全 文 ：第 26 卷第 11 期
2006 年 11 月
生 　　态 　　学 　　报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 26 ,No. 11
Nov. ,2006
PCR2D GGE技术用于湖泊沉积物中
微生物群落结构多样性研究
赵兴青 ,杨柳燕 3 ,陈　灿 ,肖　琳 ,蒋丽娟 ,马　　 ,朱昊巍 ,于振洋 ,尹大强
(污染控制与资源化研究国家重点实验室 ,南京大学环境学院 ,南京　210093)
基金项目 :国家“973”资助项目 (2002CB412307) ;国家重大水环境专项资助项目 (2002AA601011) ;国家自然科学基金资助项目 (40371102)
收稿日期 :2006204212 ;修订日期 :2006207212
作者简介 :赵兴青 (1974～) ,女 ,江苏高邮人 ,博士生 ,主要从事环境微生物生态学.3 通讯作者 Corresponding author. E-mail :yangly @nju. edu. cn
Foundation item :The project was financially supported by National “973”Project , China ( No. 2002CB412307 ) ; National “863”Project , China ( No.
2002AA601011) ; The National Natural Science Foundation of China (No. 40371102)
Received date :2006204212 ;Accepted date :2006207212
Biography :ZHAO Xing2Qing , Ph. D. candidate , mainly engaged in environmental microbial ecology.
摘要 :采用 PCR2DGGE分子指纹图谱技术比较南京市玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置的表层沉积物微生物群落结构 ,研究结果
表明 ,三湖泊沉积物微生物的 16S rDNA 的 PCR 扩增结果约为 626 bp ,为 16S rDNA V3～V5 区特异性片段。玄武湖和莫愁湖表层
沉积物中大约有 20 种优势菌群 ,且同一湖泊不同采样点 DGGE 图谱的差异性不大 ,细菌群落结构具有较高的相似性 ,而太湖样
品 DGGE 条带的数目和位置表现出明显差异 ,且不同采样点图谱的差异性较大。三湖泊除具有特征性的微生物种属外 ,还分布
约 5 个相同的细菌种群 ,可能与沉积物的理化性质和水生植被的影响相关。对 DGGE 图谱中 7 条主带进行回收、扩增和测序 ,
结果显示其优势菌群具有不同的序列组成 ,其中 5 个序列与 Genebank 中已登录的细菌种群的同源性 ≥99 % ,2 个序列的同源性
为 96 %和 93 % ,其中 2 个相似的细菌类群目前尚未获得纯培养。
关键词 :沉积物 ;微生物多样性 ;变性梯度凝胶电泳 (DGGE) ;16S rDNA ;序列测定
文章编号 :100020933(2006) 1123610207 　中图分类号 :Q938 　文献标识码 :A
Study on the microbial diversity in lake sediments by the method of PCR2D GGE
ZHAO Xing2Qing , YANG Liu2Yan 3 , CHEN Can , XIAO Lin , J IANG Li2Juan , MA Zhe , ZHU Hao2Wei , YU Zhen2
Yang , YIN Da2Qiang 　( State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse , School of the Environment , Nanjing University , Nanjing 210093 ,
China) . Acta Ecologica Sinica ,2006 ,26( 11) :3610～3616.
Abstract :As a new technique for DNA fingerprinting , denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) can be used for microbial
diversity analysis in environmental samples. In this study , PCR2DGGE was applied to analyze the microbial communities in lake
sediments . Sediment samples from seven locations in three lakes were collected and their genomic DNA was directly extracted. The
DNA yield of sediments of Lake Xuanwu and Lake Mochou was high (10μgΠg) , while that of sediments in Lake Taihu was
relatively low. After DNA purification , the 16S rRNA genes ( V3 to V5 region) were amplified with two universal primers
(F341GC and R907) . These amplified DNA fragments were separated by parallel DGGE.
The DGGE profiles indicate different bands’patterns for different samples. There are five common bands in all lake sediment
samples , which indicate that there are similarities among the populations of microorganisms that exist in all lake sediments. But ,
the specific bands in sediment samples indicate that the microbial communities in different lakes are different . The DGGE profiles
of Lake Xuanwu and Lake Mochou are very similar and about twenty types of microorganisms are identified in the sediment samples
of both lakes. These results suggest that the sediment samples of these two city lakes (Xuanwu , Mochou) have similar microbial
communities. However , the DGGE profiles of sediment samples in Lake Taihu are significant different from these two lakes.
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Furthermore , the DGGE profiles of sediment samples in different locations in Lake Taihu are also very different , which suggests
that the microbial communities in Lake Taihu are more diversified than those in Lake Xuanwu and Lake Mochou. The differences
in microbial diversity may be caused by the different environmental conditions , such as redox potential , pH , and the
concentrations of organic matters , etc.
Seven major bands of 16S rDNA genes fragments from DGGE profiles of sediment samples were further eluted from gel ,
reamplified and sequenced. The sequences of these fragments were compared with the database in GeneBank (NCBI) . The results
indicate that five sequences share 99 %～ 100 % homology with known sequences ( Bacillus and Brevibacillus , uncultured
bacteria) , while the other two sequences share 96 % ～ 93 % homology with known sequences ( Acinetobacter and Bacillus) .
These results indicate that the PCR2DGGE technique combined with sequences determination is a feasible and efficient
method for microbial community analysis in sediment samples.
Key words :sediment ; microbial diversity ; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) ; 16S ribosome DNA (16S rDNA) ;
sequence
　　变性梯度凝胶电泳 (Denaturing gradient gel electrophoresis , DGGE)技术最先由 Fischer 和 Lerman 提出并用于
DNA 突变检测 ,1993 年 Muyzer 将该技术首次应用于微生物生态学研究 ,现在该技术在微生物群落多样性和
种群动态监测中得到广泛使用[1 ] 。这种方法基于从样品中直接提取微生物群落的基因组 DNA ,选择对大多
数细菌和古生菌的 16S rDNA 基因都能有效扩增的引物对其进行 PCR 扩增 ,然后对 PCR 产物采用 DGGE 进行
分离 ,最后通过鉴定得出自然环境中微生物群落多样性的信息。目前采用 PCR2DGGE 方法分析土壤或活性
污泥中微生物多样性均有报道[2～4 ] ,但对天然湖泊沉积物的细菌群落的多样性研究还未见报道。
在湖泊生态系统中 ,微生物对物质循环和能量流动发挥着巨大的作用 ,为了有效研究微生物的作用就必
须对其群落进行分析 ,而采用传统的分离培养方法 ,不足以得到丰富的微生物多样性信息。本研究采用从玄
武湖、莫愁湖和太湖沉积物中直接提取微生物总 DNA ,然后通过 DGGE 指纹图谱来分析湖泊表层沉积物中微
生物群落结构的差异性 ,结合条带回收、扩增、序列测定 ,从而了解不同湖泊和相同湖泊不同位点的微生物群
落结构的多样性。
图 1 　太湖沉积物样品采集点位置
Fig. 1 　The sediment samples stations in Lake Taihu
1 　材料和方法
1. 1 　材料
1. 1. 1 　湖泊沉积物样品 　于 2005 年 12 月份分别采集
南京市玄武湖、莫愁湖和太湖的表层沉积物样品 ,采集
后的样品立即冷藏带回实验室 ,于 - 20 ℃冰箱保存。7
个样品依次标记为 :1 # 、2 # (玄武湖不同位置两点) ,
3 # 、4 # (莫愁湖不同位置两点) ,5 # (太湖梅梁湾生态
系统试验区内 N 31°30′306″, E 120°13′370″) ,6 # (太湖
梅梁湾生态系统试验区外 N 31°30′181″, E 120°125′
66″) ,7 # (太湖贡湖湾 N 31°23′767″, E 120°19′471″)
(图 1) 。
1. 1. 2 　仪器及设备 　台式冷冻离心机 5417R (德国
Eppendorf) ;超纯水 (Millipore) ;凝胶成像仪 (美国 Bio2
Rad) ;梯度 PCR 仪 (美国 Bio2Rad) ;基因突变检测仪 (美
国 Bio2Rad) ;水平电泳仪 (美国 Bio2Rad) 。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　基因组总 DNA 的提取和测定 　将 5 g 左右的沉积物样品加入 1315 ml 提取缓冲液 (011 molΠL PBS (pH
810) ,011 molΠL EDTA ,011molΠL Tris base (pH 810) ,115 molΠL NaCl ,110 % CTAB)和 50μl 蛋白酶 K (10 mgΠL) ,
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在 37 ℃、225 rΠmin 振荡 30 min 后 ,加入 115 ml 20 % 的 SDS ,然后 65 ℃水浴加热 2 h(每隔 15 min 轻轻摇动一
次) 。将上述样品处理液以 5000 rΠmin 离心 10 min 后收集上清液 ,加入等体积的酚Π氯仿Π异戊醇 (25∶24∶1) 混
匀 ,离心 5 min ,将上清液转入另一只离心管中 ,加入 1∶1 的氯仿Π异戊醇 (24∶1) 抽提上清液 ,9000 rΠmin 离心 5
min 后 ,在上清液中加入 016 倍体积异丙醇 ,4 ℃过夜沉淀 ,12000 rΠmin 离心 15 min ,弃上清液 ,70 %冰乙醇清
洗两次 ,无菌风吹干 ,用 100μl TE 缓冲液溶解沉淀得到总 DNA 的粗提液 ,置于 - 20 ℃保存。
使用酶标仪对提取的 DNA 粗提液样品中核酸 (A260 ) 、蛋白 (A280 ) 和腐殖质 (A230 ) 进行测定 ,计算所得样
品 DNA 的得率和纯度。
1. 2. 2 　基因组总 DNA 的纯化 　采用上海生工的玻璃珠 DNA 胶回收试剂盒 (产品号 :SK111) 对沉积物样品的
基因组 DNA 粗提液进行了纯化。
1. 2. 3 　基因组 DNA 的 PCR 扩增
(1) 16S rDNA 基因 V3～V5 区的扩增 (包括 V 8 高可变区) 　将纯化后的基因组 DNA 作为聚合酶链式反
应的模板 ,使用美国 Bio2Rad 公司的基因扩增仪 ,采用对大多数细菌和古生菌的 16S rDNA 基因 V3～V5 区具
有特异性的引物对 GC2F341 和 R907[5 ] ,它们的序列分别为 : F341 (5′2CCTACGGGAGGCAGCAG23′) ; R907 (5′2
CCGTCAATTCCTTTGAGTTT23′) , GC 发卡结构[6 ] ( 5′2CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGC2
3′) ,扩增产物片段长约 626 bp。
(2) PCR 反应体系 　50μl 的 PCR 反应体系组成如下 : 50 ng 的模板、20 pmol 正反向引物、200μmolΠL
dNTP、5μl 的 10 ×PCR buffer (不含 MgCl2 ) 、115 mmolΠL 的 MgCl2 、1U 的 ExTaqDNA 聚合酶和适量的双蒸水补
足 50μl。
(3) PCR 反应条件 　PCR 反应采用 touchdown 降落 PCR 策略[7 ] ,即 :预变性条件为 94 ℃5 min ,前 20 个循
环为 94 ℃1 min ,65～55 ℃1 min 和 72 ℃3 min (其中每个循环后复性温度下降 015 ℃) ,后 10 个循环为 94 ℃1
min ,55 ℃1 min 和 72 ℃3 min ,最后在 72 ℃下延伸 8 min ,4 ℃保存。PCR 反应的产物用 2 % 琼脂糖凝胶电泳
检测。
1. 2. 4 　PCR 反应产物的变性梯度凝胶电泳分析 　采用 Bio2Rad 公司 DcodeTM 的基因突变检测系统对 PCR 反
应产物进行分析。
(1) 变性胶的制备 　使用梯度胶制备装置 ,制备变性剂浓度从 30 % 到 60 % (100 % 的变性剂为 7 molΠL
的尿素和 40 % 的去离子甲酰胺的混合物)的 6 % 聚丙烯酰胺凝胶 ,其中变性剂的浓度从胶的上方向下方依次
递增[8 ] 。
(2) PCR 样品的加样 　待胶完全凝固后 ,将胶板放入装有 1 ×TAE 电泳缓冲液的装置中 ,在每个加样孔中
加入含有 3∶1 的 6 ×溴酚蓝二甲苯氰溶液的 PCR 样品 20～30μl。
(3) 电泳及染色 　在 100 V 的恒定电压下 ,60 ℃恒温下电泳 12 h。电泳完毕后 ,将凝胶在 EB 中染色 20
～30 min[9 ] 。
(4) 观察及照相 　用凝胶成像分析系统分析染色后的凝胶 ,观察每个样品的电泳条带并拍照。
1. 2. 5 　DGGE 分离后的 PCR 产物的电泳条带的指纹图谱分析 　观察各个样品的 PCR 产物经 DGGE 分离后
的电泳图谱照片 ,采用 Quantity One 分析软件 (Bio2Rad) 分析沉积物样品中电泳条带的数目和亮度来评估不
同湖泊沉积物样品的微生物群落的多样性和丰富度。
1. 2. 6 　切胶与测序
(1) 切胶回收条带重新进行 PCR 扩增 　在紫外照射下 ,选择 DGGE 胶上比较亮的条带 ,用灭菌刀片进行
切割 ,回收的凝胶条带挤碎 ,浸泡在 30μl 的 TE 中 ,4 ℃冰箱中过夜 ,取 3μl 为模板按 16S rDNA 基因组总 DNA
扩增体系和扩增程序再次扩增 ,引物为 F341ΠR907 (不带 GC 夹) ,最后将 PCR 扩增产物送上海英骏生物技术
有限公司测序。
(2) 同源性比较 　登陆 NCBI (http :ΠΠwww1ncbi1nlm1nih1govΠblast) ,将所得的序列提交到 GeneBank 登记 ,在
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GeneBank 数据库中用 BLAST 进行检索和同源性比较。
2 　结果与分析
2. 1 　基因组 DNA 的提取和纯化
由于沉积物样品中化学组分复杂 ,能否成功提取目标 DNA 片段以及提取效率的高低直接影响后续 PCR2
DGGE 分析。从 7 个沉积物样品中提取的 DNA 通过琼脂糖凝胶电泳检验 (图 2) ,均得到一条清晰条带 ,通过
Quantity One 分析软件分析总 DNA 片段大小约为 23 kb 左右[10 ] ,与细菌基因组的大小相同。因此 ,所提 DNA
属于比较完整的细菌基因组 DNA。由图 2 可见 ,玄武湖和莫愁湖沉积物 4 个样品的电泳条带的亮度强于太湖
3 个样品 ,说明在相同的实验条件下 ,不同湖泊沉积物中细菌基因组 DNA 的提取量是有差异的 (表 1) 。玄武
湖和莫愁湖沉积物 4 个样品中 DNA 得率较高 ,为 10μgΠg 左右 ,而太湖 3 个样品的 DNA 得率相对较低。
图 2 　不同湖泊沉积物样品基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig. 2 　Agarose gel (0. 7 %) electrophoresis of genomic DNA of different lake
sediment samples
1～7 :湖泊沉积物样品 ,下同 Lake sediment samples , the same below ;
M:Hind ш-digestedλDNA marker
表 1 　不同湖泊沉积物样品 DNA的得率和 DNA的纯度
Table 1 　The yield and purity of DNA of different lake sediment samples
湖泊沉积物样品号
Lake sediment
samples number
DNA 得率 (μgΠg 沉积
物样品) DNA yield
(μgΠg sediment samples) A260ΠA280 A260ΠA230
1 # 12163 1174 1172
2 # 11158 1167 1167
3 # 10142 1146 1134
4 # 11125 1152 1163
5 # 3194 110 1137
6 # 2187 116 1137
7 # 3105 1107 1128
　　由于沉积物样品中腐殖酸、黏土矿物以及其它离
子的存在都会不同程度地影响沉积物中微生物样品
的 DNA 的提取效率和 DNA 纯度 ,而少量的腐殖质等
杂质常常是后续 PCR 扩增的抑制剂[11～13 ] ,因此 ,在进
行 PCR 反应之前 ,必须对粗提液进行纯化。虽然沉
积物样品的基因组 DNA 经纯化后有较大损失 ,但纯
化后的基因组 DNA 样品中腐殖质等 PCR 反应抑制剂
的含量可明显降低 ,从而为后续的 PCR 反应提供了
有利条件。
从 A260ΠA280 (核酸Π蛋白) 和 A260ΠA230 (核酸Π腐殖
质) [14 ]的比值来看 ,不同地点沉积物样品中 DNA 纯度
各不相同。玄武湖和莫愁湖样品的 A260ΠA280 比值较
大 ,同时 A260ΠA230比值也较大 ,说明玄武湖和莫愁湖 4
个样品中 DNA 含量相对较高 ,而腐殖质含量相对较
低 ,具有较高的纯度。由此可见 ,采用相同方法得到
样品 DNA 的提取量和纯度受湖泊沉积物的类型、湖
泊理化性质和水体生物量丰富程度等影响。
2. 2 　基因组 DNA 的 PCR 扩增
以等量的沉积物样品纯化后的基因组 DNA 为模
板 ,采用对大多数细菌和古生菌的 16S rDNA 基因 V3
～V5 区的通用引物 ( GC2F341ΠR907 ) ,对每个湖泊沉积
物样品的基因组 DNA 进行扩增 ,在引物 F341的 5′端
添加 GC 发夹结构后 ,PCR 扩增产物将在 DGGE 电泳
胶中部分解链 ,扩增出的不同微生物 DNA 就能被完
全分离。三个湖泊沉积物的 7 个样品的基因组 DNA
的 PCR 扩增结果如图 3 所示 ,经 PCR 扩增后获得的三个湖泊沉积物样品微生物的 16S rDNA 基因片段大小约
为 626 bp ,是 16S rDNA V3～V5 区特异性片段。因此 ,采用 touchdown 降落式 PCR 扩增策略 ,提高了样品的扩
增特异性。
2. 3 　沉积物中微生物群落结构多样性
对上述各个样品的扩增产物进行 DGGE 分析 ,可以分离出数目不等、位置各异的电泳条带 ,从而能够鉴别
不同湖泊沉积物样品中微生物群落结构的差异和生物多样性。根据 DGGE 能分离长度相同而序列不同 DNA
的原理 ,每一个条带大致与群落中的一个优势菌群或操作分类单位 (Operational taxonomic unit , OTU) 相对应 ,
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图 3 　不同湖泊沉积物样品 16S rDNA 基因 PCR 扩增产物琼脂糖凝
胶电泳图谱
Fig. 3 　Agarose gel (2. 0 %) electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA
gene of different lake sediment samples
条带数越多说明生物多样性越丰富 ,条带染色后的荧光
强度则反映该细菌的丰富度 ,条带信号越亮 ,表示该种
属的数量越多。从而反映湖泊沉积物中微生物的种类
和数量。
采用凝胶图像分析系统对 DGGE 凝胶电泳的结果
分析表明 (图 4 ,图 5) ,7 个沉积物样品的 DGGE 图谱在
条带的位置和数目均有一定的差异 ,玄武湖和莫愁湖表
层沉积物中大致有 20 种优势细菌菌群 ,同一湖泊中不
同采样点 DGGE 图谱的差异性不大 ,不同城市湖泊沉积
物中细菌群落结构也具有较高的相似性。而太湖样品
的 DGGE 条带数目和条带位置与玄武湖和莫愁湖有明
显不同 ,并且太湖不同采样点样品的 DGGE 图谱的差异
性也较大 ,说明不同区域相对稳定的微生物群落结构是
不同的 ,其原因可能是由沉积物理化性质差异引起的
(表 2) 。
太湖水域宽广 ,受水文、风浪、船只航运、养殖、捕捞等自然和人类生产活动干扰非常剧烈 ,对沉积物中有
机物氧化能力较强 ,同时外源性有机物输入较少 ,因此 ,微生物群落结构相对简单 ,而玄武湖和莫愁湖沉积物
中有机物丰富 ,导致微生物群落结构复杂、多样性丰富。对于梅粱湾的 5 # 和 6 # 点而言 ,由于 5 # 点在梅
梁湾水质改善生态系统试验区内 ,相对比较靠岸 ,由于围隔的存在受风浪影响较小 ,并生长有部分水生植被 ,
因此 ,5 # 点的 DGGE 带谱条带较 6 # 点多 ,说明试验区内的微生物的群落结构比区外要丰富 ,而 7 # 贡湖湾
采样点水生植被覆盖率较高 ,有较大面积的马来眼子菜单优势种分布 ,水体透明度较高 ,水质较好[15 ] 。在有
水生植被的环境下 ,水生植物的根系不仅能抗风浪的侵扰 ,保持沉积物的相对固定 ,同时根系活动的代谢产
　　　　
图 4 　不同湖泊沉积物样品的变性梯度凝胶电泳 (DGGE)分离图谱
Fig. 4 　DGGE profile of different lake sediment samples
“▲”标记为挖胶回收条带 Major bands of 16S rDNA genes fragments were
eluted from gel of DGGE
图 5 　不同湖泊沉积物样品的变性梯度凝胶电泳 (DGGE)示意图
　Fig. 5 　DGGE sketch map of different lake sediment samples
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表 2 　不同湖泊沉积物样品的理化性质
Table 2 　The characteristic of different lake sediment samples
湖泊沉积物样品号
Lake sediment
samples number
总磷
TP
(mgΠg) 总氮TN(mgΠg) 有机质OM( %) 氧化还原电位 Eh(mv) pH
1
2
2145 11593 5164 - 39 8113
3
4
11534 11652 6129 - 48 8122
5 01208 21124 1135 - 40 7116
6 01196 11244 1140 - 44 7139
7 01152 01659 1119 11 7123物 ,也会有利于微生物的群落活动 ,因此 ,出现比较明显的特征带 ,代表该采样点沉积物中细菌的特征种属。条带荧光强度较深表明该细菌在数量上较多。因此 ,有水生植被的湖泊沉积物微生物群落丰富度比无水生植被的要高 ,但是优势种群不一定多。DGGE 图谱特征还表明 ,有 5 个左右的细菌种群在 3 个湖泊中都有分布 ,这些细菌属于生态幅比较广的基本微生物类型 ,在不同湖泊中都有存在。因此 ,这些条带的分布特征可以说明这 3 个湖泊沉积物中
既有共同的微生物种类 ,也有自己独特的微生物种
属 ,形成了各自特定生态位的群落结构。
从表 2 可见 ,玄武湖、莫愁湖与太湖理化性质有较大差异[16 ,17 ] 。玄武湖和莫愁湖有机质含量在 5 %～7 %
之间 ,而太湖有机质含量在 115 % 左右 ,有机质含量高的环境存在更多的生物种类 ,玄武湖和莫愁湖沉积物中
总磷含量、pH 值明显高于太湖 ,1 # ～6 # 点样品的氧化还原电位值相近 ,而 7 # 点氧化还原电位值偏高 ,因
此 ,沉积物环境条件的差异导致优势微生物种属发生变化 ,从而使微生物群落结构呈现较高的空间差异性。
表 3 　DGGE优势条带的基因片段序列的比对结果
Table 3 　Comparison of genomic sequences in dominant DGGE bands by sequencing and BLAST analysis
条带号
Band name
序列长度
Sequence size (bp)
Genkbank 数据库中最相近的菌种名称 (登录号)和相似性
Closest relative and alignment similarity ( %)
临时登录号
Accession
Band 1 531
Uncultured Oxalobacteraceae bacterium(AY693820) (99 %)
Uncultured marine eubacterium HstpL82 (AF159664) (99 %)
Uncultured Duganella clone CTHB218(AF067655) (99 %) 114407106822002221259940190901BLASTQ1
Band 2 581
Acinetobacter calcoaceticus subsp1anitratus (AY568492) (96 %)
Uncultured Acinetobacter sp1 (DQ394933) (96 %)
Acinetobacter baumannii (AY738400) (96 %)
11440720642193802
1502848666231BLASTQ4
Band 3 580
Bacillus sp1F26 (AF385082) (93 %)
Bacillus cereus (DQ105976) (93 %)
Bacillus cereus (DQ234855) (93 %)
11440732732116362
1886240997851BLASTQ4
Band 4 573
Bacillus pumilus (AY462205) (100 %)
Bacillus sp1IIPON1 (DQ188940) (100 %)
Bacillus sp1GSP46 (AY505514) (100 %) 11440735542305222077194703671BLASTQ4
Band 5 587
Uncultured bacterium (AY627584) (100 %)
Uncultured bacterium (AY592756) (99 %)
Paenibacillus naphthalenovorans (AF353681) (99 %)
11440742252145452
1204509130171BLASTQ1
Band 6 575
Bacillus pumilus (DQ234841) (100 %
Fuel tank bacterium S8 (AY803244) (100 %)
Bacillus sp1MI223a1 (DQ180948) (100 %) 11440746542257152659529227731BLASTQ4
Band 7 396
Brevibacillus agri (DQ166948) (100 %)
Brevibacillus sp1R212868 (AJ438305) (100 %)
Brevibacillus sp1S5211 (AF530274) (99 %) 114407504422272421236558359521BLASTQ1
2. 4 　DGGE 条带基因片段的测序分析
在 DGGE 分离后的条带中 ,选取其中 7 个荧光强度较亮的主条带进行切胶回收、重新 PCR 扩增和测序 ,
测序的结果在 GeneBank 数据库中用 BLAST 进行检索和进行同源性比较。从 DGGE 图谱中主条带的测序结
果可以确定条带所代表的菌群分类地位 ,7 条优势带的基因片段序列与 GeneBank 中细菌序列相似性如表 3
所示 ,从这些 DGGE 带谱所代表的微生物种类可以确定不同湖泊沉积物中所含细菌群落的优势菌群的组成。
一般认为 16S rDNA 序列同源性小于 98 % ,可以认为属于不同种的细菌 ,如果同源性小于 93 %～95 % ,则
可以认为属于不同的属 ,因此 ,根据序列比较结果 ,除 Band 2 和 Band 3 所代表的菌株外 ,其余 5 株细菌与数据
库中的已知细菌同源性超过 99 % ,可以认为是同一种 ,分别属于革兰氏阴性球菌属 ( Acinetobacter) 、芽孢杆菌
属 ( Bacillus)和放线菌短杆菌属 ( Brevibacillus) ,另外 ,Band 1 和 Band 5 所属菌株与数据库中目前未获得纯培养
516311 期 赵兴青 　等 :PCR2DGGE技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究 　
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的未知名的菌株之间也具有大于 99 % 的相似性。
3 　结论
(1)采用相同的分析方法得到沉积物样品 DNA 的提取量和纯度受湖泊沉积物的类型、湖泊理化性质和水
体生物量丰富程度等影响。
(2)玄武湖和莫愁湖表层沉积物中大约有 20 种优势菌群 ,且同一湖泊不同采样点 DGGE 图谱的差异性不
大 ,细菌群落结构具有较高的相似性 ,而与太湖沉积物样品的 DGGE 条带数目和位置具有明显差异性 ,且太湖
不同采样点的图谱也有较大的差异性。
(3)三个湖泊除分布约 5 个相同的细菌种群以外 ,还具有特异性的微生物种属 ,可能与沉积物的理化性质
和水生植被的影响相关。
(4)对 DGGE 图谱中 7 个主条带进行回收、扩增和测序 ,结果显示其优势菌群具有不同的序列组成 ,其中
5 个序列与 Genebank 中已登录的已知细菌的同源性 ≥99 % ,分别属于革兰氏阴性球菌属 ( Acinetobacter) 、芽孢
杆菌属 ( Bacillus)和放线菌短杆菌属 ( Brevibacillus) , 其中Band 1 和 Band 5 所属菌株与数据库中目前未获得纯
培养的未知名菌株之间也具有 99 % 以上的相似性。
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