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应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 2013，19 ( 4 ) : 643-649
2013-08-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2013.00643
收稿日期 Received: 2012-10-24 接受日期 Accepted: 2013-01-07
*国家高校博士点专项基 金（20094404110006）、国家重 点基础 研究发展计 划（2010CB126502）和广东省科 技 厅项目（2010B090400434，
2012B010300018）资助 Supported by the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (No. 20094404110006), the
National Basic Research Program of China (“973” Program, No. 2010CB126502), and the Science and Technology Program of Guangdong Province (Nos.
2010B090400434, 2012B010300018)
**通讯作者 Corresponding author (E-mail: zytan@scau.edu.cn)
青香茅和五节芒内生固氮菌的分离与生理生化鉴定*
谭志远1** 傅琴梅1 彭桂香2 原红娟1 程艳波1 江 院1
（1华南农业大学农学院 广州 510642）
（2华南农业大学资源环境学院 广州 510642）
摘 要 为研究青香茅（Cymbopogon caesius）和五节芒（Miscanthus f loridulus）内生固氮菌的多样性，基于两种无
氮培养基结合乙炔还原法从这两种牧草中分别分离到30株和36株菌. 采用SDS-PAGE（Dodecyl sulfate sodium salt -
polyacrylamide gel electrophoresis）全细胞蛋白电泳和IS-PCR（Insertion sequence-based PCR）指纹图谱将这66株内
生固氮菌聚类为10个类群（I-X，每群3株以上，共61个聚群菌株）和3个未归类小组（共5个未聚群菌株）. 从10个聚
类群和3个未归类小组中各选1株菌作为代表进行16S rDNA序列分析，发现它们与洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia
cepacia）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、固氮植物菌（Phytobacter diazotrophicus）、阿氏肠杆菌（Enterobacter
asburiae）、织片草螺菌（Herbaspirillum seropedicae）、阪崎克洛诺 菌（Cronobacter sakazakii）、水 稻肠杆菌
（Enterobacter oryzae）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、溶解肠杆菌（Enterobacter dissolvens）、无乳固氮螺
螺（Azospirillum amazonense）、都柏林克罗诺杆菌（Cronobacter dublinensis）等的相似性分别达97%以上，表明所分离
内生固氮菌多样性高. 进一步对它们进行生理生化测定，结果表明有些菌株具泌氨能力、产吲哚、解磷、解钾效果，在
农业生产上具有一定的应用潜力. 图2 表3 参38
关键词 乙炔还原法；全细胞蛋白电泳；IS-PCR；内生固氮菌；固氮酶活性；微生物多样性；青香茅；五节芒
CLC Q948.12+2.3 : Q939.11+3
Identification and Characterization of Endophytic Diazotrophs Isolated from
Cymbopogon caesius and Miscanthus floridulus*
TAN Zhiyuan1**, FU Qinmei1, PENG Guixiang2, YUAN Hongjuan1, CHENG Yanbo1 & JIANG Yuan1
(1College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)
(2College of Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)
Abstract In order to investigate the diversity of endophytic diazotrophs in Cymbopogon caesius and Miscanthu floridulus,
thirty and thirty-six isolates were obtained respectively from these two forage grasses by using two selective medium without
nitrogen sources in combination with acetylene reduction assay. The sixty-six endophytic diazotrophs were assigned to
10 groups (61 strains, at least 3 for each group from I to X) and five ungrouped strains by analysis of SDS-PAGE (dodecyl
sulfate sodium salt - polyacrylamide gel electrophoresis) patterns of whole-cell protein electrophoresis and IS-PCR (Insertion
sequence-based PCR) DNA fingerprinting. 16S rDNA sequencing analysis of representative strains of each group showed that
these strains were closely related to Burkholderia cepacia, Enterobacter cloacae, Phytobacter diazotrophicus, Enterobacter
asburiae, Herbaspirillum seropedicae, Cronobacter sakazakii, Enterobacter oryzae, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter
dissolvens, Azospirillum amazonense, and Cronobacter dublinensis, indicating the high diversity of endophytic diazotrophs
colonized in the host plants of C. caesius and M. floridulus. The results of physiological and biochemical tests showed that
some isolates had the ability of ammonia secreting, indole producing, and phosphorus and potassium dissolving, suggesting the
potential application in agricultural practices. Fig 2, Tab 3, Ref 38
Keywords acetylene reduction assay; whole-cell protein electrophoresis; insertion sequence-based PCR; endophytic
diazotrophs; nitrogenase activity; microbial diversity; Cymbopogon caesius; Miscanthus floridulus
CLC Q948.12+2.3 : Q939.11+3
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青香茅和五节芒内生固氮菌的分离与生理生化鉴定 4期
氮素是植物需求量最大的营养元素，同时也是植物个体
乃至自然生态系统和人工生态系统（包括农业生态系统）中
最常见的限制因子. 空气组分中有78%是氮气，只是绝大多数
生物不能直接利用，但是固氮微生物可以利用. 固氮微生物
有3种类型：自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌. 植物内
生固氮菌属于联合固氮菌类型. 联合固氮菌的发现和研究扩
展了经典根际联合固氮系统，开拓出一条生物固氮到其它作
物的新途径. 内生固氮菌可以在根际或植物体内进行固氮，
为植物生长提供氮素或促生长物质，有些菌可为植物（如甘
蔗）生长提供高达60%的氮素[1]. 它宿主范围广，而且在许多
植物，尤其是禾本科植物中内生固氮菌的生物多样性高，同
时内生固氮菌还可通过分泌植物生长激素等多种生理活性
物质，与病原菌竞争营养和空间，从多方面促进植物生长，
在农业生产实践中具有广阔的应用前景. 目前国内国外众多
学者对这类非豆科植物与根系联合的特殊固氮菌展开了较
广泛的研究，从 野生稻 [2]、水稻及其 根际 [3]、玉米 [4-5]、草坪
草 [6]、香根草 [7]、羊草和冰草根际[8]、菊花，月季，香石竹[9]、香
椿 [10]、燕麦 [11]、甘蔗 [12]、糖蜜草 [13]、棉花 [14]等植物上分离出大
量内生固氮菌，属、种多样性高[15-17].
测定固氮微生物的方法通常有乙炔还原法（Acetylene
reduction assay，ARA）、15N同位素稀释法、15N自然丰度法、
非同位素法、全氮差值法等，其中乙炔还原法是国际上普遍
公认的测定生物固氮活性的方法，该法具有简便、快速、灵
敏度高等优点 [18]. 固氮微生物拥有固氮酶基因，编码固氮酶
铁蛋白组分的结构基因nifH核苷酸序列具有高度的保守性，
它经常被用来从DNA分子水平上证明这些固氮菌的存在 [19].
Ueda等 [20]和Lovell等 [21]在植物固氮菌中得到了nifH基因；Zehr
等 [22]与Ohkuma等 [23]分别在海洋和白蚁微生物中得到nifH基
因. 但是也有报道指出，并不是所有的固氮微生物中均能扩
增到nifH基因片段，Loiret等 [24]只在部分固氮菌中扩增到了
nifH基因片段，表明nifH基因序列在大多数情况下虽然保守，
但也存在多样性.
青香茅（Cymbopogon caesius）和五节芒（Miscanthus
f loridulus）均为禾本科（Gramineae）多年生草本植物，是山
坡等瘠薄地的先 锋植被 . 青香茅可作各种家畜的四季牧草
（尤其是牛羊牧草），而且含青香茅油等香精油，精油用途
广泛，可用于香料、化妆品、制药和调味品等方面[25]. 五节芒
地下茎发达，丛状生长，生态适应性幅度极广，是一种具有
开发利用价值的植物，其茎及叶可为造纸原料，叶幼嫩时可
做饲料，须根粗壮发达，可做防沙固土的材料 [26]. 因此，基于
以上特征，选用青香茅、五节芒作为研究材料，应用选择性
培养基结合乙炔还原法分离这些植物中可能蕴藏的内生固氮
菌，同时对这些菌株进行生理生化测定，以期丰富内生固氮
菌的菌种资源库.
1 材料与方法
1.1 材料和培养基
青香茅、五节芒采自广州天河区岑村火炉山森林公园.
选用Döbereiner（DN）基本培养基 [27]和改良的无氮CCM培养
基（1 L）：Mannitol 5 g，Sucrose 5 g，CaCl2 · 2H2O 0.06 g（分
开灭菌），NaCl 0.1 g，Lactic acid 0.5 mL，NaMoO4 · 2H2O 2.5
mg，MgSO4 · 7H2O 0.2 g（分开灭菌），Yeast Extract 0.1 g，
KH2PO4 · H2O 0.2 g，K2HPO4 · H2O 0.8 g，Fe(3)-EDTA（0.66%）
4.0 mL；Agar 15-20 g（固体培养基）/1.5-2.0 g（半固体培养
基），用NaOH调节pH值至7.0 ± 0.2，进行内生固氮菌的分离
与筛选，具体方法参照文献[24].
1.2 菌株分离纯化和固氮酶活性测定
供试材料经表面消毒、无菌水多次洗涤后，将最后一次
洗涤液涂布LB平板，以检查消毒是否彻底 [27]. 用灭过菌的剪
刀将表面消毒完全的根、茎、叶剪碎，分别穿刺接种于pH 7.0
的Döbereiner基本培养基和改良的半固体培养基试管中，胶
塞密封后，生长3 d后向试管内注入1/10体积10%乙炔气体（终
浓度为1%），置于37 ℃、湿度为85%的培养人工培养箱内进
行培养，整个操作均在无菌条件下完成 [28]. 在注射乙炔48 h时
后用气相色谱检测固氮酶活性. 待长出单菌落后，挑取单菌
落分别接种至半固体培养基试管中，用乙炔还原法检测固氮
酶活性，再涂平板直到获得纯的菌株，最后通过镜检，革兰
氏染色，进一步观察其形态及确定纯化与否. 将检查纯化的
菌株分别保存于-80 ℃（长期保存）和-4 ℃到-20 ℃的冰箱
中（日常使用）.
将获得的纯菌株分别接种于含5 mL相应Döbereiner半固
体培养基的10 mL试管中，用反口橡胶塞密封. 37 ℃下培养24
h后，向管内注入1/10体积10%乙炔气体（使其终浓度为1%)，
同样条件培养24 h. 从管中抽取0.5 mL气体注入气象色谱仪
（北京天普分析仪器厂SP-2100）中，测定C2H2、C2H4的含量.
根据下列公式计算固氮酶活性的大小，C = hx × c × V/(24.9 ×
hs × t). 其中，hx—样品峰值；hs—标准C2H4峰值；c—标准C2H4
浓度（nmol mL-1）；V—培养容器体积（mL）；t—样品培养时
间（h）；C—产生的C2H4浓度（nmol mL
-1 h-1）.
1.3 DNA的提取
DNA小量提取方法：菌株培养至对数生长期时收集菌
体，37 ℃溶菌酶破壁30 min，再加入1.5倍体积的十二烷基肌
氨酸钠（TE溶解，5%浓度）60 ℃保温0.5 h，酚/氯仿/异戊醇
抽提，异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤，最后溶解在50 mL TE（pH
8.0）中，储存于-20 ℃冰箱中备用.
1.4 固氮酶nifH基因扩增
利用Zehr等 [22]设 计的简并引物，以正向引物Zehrf1：
5 ʹ -T GYGAYC C NA A RG C NGA-3 ʹ，反 向 引 物 Z e h r r 2：
5ʹ-NDGCCATCATYTCNCC-3ʹ扩增nifH基因片段. 反应条件
是97 ℃预变性3 min，97 ℃变性1 min，55 ℃复性50 s，72 ℃延
伸35 s，32个循环. 反应完成后，72 ℃延伸5 min.
1.5 IS-PCR指纹图谱扩增及分析
采用 Inser t ion Sequence-based PCR（IS-PCR）指 纹
图 谱 方 法，根 据 王春 连 等 的 研 究 结 果 [29]，选 用 单引物 J3
（5’-GCTCAGGTCAGGTGGCCT GG-3’）为引物，PCR反应条
件见文献[13]，反应体系总体积改为25 µL，其它条件相同. 反
应完毕，先用1.2%琼脂糖电泳初步聚类分析，将条带一致的
归为同一类群，再用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步
聚类. 通过软件GIS3.74凝胶图像处理系统进行分析，获得电
泳图谱的相似性矩阵，用TREECON软件进行UPGMA聚类.
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19卷 谭志远等
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1.6 SDS-PAGE全细胞蛋白电泳聚类分析
收集对数生长期菌株于1.5 mL预称重的离心管中，用无
菌去离子水洗涤一次，加入4倍上样缓冲液（H2O 4 mL；0.625
M Tris-HCl（pH 6.8）1 mL；glycerol 0.8 mL；10% SDS 1.6 mL；
β-mercaptoethanol 0.4 mL；1%brophenol blue 0.2 mL）裂解细
胞，使其终浓度为150 mg mL-1，放入-20 ℃冰箱中待用. 临用
前在95 ℃下加热10 min，并以8 000 r/min离心3 min.
选 择10 % 分 离 胶、5% 浓 缩 胶 进 行 SDS -聚 丙 烯 酰 胺
凝 胶（Dodecyl sulfate sodium salt - polyacrylamide gel
electrophoresis）电泳，电泳条件为60 V恒压25 min，26 mA恒
流跑完分离胶，方法参见文献[28]. 为便于比较，在IS-PCR DNA
指纹图谱聚类基础上，将DNA指纹图谱中聚在同一类群的菌株
集中在同一块胶上进行SDS-PAGE蛋白质电泳图谱分析.
1.7 16S rRNA基因序列分析
采用通用引物25f（5’-AAC TKA AGA GTT TGA TCC
TGG CTC-3’）和1492r（5’-TAC GG(C/T) TAC CTT GTT ACG
ACT T-3’）进行扩增[30]. PCR反应条件为95 ℃预变性5 min，
95 ℃变性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，共进行35个循
环，结束后72 ℃延伸5 min [31]. 将PCR产物交由深圳华大基因
科技有限公司测序. 测序所用引物为25f和1492r. 将所得序列
在GenBank数据库中进行比对（BLAST），获得相似性较高的
公开发表的模式菌株，再用软件GeneDoc进行格式转换和人
工比对，最后用TREECONW 软件采用邻近法聚类分析构建
系统发育树.
1.8 菌株生理生化鉴定
过 氧 化 氢 酶 产 生、吲 哚 试 验、甲 基 红 测 定、生 长 素
（IAA）分泌定性试验、乙酰甲基甲醇试验（V. P实验）、明胶
液化、产氨测定、NO3-还原、溶磷能力定性试验、溶钾能力定
性试验等参照赵斌与何绍江合著的《微生物学实验》[32]进行.
2 结果与分析
2.1 内生固氮菌的分离
从青香茅（C. caesius）中分离到内生菌30株，其中从茎
中分离到14株，根中分离到16株，没有从叶中分离内生固氮
菌. 从五节芒（M. floridulus）中分离到内生菌36株，其中从茎
中分离到17株，根中分离到15株，叶中分离到4株 . 各菌株的
分离来源和固氮酶活性见表1. 其中fm1、fm21和fm37的固氮
酶活性（以C2H2计）较高，高于286 nmol mL
-1 h-1；fm4、fm19、
fm25和fm61的固氮酶活性较低，低于30 nmol mL-1 h-1. 这说明
各菌株之间固氮酶活性差异较大，在对这些资源开发应用时
必须进行筛选和优化. 利用乙炔还原法筛选到66株内生固氮
菌后，在DNA分子水平上通过PCR进一步检测固氮酶nifH基
因，所有菌株均扩增出约360 bp的固氮酶nifH基因片段.
2.2 IS-PCR指纹图谱聚类分析
通过IS-PCR指纹图谱分析，可以区分种类不同细菌. 采
用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳对IS-PCR多态性指纹图
谱检测，谱型聚类结果见图1. 由图1可知，在80%的水平上将
供试66株内生固氮菌分为10个主要类群以及3个未归类小组
（共5个未聚群菌株）. 其中类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ的
菌株主要来源于五节芒，类群Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的菌株主要来源于青
香茅，3个未归类小组菌株（有5株）fm48、fm49、fm54、fm68
和fm62均来源于青香茅.
表1 五节芒和青香茅中内生固氮菌特性
Table 1 The characteristics of endophytic diazotrophs isolated from Miscanthus floridulus and Cymbopogon caesius
菌株
编号
No.
来源
Origin
培养基
Culture
medium
酶活性
Nitrogenase activity
(C2H2)
(C/nmol mL-1h-1)
菌株
编号
No.
来源
Origin
培养基
Culture
medium
酶活性
Nitrogenase activity
(C2H2)
(C/nmol mL-1h-1)
菌株
编号
No.
来源
Origin
培养基
Culture
medium
酶活性
Nitrogenase activity
(C2H2)
(C/nmol mL-1h-1)
五节芒 Miscanthus floridulus 五节芒 Miscanthus floridulus 五节芒 Miscanthus floridulus
fm1 茎 Stem CCM 297.06 fm13 茎 Stem DN 45.23 fm25 根 Root CCM 23.54
fm2 茎 Stem CCM 84.69 fm14 茎 Stem DN 121.44 fm26 根 Root CCM 155.34
fm3 茎 Stem CCM 61.45 fm15 茎 Stem DN 34.27 fm27 根 Root CCM 45.39
fm4 茎 Stem CCM 25.66 fm16 根 Root DN 153.41 fm28 根 Root CCM 35.31
fm5 茎 Stem CCM 89.56 fm17 根 Root DN 36.65 fm29 根 Root CCM 78.12
fm6 茎 Stem CCM 101.94 fm18 根 Root DN 121.45 fm30 根 Root DN 87.45
fm7 茎 Stem CCM 78.86 fm19 根 Root DN 24.34 fm31 根 Root DN 67.35
fm8 茎 Stem CCM 111.95 fm20 根 Root DN 93.43 fm32 叶 Leaf DN 115.65
fm9 茎 Stem CCM 99.61 fm21 茎 Stem DN 307.89 fm33 叶 Leaf DN 145.34
fm10 茎 Stem DN 57.49 fm22 茎 Stem DN 40.65 fm34 叶 Leaf DN 54.32
fm11 茎 Stem DN 137.31 fm23 根 Root DN 104.56 fm35 叶 Leaf DN 64.33
fm12 茎 Stem DN 30.52 fm24 根 Root DN 67.96 fm59 根 Root DN 69.21
青香茅 Cymbopogon caesius 青香茅 Cymbopogon caesius 青香茅 Cymbopogon caesius
fm36 茎 Stem DN 148.25 fm48 根 Root DN 99.76 fm58 根 Root DN 33.78
fm37 茎 Stem DN 286.85 fm49 根 Root DN 34.72 fm60 茎 Stem DN 156.31
fm38 茎 Stem DN 157.91 fm50 根 Root DN 45.32 fm61 茎 Stem DN 22.89
fm39 茎 Stem DN 191.71 fm51 根 Root DN 66.45 fm62 茎 Stem DN 68.23
fm40 茎 Stem DN 46.25 fm52 根 Root DN 134.23 fm63 茎 Stem DN 60.45
fm41 茎 Stem DN 31.2 fm53 根 Root DN 22.45 fm64 根 Root DN 99.43
fm42 茎 Stem CCM 132.91 fm54 根 Root DN 155.32 fm65 根 Root DN 126.35
fm43 茎 Stem CCM 181.92 fm55 根 Root DN 43.41 fm66 根 Root DN 47.45
fm44 茎 Stem CCM 85.7 fm56 根 Root DN 132.34 fm67 根 Root DN 86.32
fm45 茎 Stem CCM 65.81 fm57 根 Root DN 33.69 fm68 根 Root DN 133.09
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青香茅和五节芒内生固氮菌的分离与生理生化鉴定 4期
图1 66株内生固氮菌IS-PCR指纹图谱相似性
聚类图（UPGMA）
Fig. 1 Dendgram obtained by UPGMA method showing the
similarity level of IS-PCR patterns of 66 endophytic diazotrophs
2.3 SDS-PAGE全细胞蛋白电泳图谱
66株供试菌株的SDS-PAGE全细胞蛋白电泳聚类图与IS-
PCR指纹图谱聚类结果高度一致. 在10个不同类群中，各类群
内菌株的蛋白质条带具有非常高的一致性，但也有个别类群
内部的部分菌株之间存在着细微差异，但不影响聚类分群结
果.
2.4 16S rRNA基因序列分析
根据IS-PCR DNA指纹图谱和SDS-PAGE全细胞蛋白电
泳的聚类结果，挑取每一类群中代表菌株进行16S rDNA序列
测定，将测得的序列与GenBank数据库中的模式菌株序列比
较，获得与各个类群代表菌株相似性最高的已知种，结果见
表2.
类 群Ⅰ中菌 株 f m17与 Enterobac te r c loacae subsp.
dissolvens亲缘关系最近，具有98.3%的相似性，属于阴沟肠
杆菌. 类群Ⅱ的fm29与Enterobacter cloacae ATCC 13047T的关
系最近，有98.1%的相似性属于肠杆菌属. 类群Ⅲ-Ⅹ的代表菌
株fm21、fm64、fm60、fm37、fm50、fm33、fm27和fm1的16S
rDNA序列相似性菌种依次为Phytobacter diazotrophicus strain
Ls8T、Enterobacter dissolvens LMG 2683、Enterobacter oryzae
strain Ola 50、Cronobacter sakazakii Jor52、Enterobacter
cloacae E717、Herbaspirillum seropedicae X8、Enterobacter
asburiae MY2和Burkholderia cepacia ATCC 55792，其相
似性 介 于 97.2%-100%之 间 . 此 外，未归 类 的 代 表 性菌 株
fm62、fm68、fm48与Klebsiella pneumoniae k23、Cronobacter
dublinensis strain E798、Azospirillum amazonense (DSM 2787)
的相似性分别在98%以上.
表2 各类群代表菌株的16S rDNA序列分析相似性结果
Table 2 The similarity of 16S rDNA sequences of the
representative strains compared with known species
类群
Group
代表菌株
Strain
相似性最高的已知种
Similarity with known species
相似性
Similarity
(r/%)
Ⅰ fm17 Enterobacter cloacae subsp. dissolvens 98.3
Ⅱ fm29 Enterobacter cloacae ATCC 13047T 98.1
Ⅲ fm21 Phytobacter diazotrophicus strain Ls8T 98.5
Ⅵ fm64 Enterobacter dissolvens LMG 2683 98.6
Ⅴ fm60 Enterobacter oryzae strain Ola 50 98.0
Ⅵ fm37 Cronobacter sakazakii Jor52 97.2
Ⅶ fm50 Enterobacter cloacae E717 98.1
Ⅷ fm33 Herbaspirillum seropedicae X8 99.7
Ⅸ fm27 Enterobacter asburiae MY2 98.0
Ⅹ fm1 Burkholderia cepacia ATCC 55792 100.0
未归类
Ungrouped fm62 Klebsiella pneumoniae k23 99.5
未归类
Ungrouped fm68 Cronobacter dublinensis strain E798 98.7
未归类
Ungrouped fm48 Azospirillum amazonense (DSM 2787) 98.0
2.5 菌株生理生化鉴定
13个代表菌株的生理生化测定结果见表3. 所有供试菌
株都 有过氧化氢酶活性，表明这些内生固氮菌均能将 代 谢
过程产生的具有毒性的过氧化氢水解成为水和氧气，以保护
细菌不被伤害. 所有供试菌株均有硝酸盐还原和产氨能力，
说明这些菌株在 N循环中，可以将 硝酸 盐还原为亚硝酸 盐
和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物. fm21
和fm27能分 解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚；fm21、fm29、
fm37、fm50、fm68能分解葡萄糖产生丙酮酸，使培养液呈酸
性pH＜5.4，使甲基红反应呈阳性；fm17、fm21、fm27、fm29、
fm50、fm60和fm64显V. P阳性反应，表明这些菌株能使葡
萄糖分解成丙酮酸后再脱羧、氧化（在碱性溶液中）生成二
乙酰；除fm50外，其它菌株均不能使明胶液化；fm1、fm21、
fm27和fm33生长分泌生长素吲哚 -3-乙酸 （Indole-3-acetic
aci，IAA），这些生物活性物质可以促进和调节植物生长；
fm29、fm33、fm37、fm62和fm68能形成透明圈非常明显（直
径≥2 cm）的溶磷圈，说明这些菌株可以分泌出有机酸，这些
酸既能够降低pH 值，又可与铁、 铝、 钙、 镁等离子结合,
从而使难溶性磷酸盐溶解[Ca3(PO4)2]溶解；菌株fm1、fm62代
表的两个类群的菌株解钾能力非常明显（直径≥2 cm），说明
这些菌株可分泌酸性物质，并向周围的培养基中扩散，其它
菌株也具有解钾效果.
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19卷 谭志远等
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3 讨 论
菌株多样性测定结果与分离所采用的培养基成分、植物
种类、土壤类型（有机质含量影响植物根系固氮酶活性）、
C/N比、温度、湿度、和氧气分压等多种因素有关 . 在相同生
长条件下，试验中为了尽可能多地分离到多属种的内生固氮
菌，应用了两种无氮选择性培养基进行分离、纯化 . 分离的
菌株大部分来自于茎和根，极少数来自于叶部，这与其它植
物分离内生固氮菌结果 [33-34]基本一致. 从青香茅和五节芒获
图2 66株内生固氮菌全细胞蛋白电泳图谱
Fig. 2 SDS-PAGE whole-cell protein patterns of 66 endophytic diazotrophs
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青香茅和五节芒内生固氮菌的分离与生理生化鉴定 4期
得的66株内生固氮菌均扩增出nifH基因，从DNA分子水平上
证明了这些菌株的固氮特性，这与用乙炔还原法测定这些菌
株均有固氮酶活性结果一致 . 细菌蛋白质具 有高度的保守
性，很多学者利用SDS-PAGE对不同菌株进行聚类 [35-36]. 本文
研究中，IS-PCR指纹图谱聚类分析、SDS-PAGE全细胞蛋白电
泳图谱与16S rDNA序列测定的结果具有较好的一致性，聚类
结果可相互验证.
本 研 究 从两 种 植物中获得的66株内生固氮 菌聚类为
10个类群（Ⅰ-Ⅹ）和3个 未归类小组，主要归属为伯克霍尔
德菌属（Burkholderia）、肠杆菌属（Enterobacter）、植物菌
属（Phytobacter）、草螺菌属（Herbaspirillum）、克洛诺菌
属（Cronobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、固氮螺属
（Azospirillum）等7属中，反映了青香茅和五节芒内生固氮菌
资源多样性高，它们在促 进这两种先锋牧草适应瘠薄地生
长上可能起着重要作用. 这是因为内生固氮菌定殖于植物体
内部，在植物细胞内、细胞间隙、木质部导管等进行固氮作
用 [37-38]. 这个部位不仅可满足细菌生长和固氮所需的足够的
能源、低氧分压以及交换代谢产物的微环境，也避免了土壤
溶液对固氮酶活性的抑制及土著微生物的竞争，固定的氮可
直接供给植物吸收，促进植物生长.
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Molecular study of endophytic nitrogen fixing bacteria isolated from
表3 各类群代表菌株生理生化试验结果
Table 3 The physiological and biochemical properties of representative strains of each group
性状 Character fm1 fm17 fm21 fm27 fm29 fm33 fm37 fm50 fm60 fm62 fm64 fm68
H2O2酶 Catalase + ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ +
吲哚产生 Indole producing - - + + - - - - - - - -
甲基红反应 Methyl red test - - + - + - + + - - - +
IAA产生 Indole-3-acetic acid producing + - + + - + - - - - - -
V. P产生 Voges-Prokauer test - + + + + - - + + - + -
明胶液化 Gelatin liquefaction - - - - - - - + - - - -
产氨测定 Ammonia secreting + + + + + + + + + + + +
NO3-还原 Nitrate reduction ++ ++ ++ + ++ ++ + ++ ++ ++ ++ +
溶磷直径 Phosphorus dissolving (d/cm) 1.3 1.38 1.43 1.42 2.22 2.02 2.21 1.21 1.64 2.19 1.15 2.31
溶钾直径 Potassium dissolving (d/cm) 2.4 1.48 1.45 1.67 1.26 1.32 1.32 1.74 1.22 3.19 1.11 1.38
-：阴性反应；+：阳性反应 -: Negative reaction; +: Positive reaction
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19卷 谭志远等
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