 。
随着对内生固氮菌 的深入研究 ，人们 已从多种植物 中分离得 到植物 内生固氮菌 ，如甘蔗 ]、水稻 ]、玉
米【l 等非豆科植物。糖蜜草(Melinis minutiflora Beauv．)是热带地区的一种优良牧草，但迄今为止，未见有糖蜜
草内生固氮菌的报道。本实验以糖蜜草作为研究对象，用无氮培养基分离得到了一群具有较高固氮酶活性的
菌株 ，并对其做了 SDS．PAGE全细胞蛋白电泳和生理生化实验(BIOLOG板测定)。
1 材料和方法 ．
1．1 材料来源
糖蜜草样本于 2004年 7月采集于珠海贫瘠山坡荒地 。Azospirilum lipoferum模式菌株 DSM 1691购于德 国
DSMZ菌株保存中心。
1．2 菌株的分离 、纯化
将采集的新鲜糖蜜草样本用蒸馏水洗净 ，然后 剪下根、茎 、叶并分别置于 已灭菌 的 3个培养皿 中，用 3％
的双氧水(H2O )浸泡 4 min(以除去根 、茎 、叶表面的腐烂物质)，无菌水洗涤一次 ，再用 0．1％的升汞(HgCl )浸
泡 5 min，无菌水中振动洗涤 5～7次 ，每次 5～10rain，并将最后一次洗涤液涂布于固体培养基，以检测消毒是
否彻底。将表面消毒完全的根 、茎 、叶用灭菌手术刀切碎 ，分别穿刺接种到 3支装有 FNb半固体培养基的试管
中，胶塞密封后 ，置于 28℃的人工培养箱内进行培养 。整个操作均在无菌条件下完成。待长 出菌体后 ，向管
内注入 1／10体积 10％乙炔气体(终浓度为 1％)，在相同条件下再培养 24 h，测定其固氮酶活性(乙炔还原法)。
将具有固氮酶活性的菌株从半固体管中接至相应的固体培养基上，平板划线分离，28℃，湿度为 85％条件下，
进行厌氧 (仪器为 ：YQX．1型厌氧培养箱)及好氧培养 。再挑取单菌落分别接种至半 固体培养基试管中，以检
测固氮酶活性 ，再涂平板直到获得纯的菌株 ，最后通过镜检 ，革兰氏染色 ，进一步观察其形态及确定纯化与否。
NFb培养基的主要成分 ：malic acid 5．0 g／L，K2 HPO4 0．5 g／L，MgS04·7H2O 0．2 g／L，NaC1 0．1 g／L，CaC12 0．02
g／L，0．5％ bromthymol blue(in KOH 0．2 mol／L)2．0 ml／L，vitamin solution 1．0 ml／L，micronutrient solution 2．0 ml／L，
1．64％ Fe—EDTA溶 液 4．0 ml／L，KOH 4．5 g／L，pH=6．8。其中 vitamin solution：biotin 100．0 mg／L，pyfidoxo1．HC1
200．0 mg／L；micronutrient solution：CuS04 0．4 g／L，ZnSO4。7H20 0．12 g／L，H2BO3 1．4 g／L，Na2Mo04。2H2O 1．0 g／L，
MnS04 1．5 g／L。VM．Ethanol培养基的主要成分 ：Dt~bereiner-basic 10．0 ml／L，re( )．EDTA(0．66％)10．0 ml／L，Yeast
Extract 1．0 g／L，Peptone 3．0 g／L，NI-I,C1 0．5 g／L，NaC1 1．0 g／L，K-PO -Buffer 3．0 ml／L(分开灭菌)，Ethanol 6．0 ml／L
(过滤灭菌)。D6bereiner-basic组成 ：MgS04·7H20 20．0 g／L，NaC1 10．0 g／L，CaC1 2．64 g／L(分开灭菌 )，MnS04·
2H2O 1．0 g／L，Na2MoO4。2H20 0．2 g／L。
固体培养基中加入 1．7％的 Agar，半 固体培养基 中加入 0．15％ ～0．25％的 Agar。
1．3 气相色谱法测定 固氮酶活性
将 已纯化的菌株和菌株 DSM1691分别接人盛有 NFb半固体培养基的试管内，用胶塞 密封。于温度 28℃
下培养 24 h后，向管 内注入 1／10体积 10％乙炔气体 (使其终浓度为 1％)。在同样条件培养箱 内培养 24 h，用
气相色谱测定其固氮酶活性(仪器为北京分析仪器厂生产 SP．2100气相色谱)。计算方法参照文献 ¨，按以下
公式进行计算酶活。
EA1=(58．0×Se×T×Pe)／(Sb×Te×P×t)(／lmol／h)
式中，se为乙烯峰面积；T：开氏绝对温度(T=273．13K)；Pe为实验条件下的大气压强(Pa)；Sb为乙炔峰
面积；Te为实验条件下的温度(K)；P为绝对大气压强(P=101324．72 Pa)；t为培养时间( 24h)每株菌培养
做3个重复，分别测定，再计算其平均值。
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1．4 SDS—PAGE全细胞蛋白电泳分析
将纯化后的菌株接入 5 ml VM—Ethanol液体培养基中振荡预培养过夜，培养条件为 28℃，100 r／min。用无
菌离心 管 4000 r／min离心 收 集菌 体，弃上 清 。用 6 ml灭 菌 的 PBS缓 冲 液 (NaC1 8．0 g／L，KC1 0．2 g／L，
Na2HPO ‘2 H2O 2．9 g／L，KH2PO 0．2 g／L，pH 7．2)离心洗涤 1次。再加入 6 ml灭菌的 PBS缓冲液 ，振动混匀
细胞，取 2 fnl混悬 液涂布 于 VM—Ethanol固体培养 基上 ，28。c培养 36 h．将菌体收集 于预称 重 的 1．5 fnl
Eppendof管中，加入 1．0 ml PBS缓冲液 ，振动混匀 ，4000 r／rain离心 ，弃上清 ，用干净吸水纸吸干离心管壁周围
水分，称重。按照 150．0 mg／ml浓度加入 4×extraction buffer，样品 一20~C贮存备用。4×extraction buffer组成为
glycerol 30mJ(终浓度为 60％)，SDS 0．46 g(终浓度为 9．2％)，Tris—HC1(pH 6．8)1．52 g溶于 15 fnl去离子水 中
(终浓度 为 0．25 mol／L)，bromphenol blue(溴 酚蓝 )6．0 mg(慢 慢加热 ，搅拌 溶解 ，终浓 度为 0．012％)，B—
mercaptoethanol(B一巯基乙醇)2．5 fnl(终浓度为 5％)，加去离子水到总体积 50 fnl，一20~C贮存备用。电泳具
体操作见参照文献 。
1．5 碳源利用(BIOLOG板)测定
糖蜜草分离物经 SDS—PAGE快速聚类后 ，选取代表菌株和亲缘关系密切的产脂 固氮螺菌 A．1ipoferum模
式菌株 DSM 1691进行 BIOLOG板对比试验 ，测定其生理生化特性 ，主要比较 碳源的利用情况。选用 BIOLOG
GN2板，基本按 BIOLOG GN2板的操作步骤进行 ¨，有所修改。为 ：菌株首先经 NFb培养基平板活化 ，再于专
用培养基 BUGM(BIOLOG Universal Growth Medium)上划线培养(30~C，12～18h)；②用无菌棉签小心刮取菌苔
至盛有 18～20ml预热的灭菌生理盐水的三角瓶 中，涡旋振荡至均匀菌悬液 ，取部分菌悬液至 7230分光光度
计上比色测定浓度 ，调节 OD590值为 0．25～0．30，采用 8孔移液器加样 ，每孔 150(L，28℃培养 ，在接种 4h后
和 24h后 目测 ，以 A1孔(内无碳源)为对照 ，凡与该孔颜 色相近者记“一”，与此孔相 比有 明显紫色出现者记 为
“ + ”
，不 能分 辨者记 为“+／一”；培养 24h后 用 BIO—RAD Benchmark plus酶标 仪测读 结果 ，滤 光 片波长 为
590nm，和 目测结果比较 ，以准确判断菌株在不同碳源下的生长状况。
2 结果与分析
2．1 分离纯化结果
从糖蜜草中分离纯化得到 TMCY055，TMCY023，TMCY225，TMCY0551，TMCY0831，TMCY025 TMCY24，
TMCY0832，TMCY0256，TMCY255，TCMY41，TMCY0552，TMCY243，TMCY244，TMCY066共 15株 内生固氮菌
株。
2．2 固氮酶活性的测定
对以上 15株菌进行固氮酶活性测定 ，其值在 48．55～54．65t~mol／h，而 Azospirillum l~oferum模 式菌株 的活
性为 49．13gmol·h～，也在这个范 围之内。在一定条件下 ，乙炔还原活性 与固氮 酶对氮气的固定活性呈正相
关 ，表 1结果表明这些菌株具有较强的固氮活性。
表 1 糖蜜草各菌株及模式菌株 DSM1691固氮酶活性测定 结果
Table 1 Test of nitrogenase activity of isolates and type strain DSM 1691
2．3 SDS—PAGE全细胞蛋 白电泳分析
SDS—PAGE全细胞蛋 白电泳分析在菌株聚类的分析中具有简单快速的特点⋯ 。闫爱民等 在对干旱地
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8期 王华荣 等 ：糖蜜草(Melinis minutiflora Beauv．)内生固氮菌分离鉴定 2569
区几种豆科植物根瘤菌的数值分类和 SDS．PAGE全细
胞蛋白电泳分析中证实 了蛋 白分析 的聚类结果与数值
分类结果比较近似。将来源于糖蜜草 的内生 固氮菌进
行 SDS．PAGE全细胞蛋 白电泳聚类 (图 1)。图 1中，来
源 于 糖 蜜 草 菌 株 TMCY055，TMCY023，TMCY255，
TMCY055 1， TMCY083 1， TMCY025， TMCY24，
TMCY0832，TMCY0256，TMCY225，TCMY41，TMCY0552，
TMCY243，TMCY244，TMcY066蛋 白电泳图谱基本是一
致的，说明分离所获得 的菌株是属于 同一种蛋 白质图谱
类群 。根 据 蛋 白质 聚类 结 果，选 取 了 3株 代表 菌株
TMCY41，TMCY243和 TMCY244进行 16S rRNA基因全
KDa
l16 0
66 2
45 0
35 0
25 0
l8 4
l4 4
图 1 糖蜜草 内生 固氮菌及产脂 固氮螺菌 DSM169I的 SDS-PAGE全
细胞蛋白电泳 图谱
Fig．1 The protein patterns of endophytic diazotrophs l 【J_．1II d from molasses
序 列分 析 。序 列 分 析 表 明，TMCY41，TMCY243和 gras and Azosp “ lipofe D 川 y D -PAGE “ y i。
TMCY244具有很高的同源性，与 GenBank中同源序列搜索比较，其亲缘关系最近的菌株为产脂 固氮螺菌
(Azospirilum lipoferum)，二者具有 97％的相似性。进一步将糖蜜草分离物与产脂 固氮螺菌(A．坳ofe／2tm)模式
菌株 DSM 1691的蛋白质图谱类型进行比较，它们的图谱类型具有一定的相似性，但又有一定的差异。说明来
源于糖蜜草的内生固氮菌有可能为一新的内生固氮菌类群。
2．4 菌落形态和培养特征
参考《一般细菌常用鉴定方法》 ，在 Nfb固体培养基上为无色透 明，边缘光滑且具有粘液的 圆形菌落。
在培养过程 中，能使含溴百里酚蓝的 pH6．8培养基有绿色变为蓝色，说 明菌株在生长过 程中产碱 。革兰氏染
色均为阴性 ，杆状 ，(1．0～2．0)m×(2．0～3．0)m。最适生 长温度 28℃，37℃能正常生 长，最适生长 pH6．0～
7．0，兼性好氧。
2．5 碳源的利用(BIOLOG测定)
微生物对碳源利用的不同，能反映微生物不同的生理生化代谢途径 ，从而区分不同类群的微生物 。同时
微生物利用碳源进行呼吸时 ，会将 四唑类氧化还原染色剂从无色还原成紫色 ，从而在微生物鉴定板上形成该
微生物特征性的反应模式或“指纹”，通过纤维光学读取设备．读数仪来读取颜色变化 ，并将该反应模式或“指
纹”与数据库相 比就可以得到鉴定结果。选取来源于糖蜜草内生 固氮菌代表菌株 TMCY 243和产脂 固氮螺菌
(A． mm)模式菌株 DSM 1691进行碳源利用比较。二者都能很好地利用糊精 、D一纤维二糖、龙胆二糖 、m一
肌醇 、麦芽糖 、松二糖 、D一半乳糖醛 酸、D一葡萄糖酸、D．葡萄醛酸、L一丙氨酰甘氨酸、L一天氡酰氨酸、L。天 门冬氨
酸 、L．谷氨酸 、L一脯氨酸 、D一丝氨酸 、N一乙酰基一D一葡萄糖胺 、L．阿拉 伯糖 、D一果糖 、D．甘露醇 、D一甘露糖 、L．棉子
糖 、D一山梨醇、D一海藻糖 、D一丙氨酸 、丙三醇 、吐温 40、乳果糖 、蔗糖 、B一羟基苯乙酸、奎尼酸 、吐温 80、D，L一乳酸、
L一丝氨酸作为唯一碳源；二者都不能利用甲酸 、L．鸟氨酸 、L一苯丙氨酸 、L一焦谷氨酸 、2一氨基 乙醇 、乙酸 、丙酸 、葡
糖醛酸胺 、衣康酸 、尿刊酸等作为唯一碳源。碳源利用差异结果见表 2。表 2中如 TMCY 243以 D一蜜二糖 、D一
棉子糖为碳源的培养基上生长旺盛 ，而在以赤藻糖醇 、木糖醇为碳源的培养基上无法生长，但对产脂 固氮螺菌
(A．1ipoferum)DSM 1691而言情况恰恰相反。
3 小结与讨论
植物 内生固氮菌的发现展现了一个新的固氮系统 ，为植物实现生物固氮开辟了一条新的途径 。因为内生
固氮菌定殖于植物体内部，在木质部的导管区域进行 固氮作用，而这个部位不仅可满足细菌生长和固氮所需
的足够的能源、低氧分压以及交换代谢产物的微环境，还避免了化合态氮的抑制及土著微生物的竞争，固定的
氮又可直接供给植物吸收，因而表现出更高的固氮效率 。¨ 。对于内生固氮菌的分离，应该考虑到内生固氮
菌的生长条件 ，首先是宿主植物属 c3还是 c4型植株 ，因为 c3与 c4植株所能提供的碳源是不同的。其次 ，氧
分压的高低直接影响着 内生 固氮菌 固氮酶活性的高低 ，而且一般情况下 ，氧分压越高则对固氮酶活性抑制作
ja芒对
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0 u
寸 1)
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2570 生 态 学 报 26卷
表2 糖蜜草内生固氮菌代表菌株TMCY 243与产脂固氯螺菌(A．1ipoferum)模式菌株 DSM 1691的碳源利用差异
Table 2 The diferent carbon utilization by representative strain TMCY 243 isolated from molasses gras and type strain DSM 1691 of A．ipoferum
一
， 小 生 长 Strain Call not grow；+，生 长 Strain Cal grow；+／一，微 弱 生 长 Strain can grow slighfly
用越强 。也是说，在纯培养条件下 ，如果能给内生固氮菌低氧分压 ，使其生长 良好 ，这样就有利于其更好地
分离与纯化。本研究对优 良牧草一糖蜜草(Melinis minutiflora Beauv．)进行分离纯化时，选择苹果酸(malic acid)
作为碳源 ，并采用厌氧和好氧条件分别进行培养 ，最终分离得到一群内生 固氮菌株。由于 NFb培养基只有苹
果酸(malic acid)作为唯一碳源，不一定适合于其它存在于糖蜜草植株 中内生固氮菌的生长，在分离过程 中其
他种类的内生固氮菌有可能被“淘汰”了。将采用其它碳源作培养基，进一步分离糖蜜草中有可能存在的其它
种类的内生固氮菌。对分离得到的菌株 ，通过气相色谱法测定其具较高 固氮酶活性的前提下，先经过 SDS．
PAGE全细胞蛋 白电泳快速聚类 ，确定分离所得 的菌株 为同一蛋 白质图谱类型。再测定原核生物 中保守的
16S rDNA序列和总 DNA的 G+C％含量 ，初步确定来源于糖蜜草中内生固氮菌株为固氮螺菌属(Azospirillum)
的新类群 ，并与产脂 固氮螺菌(A．1ipoferum)模式菌株 DSM 1691具有 97％相似性。进行碳源利用实验后进一
步说明来源于糖蜜草的内生 固氮 菌为一新 的内生固氮菌类群。还需要利用 如插入序列指 纹图谱分析 (IS．
PCR)¨ 和脂肪酸成分分析等多相分类手段来确证其是否为一新种 。
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