全 文 ：第 26卷第 5期
20o6年 5月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vo1．26．No．5
M8y，2006
稳定性同位素探测技术在微生物生态学研究中的应用
葛 源，贺纪正 ，郑袁明，张丽梅，朱永官
(中国科学院生态环境研究中心 系统生态国家实验室，北京 100085)
摘要：稳定性同位素标记技术同分子生物学技术相结合而发展起来的稳定性同位素探测技术(stable isotope probing，SIP)，在对各
种环境中微生物群落组成进行遗传分类学鉴定的同时，可确定其在环境过程中的功能，提供复杂群落中微生物相互作用及其代
谢功能的大量信息 ，具有广阔的应用前景。其基本原理是：将原位或微宇宙(microcosm)的环境样品暴露于稳定性同位素富集的
基质中，这些样品中存在的某些微生物能够以基质中的稳定(性同位素为碳源或氮源进行物质代谢并满足其 自身生长需要，基
质中的稳定性同位素被吸收同化进入微生物体内，参与各类物质如核酸(DNA和 RNA)及磷脂脂肪酸(PLFA)等的生物合成，通
过提取、分离、纯化、分析这些微生物体内稳定性同位素标记的生物标志物，从而将微生物的组成与其功能联系起来。在介绍稳
定性同位素培养基质的选择及标记方法、合适的生物标志物的选择及提取分离方法的基础上，举例阐述了此项技术在甲基营养
菌、有机污染物降解菌、根际微生物生态、互营微生物、宏基因组学等方面的应用。
关键词：稳定性同位素探测技术；微生物生态；微生物功能；应用
文章编号：1000．0933(2006)05．1574．09 中图分类号：Q93．3；Q938．1 文献标识码：A
Stable isotope probing and its applications in microbial ecology
GE Yuan，HE Ji-Zheng’，ZHENG Yuan-Ming，ZHANG Li-Mei，ZHU Yong-Guan (State key Laboratory ofSystems Ecology，Research
CenterforEco-Environmental Sciences，ChineseAcademyof Sciences，Be~iing 100085，China)．ActaEcologica Sinica，2O06，26(5)：1574—1582．
Abstract：Stable isotope probing(SIP)，a combination of isotope labeling with molecular biological approach，is a technique that
is used to identify microorganisms in environmental samples，and at the same time，to examine microbial functions during the
biogeochemical processes operating in various environmental systems．The method has the potential for wide applications in the
future，since it can provide abundant information about microbial interactions and metabolic functions in complex communities．
Th e rationale of the SIP technique is as folows．Environmental samples in situ or in microcosm are expo sed to substrates labeled
with stable isotope s．Some microorganisms in these samples can metabolize the stable isotope -enriched substrates as their carbon or
nitrogen resource for growth．Th e stable isotope assimilated by these microorganisms is then used to synthesize celular compo nents
such as nucleic acids(DNA and RNA)and phospholipid faty acids(PLFA)．As a result，the microbial identity can be linked to
their functions by extracting and analyzing these stable isotope-labe led biomarkers in the microbial communities．Here，wi th
introduction to the range of stable isotope enriched substrates，the labeling techniques of such substrates to microorganisms，and
the selection criteria of appropriate biomarkers and the methods for extracting and analyzing the biomarkers，we ilustrate the
applications of SIP in the functional analyses of methylotrophs， bacteria of organic po lutants degradation， rhizosphere-
microorganism ecology，syntrophic microorganisms and metagenomics．
Key words：stable isotope probing；microbial ecology ；microbial function；application
基金项目：国家自然科学基金资助项目(40571082)；科技部 973课题资助项目(2005CB121105)
收稿 日期 ：2005．12．05；修订 日期 ：2006．03．17
作者简介：葛源(1977一)，男，河南南阳人，博士生，主要从事环境微生物分子生态学研究．E．mail：geyuanl9@163．com
*通讯作者 Coresponding author．E·mail：jzhe@rcees．ac．ca
Foundation item：The pmjoct was supported by National Natural Science Foundation of China(Grant No．40571082)and the National Basic Research Program of
China(Grant No．2005CB121105)
Received da te ：2005·12·05：Accepted da te ：2006-03-17
Biography：GE Yuan ，P|I．D．candidate。mainly engaged in soil microbial ecology．E·mail：geyuanl9@163．com
维普资讯 http://www.cqvip.com
5期 葛源 等：稳定性同位素探测技术在微生物生态学研究中的应用
在环境微生物生态学的研究中，如何将微生物类群与其功能联系起来，是一个倍受关注的科学问题。对
这一问题的探讨，可以丰富人们对微生物功能多样性的认识并在农业、工业、环境和医药等领域有着广泛的应
用前景。过去，人们通常采用实验室培养的方法分离并鉴定具有特定功能的微生物，但实验室可培养的微生
物只占微生物总数的0．1％～1％⋯，大量有关微生物功能的信息并不为人所知。分子生物学技术在微生物
生态学中的应用，如基于微生物群体 DNA的聚合酶链反应(PCR)、梯度凝胶电泳(DGGE／TGGE)和荧光原位杂
交(FISH)等方法，使人们对微生物遗传多样性的认识大大提高。但这样取得的结果仍难以提供有关微生物间
相互作用及其代谢功能的直接信息。近期发展起来的将稳定性同位素标记技术与分子生物学方法结合起来
的稳定性同位素探测技术(SIP)，为人们提供了解决这一问题的重要途径。
长期以来，稳定性同位素标记技术是研究全球气候变化及森林管理对土壤碳(C)、氮(N)动态影响的有力
手段，是加深对陆地生态系统重要 c、N循环过程认识的重要工具。将稳定性同位素标记技术应用于土壤生
物学研究，已经使人们在理解土壤微生物过程在调节陆地生态系统 c、N循环方面取得重大进展。随着稳定
性同位素标记技术的发展，并与分子生物学技术相结合，形成了崭新的稳定性同位素探测技术，可很好地将微
生物类群与其功能联 系起来 。近来的研究 已经确立 了一些积极参与特殊代谢过程的微生物类群 ’ 。
稳定性同位素探测技术是一系列技术的总称，包括稳定性同位素富集基质的选择、合适生物标志物的选
择 、环境样品的标记 、被标记生物标志物的提取分离和纯化检测等。其基本原理和技术路线为 ：将原位或微宇
宙 (microcosm)的环境样品暴露于稳定性同位素富集 的基质 中，这些样品中存在的某些微生物能够以基质 中的
稳定性同位素为碳源或氮源进行物质代谢并满足其自身生长需要，基质中的稳定性同位素被吸收同化进入微
生物体内，参与某些特定物质如核酸(DNA和 RNA)及磷脂脂肪酸 (PLFA)等 的合成 ，通过提取 、分离 、纯化 、分
析这些微生物体内稳定性同位素标记 的生物标志物 ，从而将微生物 的组成与其功能联 系起来(图 1)。这样 ，
不通过常规培养就能将环境中的微生物与其功能结合了起来，以加深对不同环境中微生物功能及其参与的特
定生物地球化学过程的认识。本文拟就稳定性同位素探测技术及其在环境微生物生态学研究领域的有关应
用 、优势和不足及发展动态等加 以阐述。
厂— ■] 膦脂脂肪酸l 气相色谱．燃烧．同位素 l P1 FA图谱分析
l ． l 比率质谱联用法 - f-rf_● G ．C．IRMS
L二
l ⋯ I ～ ’ 氯化铯密度梯度离心 l 同探性分析
’’，N基质L÷ l环境样品l 脱氧核糖 L _ I l l核酸 I —+
I 微阵列分析
l 暂 ； 宙 1 I =等7静鲶宓睡撒睡直“ 、l I
l l，^J日 LJ 核糖核酸 一飘 联圯 熳伸熳同 l l克隆文库及序列分析 Ii l l l l
cl0ning
。 ●
! 标记 ；
．— ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯
·
微生物功能过程
生物标志物 ；i 分离，测定目标标志物 i i ：
；； ：： 分析 !
微生物分类鉴定
图 稳定性同位素探测技术的技术路线示意图
_
稳定性同位素
原子序数(质子数)相同而质量数不同(中子数不同)的元素被称为同位素，可分为稳定性同位素和放射性
同位素。在微生物生态学研究中，也有利用放射性同位素将微生物的非培养鉴定与其代谢功能相结合的方
法，如荧光原位杂交一显微放射自显影( ． )技术和同位素阵列( )技术，通过对放射性同位素
放射活性或被放射性同位素标记的特异性生物大分子的检测，确定微生物群落中的功能活性成员 。放射性
同位素法灵敏度高，便于检测，但易造成环境危害并影响人体健康，损伤被测微生物而造成实验偏差，因而限
制了其在微生物生态学中的应用。而稳定性同位素是天然存在的不具放射性的一类同位素，可以使研究定量
维普资讯 http://www.cqvip.com
1576 生 态 学 报 26卷
化并且是在没有干扰的情况下进行的，很好地克服了放射性同位素使用过程中的上述不足。
现有的SIP实验中，多采用重稳定性同位素如 3C作为标记元素。一是由于轻、重同位素间较大的自然丰
度差异，轻同位素的丰度远远大于重同位素的丰度(表 1)；二是由于其原子量较大，由其参与合成的生物标志
物如核酸具有较大的浮力密度(buoyant density，BD)，可以通过密度梯度离心从 2C．核酸中分离出来进行后续分
析 。事实上，参与生物体内大分子如核酸、磷脂脂肪酸合成的其它稳定性同位素，赋 、 70、 So、2H均有作为
SIP实验标记元素的潜力(表 1)。尤其是 ，可用来研究氮生物地球化学循环过程的各类微生物功能群及其
相互作用 。
表 1 可用作SIP 标记物的元素及其自然丰度
Table1 Elementsthat can be appliedin SIP andtheir natur~ abundance[‘】
现有 SIP实验使用的 3C一基质主要有三大类：”C02、”c．甲基化合物(13CH4、”CH3 OH,13CH3Br~l”CH3C1)~1”C一
多碳化合物(13C．乙酸、 3C一葡萄糖、”c一咖啡因、”c一萘、 3C．菲、 3C一甲苯、 3C．苯酚、”c一丙酸盐)。 c一基质的选择，可
根据研究目的而定。”CO 多用于植物一微生物相互作用对陆地生态系统碳循环、土壤中碳周转速率、稻田产甲
烷机理及产甲烷菌的研究； 3C．甲基化合物多用于甲基营养菌(甲烷营养菌、甲醇营养菌、卤化甲烷营养菌)的
研究； 3C一多碳化合物多用于多氯联苯(PCBs)、多环芳烃(PAHs)等有机污染物的生物降解过程和机理的研究
(表 2)。
表 2 已使用过的t3C．基质及其应用
Table 2 C-substratesan d their applications
2 生物标志物 (biomarker)
在微生物生态学的SIP研究中，常采用的生物标志物有三大类：PLFA、DNA和 RNA。它们既可以指示特
定的稳定性同位素基质在生物体内的存在，又包含大量微生物分类遗传学信息n]。
SIP实验中最早使用的特异性生物标志物是 PLFA 。将 PLFA从用重稳定性同位素(如 3(=)标记过的环境
样品中提取出来，通过 PLFA图谱分析来反映微生物群落的结构和多样性；然后通过气相色谱．燃烧．同位素比
率质谱联用法( chromatograph．combustion．isotope ratio mass spectrometry，Gc_c_IRMS)测定提取出的各种 PLFA
中 3C的丰度(6 3C)，则那些 3C富集的 PLFA所代表的微生物就是参与了”c．基质代谢的微生物。利用 PLFA作
为生物标志物的不足之处在于，对于那些不可培养的微生物，我们并不知道其 PLFA分子图式 ，或者测得的某
些 PLFA分子图式并不具有特异性，因而可能无法作出正确判断 。
同 PLFA相比，DNA和 rRNA含有更丰富的信息，通过对 DNA和 rRNA的同源遗传性分析，可提供大量的
维普资讯 http://www.cqvip.com
5期 葛源 等 ：稳定性同位素探测技术在微生物生态学研究中的应用
有关微生物遗传多样性和分子生态学方面的信息 。从重稳定性同位素标记过的环境样品中提取总DNA(或
rRNA)，由于”c标记过的核酸分子的浮力密度大于未被标记过的核酸分子，可通过 CsC1(或三氟乙酸铯，
CsTFA)密度梯度离心将两者分开，并通过注射器吸取或分馏法将之分别收集起来作进一步研究。。℃．核酸分
子(DNA和 rRNA)可用作 PCR(或反转录PCR)的模板，采用一般的引物即可扩增大多数已知细菌、古菌、真菌
的 rRNA(或 cDNA)基因。对 rRNA(或 cDNA)基因 PCR产物的同源性分析，可以使我们确定哪些微生物同化吸
收了。℃．基质 ’ ’ ’“ 。同时，对那些研究较深入的微生物如甲基营养菌，一些编码甲醇和甲烷氧化酶的基因
已经被人们所了解，除了定位 16S rRNA基因外，还可对定位功能基因进行分析 。以 DNA作为生物标志
物的主要不足是”c进入 DNA合成和 DNA复制需要较长 的时间 ，因此在密度梯度 中形成 紫外光下可见的。℃．
DNA条带所需要的培养时间较长。这样就产生了两个 问题 ：一是。℃．基质消耗量 的增加 ，而这些 。℃．基质往往
比较昂贵，进而增加实验成本；二是在较长时间培养条件下，。℃．基质初级消费者可能被其它生物取食或死亡
后残体被其它微生物分解，使一些 c．基质转移到其它微生物体内，引起实验偏差。而 RNA的合成要比DNA
的合成快得多，从而能够在较短的培养时间内取得足够量的”c对于 DNA．SIP实验中长达几十天的培养时间，
RNA．SIP培养 8h后即可收集足够量的 RNA进行分析 。不过，在最近进行的DNA．SIP研究中，已经将培养时
间缩短，并收集到。3C．DNA进行研究 ’ ’ 。例如，Singleton等对 PAHs降解菌的研究表明，实验期 内(7d)基
本上不会发生”C．基质的二级利用问题-一 。
将 RNA．SIP和 DNA．SIP结合起来，会大大提升这项技术的潜力。Lueders等的研究是将这两项技术结合
使用的一个很好 的例子。他们分析了水稻土表层样 品微宇宙中功能微生物群在 42d内对。℃H3OH中碳同位素
的吸收情况 。RNA．SIP由于其独特的灵敏性，可以在只有少量的 c OH被代谢时，就监测到微宇宙中最
先起作用的甲基营养种群，而 DNA．SIP则用于深入 了解参与 甲醇代谢 的微生物群落在培养期间内的动态及其
与微食物网中真菌和原生动物 的相互作用 。 c富集 的核酸片断测序结果表明，。℃也在真菌 和原生动物 DNA
中富集，表明它们或者同化吸收了”c OH或。3CH，OH代谢产物，或者捕食了被标记过的甲基营养菌 。¨。。这些
基于 SIP的时间序列实验有可能获得关于环境 中微生物相互作用 以及微食物 网的有用信息 。核酸．SIP是
一 项有力的技术手段，并且随着轻 、重核酸纯化和分离技术的发展，其应用也将 日益广阔 。
3 标记方法
在微生物生态学的 SIP研究 中，对 目的微生物的标记方法主要有二大类 ：直接用”c．基质培养微生物和通
过用。℃O，标记植物而标记微生物。所谓微生物直接标记法就是将环境样品直接暴露于重稳定性同位素富集
的基质中，以考查那些可直接 以这些基质作为碳源和氮源满足 自身生长需要的微 生物类群。可使用气态、液
态和固态的重稳定性同位素标记的基质，包括用”c．甲基化合物对各类甲基营养菌的研究 ’ 和用。℃．多碳
有机化合物对 PAHs、PCBs等持久性有机污染物(POPs)分解菌的研究 ”删 。植物(间接)标记法多用于根际
微生物生态学研究，特别是用于追踪碳在植物．微生物．土壤体系中的流动，以评价环境条件对碳流的影响，并
确定此过程中的关键微生物功能种群 ’ 。这类标记多使用气态的。3co 作为标记基质。植物会将地上部分
(茎叶)的光合碳同化产物传输到地下部分(根部)，一部分还会以根分泌物的形式从根部释放 出来 ，为根际微
生物所吸收同化并影响根际微生物群落结构 ’ 。因此研究者就可将植物作为对某些微生物进行标记的媒
介，先将植物暴露于重稳定性同位素富集的。℃O 基质中，使植物通过光合作用吸收。℃O 产生的同化产物的一
部分从地上部转移到地下部再分泌到根际土壤中，那些参与。℃．根分泌物代谢的微生物的分类学、功能、多样
性等生态学特征就可通过对这些微生物特定的生物标志物如 PLFA、DNA或 RNA的分析而获得。图 2是陆雅
海和 Conrad利用”CO，作为标记基质对水稻根际产甲烷古菌进行研究时所采用的微宇宙示意图b 。采用这一
植物间接标记法的潜在不足是，对细菌核酸的标记可能是无效的，因为根际微生物只能利用植物新产生同化
产物的6％，并且这部分被利用的同化产物也只有约三分之一会以生物量碳的形式在微生物体内贮存，其余
部分则通过呼吸作用消耗掉 ，从而难 以追踪到从植物到根际微生物的”c流 。
不论是采用微生物标记法还是植物标记法，均可以是原位标记n 或“培养”标记D’”]。原位标记就
维普资讯 http://www.cqvip.com
1578 生 态 学 报 26卷
是在野外 自然环境条件下用气态、液态或固态的重稳定
性同位素基质标记环境样品中的微生物类群，从而在纯
自然条件下将某种微生物与特定的生物地球化学过程
和功能过程相联系。“培养”标记则是在尽量模拟自然
环境条件的微宇宙中，将环境样品暴露于特定的重稳定
性同位素富集的基质，从而对参与重稳定性同位素基质
转化的微生物群落进行标记。在微宇宙中对环境样品
进行培养标记，可控制培养条件并避免重稳定性同位素
基质流失 ，有利于定量化研究功能微生物对特定基质 的
降解机理及不同功能种群之间的生态关系和功能地位，
但可能会 与真实环境条件下 的特定生物地球化学过程
存在差距。而采用原位标记，则有可能因为复杂环境条
件下的多种影响因素而掩盖特定微生物功能种群与特
定过程之间的真实关系。研究者可根据自身的研究 目
的进行选择或结合起来使用。
4 应 用
4．1 甲基营养菌
SIP技术最早在对甲基营养菌(甲烷营养菌和甲醇
营养菌)的研究 中得到应用 ， 。此类 细菌 以甲烷 、卤
化甲烷和甲醇等单碳化合物为唯一碳源，因此在”c．基
质培养过程 中，可有效防止吸收人体 内的”c被环境中
其它 c一基质稀释，采用 SIP技术对其进行研究具有天
然的优势 ’刮。
Boschker等最先使用 PLFA—SIP技术进行 甲烷营养
图 2 植物标记法微宇宙示意 图_3
Fig．2 Schematic diagram of microcosm applied in stable isotope labeling
through plants[ ]
根袋内装有 6Og(干基)水稻土，网眼大小为 24“m，保证营养物质可自
由交换而根不能伸出根袋，根袋内土壤定义为根际土；上部气室容
量为 10L，7d标记期内，每天通过注射器分 7次注入纯度为 99％的
3CO2共 35ml。The rot bag containing 60 g(dw)of paddy soil had a mesh
size of 24 ,am，which allowed the nutrients passing freely while roots were
prevented from penetrating out from the root bag；The soil inside the root bng
was defined as rhizosphere soil．For C labeling，a 10 L chamber was placed
on the top ofthe pl~ts，35 m1 of 3c02(99％ of 3c atom)was injected into
the chamber at a frequency of 7 times a day and a pe riod of 7 days
菌的研究 。随后，DNA—SIP技术被用于研究土壤中甲烷氧化菌的功能活性种群 。Hutchens等在微宇宙中
用”c一甲烷对取 自罗马尼亚 Movi|e Cave地下水系统的样品进行短期培养(10d)，提取总 DNA并分离出”C—DNA，
通过 16S rRNA分析和功能基因(编码甲烷单氧化酶 MMO的基因)分析，确定了三类甲烷营养菌。这三类甲烷
营养菌均含有编码 MMO的基因，而在非 甲烷营养菌(不含有 编码 MMO的基因)中也发现有”C．DNA，表明了交
叉取食的存在，并推测可能正是由于甲烷营养菌将甲烷转化成复杂的有机化合物，从而维持了 Movile Cave这
样封闭生态系统的微生物群落多样性u 。
Radajewski等最先使用 DNA．SIP技术进行 甲醇营养菌的研究 j。他们用”CH OH培养森林土壤 ，并通过气
相色谱检测”cH3OH的消耗量。当消耗掉 2．4mmol基质时，从土壤中分离总 DNA并进行 CsC1密度梯度离心，
采用对细菌、古菌和真菌 rRNA基因及 mxaF基因(编码一组甲醇脱氢酶的基因)具有特异性的引物，以分离出
的”C—DNA作为模板进行 PCR。对 PCR产物的分析表明，被”c标记的细菌 16S rRNA基因序列与已知可培养的
甲醇营养菌相似，并且与从北部泥炭湿地分离到的嗜酸甲烷氧化菌相似，首次表明此类细菌还存在于森林土
壤中 ]。Ginige等的研究表明了SIP与其它技术结合所产生的巨大潜力 引。在他们的研究中，被”cH3OH标记
过的 DNA被用作模板进行 16S rRNA的PCR扩增，与甲醇营养菌 Methylophilales密切相关的 16S rRNA序列在
”C．DNA中具有较高的丰度，用这些序列数据设计 FISH探针进行荧光原位杂交的研究结果表明，活性污泥微
生物群落的反硝化能力与 SIP实验鉴定到的甲醇营养菌的丰度呈显著相关，反而与一些已知的反硝化细菌的
丰度无相关性 ，结合显微放射自显影技术，认定 SIP实验中所鉴定到的甲醇营养菌 Methylophilales同时也是活
性污泥中重要的反硝化菌。鹆J。
维普资讯 http://www.cqvip.com
5期 葛源 等：稳定性同位素探测技术在微生物生态学研究中的应用 1579
MiHer等用 3CH，Br和 3CH，C1培养土壤，并对提取的 3C．DNA进行 16S rRNA基因和 cmuA基因(编码催化卤
化甲烷降解第一步反应的甲基转移酶的基因)分析，发现了新的卤化甲烷营养菌(以前并不认为其参与卤化甲
烷降解) 引。Borodina等用 DNA．SIP和功能基因 cmuA考查英国不同陆地生态系统土壤中氯化甲烷营养菌的
多样性，通过与培养分离法的结果比较，揭示出土壤中仍存在大量不可培养的卤化甲烷营养菌，这样，就将卤
化甲烷的全球循环同一组 目前所知有限的细菌(卤化甲烷营养菌)特征群联系了起来 ¨。
4．2 有机污染物降解菌
在有机污染物生物降解的微生物生态学研究中，使用 SIP技术可以帮助了解在复杂环境如土壤中，是哪
些微生物参与了有机污染物的降解，以及微生物间复杂的相互作用是如何影响有机污染物生物降解过程
的[圳。
此类研究包括对可降解苯酚[5]、PAHs[】 ’ 和 PCBs 等有机污染物的微生物种群的研究。Jeon等和
Padmanabhan等使用原位 SIP技术，分别在受到萘污染和未受萘污染的土壤中发现了新的可降解”c一萘的微生
物种群 引。Singleton等使用 SIP技术，研究了用于处理 PAHs污染土壤的好氧生物反应器中的活性微生物
种群l】 。 3C ．水杨酸 、[u． 3C]．萘和[u． 3C]．菲被添加到此反应器 中，分别培养 2d(水杨酸和萘 )和 7d(萘和菲)
后，提取总 DNA，CsC1密度梯度离心分离轻、重组 DNA，通过对 3C．DNA的 DGGE和 16S rRNA克隆文库分析表
明，可降解 3C 一水杨酸、[u． 3C]．萘的活性种群表现出相似的 DGGE特征，并且其 16S rRNA克隆文库主要由
Pseudomonas属和Ralstonia属的序列构成；而暴露于[u．”c]．菲的微生物群落则显示出明显不同的 DGGE特征，
其 16S rRNA克隆文库由与 Acidovorax属相关 的序列组成 。Tilmann等设计了一个 PLFA—SIP微宇宙实验 ，将
来 自沼泽地的 PCBs高污染土壤暴露于[u． 3C]．2，2-二氯联苯中，培养 5周后，采用气相色谱．燃烧．同位素比率
质谱 联用法(GC．C．IRMS)测定不 同 PLFA”C的丰度 ，结果 表明，”c在特征指示 Burkholderia菌 的 PLFA(16：0，
17：0cyclo~o7c，18：10％，19：0cyclo~o8c)中大量富集 ，而在数量最多 的 Methylobacterium菌的特征 PLFA(18：lo7)
中，只有少量的”c富集，说明了 Burkholderia菌在高度污染土壤 PCBs好氧降解过程中的主导作用 ]。
4．3 根际微生物生态
SIP的另一个重要应用是根际微生物生态的研究。根际是土壤 中植物根周围的生物活性区域 ，在这一区
域发生着许多重要而复杂的植物一微生物．微动物相互作用，但许多过程和机制尚不清楚。研究这些相互作用
的方法之一是用 3CO 标记植物 ，然后从根际土壤 中提取 PLFA[2 、核酸b· 等生物标志物进行分析。提取 的
PLFA可通过 GC．C．IRMS测定其不同类型中 3C的相对丰度，进而考查 c流在根际微生物区系中的分配情况，确
定关键功能微生物类群。Butler等和 Lu等较早将 PLFA．SIP技术用 于根际微生物生态研究 。Butler等采
用 3C0 脉冲标记法，利用’3C．PLFA图谱分析研究了与根际碳循环有关的微生物在黑麦草不同生长时期的群落
动态 ]。Lu等用”CO，对水稻进行脉冲标记，通过 3C．PLFA图谱分析探讨”c在水稻根际微生物群落中的分配，
表明不同根际微生物对植物光合作用产物有不同的吸收特征b 。Johnson等利用 CO 原位脉冲标记法，研究
了土壤中食真菌无脊椎动物(弹尾 目昆虫 Protaphorura armata)对草原植物地上部光合作用产物通过根系分泌
后在菌根圈(mycorhizosphere)中流动过程的影响 。他们分别采用 IRMS和 GC．C．IRMS法测定了”c标记前后
根际周围菌根圈呼吸产生的 3CO 以及菌根圈分离出的不同类型 PLFA的”c丰度。’3CO 的测定表明，标记前，
P．armata存在和不存在时，根际周围 3CO，的丰度并无显著差异；而标记后，P．armata存在时由菌根圈呼吸
产生的 3CO，的丰度增加量(atom excess％ ’3C)比其不存在时减少了32％，两者之间有显著性差异。这反映出c
流进入菌根圈的路径被打乱。PLFA的 3C丰度测定表明，P．armata不存在时 3C．PLFA(16：loJ5)在菌根圈中显
著富集，而 P．armata存在时这种 PLFA并未显著富集。由于 PLFA(16：loJ5)是一种特异的反映环境中丛枝菌
根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)存在的磷脂p-,月日p-,肪酸，这就表明食真菌无脊椎动物 P．armata的加人引
起的菌根圈呼吸产生的 3CO，增加量的减少，主要是由于 P．armata的取食及其它活动对 AMF菌丝(光合碳同
化产物由植物根系进入土壤的通道)而不是腐生真菌菌丝的破坏而产生的 。
维普资讯 http://www.cqvip.com
生 态 学 报 26卷
从土壤中分离的”C．DNA(或 ℃一RNA)可用作 PCR(或反转录 PCR)的模板进行扩增，扩增产物通过克隆文
库、DGGE／TGGE／T—RFLP或微阵列(mieroaray)进行 16S rRNA基因或功能基因的遗传多样性和同源性分析，这
样就可获得参与植物根分泌物中碳代谢的微生物种群的信息。Lu和 Conrad将在微宇宙中生长的水稻暴露在
大气浓度的”CO 中，从根际土壤中提取总 RNA，密度梯度离心分离 ℃．RNA和 2C．RNA后，采用专性古菌引物
Arl09f／Argl2rt进行荧光定量 PCR扩增，进行终端限制性片段长度多态性(T．RFLP)分析，结果表明，”Cp的终
端限制性片段(T-RF)中富集，表明是 394．bp的T—RF所对应的微生物菌群同化吸收了通过水稻进入土壤的
℃。进一步的轻组(LrhA)和重组(HrhA)克隆文库 同源性的分析表明，这两个文库的最大不同在于一组产甲
烷古菌 (Rice Cluster I，RC—I)在 HrhA中的丰度 (26％)远大于在 Lr}lA中的丰度 (8％)；RNA序列分析表明，394．
bp的T-RF正好与 RC-I古菌相对应，这就证明了正是这组古菌 RC．I利用流经植物体内进入根际的 ℃产生了
甲烷 。Rangel-Castro等利用 RNA．SIP检验施用石灰对参与根分泌物代谢的根际微生物群落结构的影响 。
他们在英国丘陵草原土壤中成功实施了 ℃O 脉冲标记野外实验，并通过 CsTFA密度梯度离心分离出 ℃．RNA，
通过对分离出的”C-RNA的 DGGE分析表明，同不施石灰的土壤相比，施用石灰土壤中可利用根分泌物的微生
物群落结构更为复杂，并且更倾向于利用新产生的”C．根分泌物n 。
4．4 互营微生物
SIP技术另一有应用潜力的领域是对厌氧环境中互营微生物的研究。微生物间的互营关系，是指一种微
生物的生长依赖或得益于与它一起生长的另一种微生物所创造的环境条件或提供的生长物质。将 FISH与二
级离子质谱法(secondary ion I／laSS spectrometry，SIMS)相结合 ，Orphan等在冰冷的缺氧沉积物 中检测到极低 的 ℃．
甲烷自然丰度(同其它含碳化合物相比)，这表明这些沉积物中存在一组与 Methanosarcinales相关的可氧化甲
烷的古菌，这些古菌与硫酸还原菌形成共生体，参与甲烷的厌氧氧化 。丙酸盐是许多有机物厌氧降解的关
键 中间产物 ，其在厌氧条件下进一步降解为乙酸 、Co2和 H 是一个高度吸热的过程 ，但是当环境 中互营的丙
酸盐氧化产乙酸菌和耗氢产甲烷菌(使环境中保持较低的 H 分压)同时存在时，可使这一微生物参与的过程
轻易突破环境热动力学条件的限制而得以持续进行口 。但是，由于对环境条件要求苛刻，互营丙酸盐氧化产
乙酸菌分离培养的难度较大；并且由于其同源性不强，在系统发育树上的位置比较分散，缺乏合适的分子标志
物去检测此类细菌，因此互营丙酸盐氧化产乙酸菌的生态和多样性特征很少为人们所了解。Lueders等将 ℃．
丙酸盐加入厌氧水稻土样品中，7周后通过对提取分离的 ℃．RNA的 T．RFLP和克隆分析表明， ℃在 3类细菌
( t 幻60cer spp．、Smhhela spp．和 Pelotomaculum spp．)和三类古菌(Methanobacterium、Methanosarcina spp．和
一 组尚未培养的“Rice Cluster I”)的 rRNA中富集，说明上述细菌是参与产甲烷条件下丙酸盐互营氧化的活性
微生物，而古菌则通过与细菌的互营联系推动了这一过程 。使用 SIP技术，可以帮助研究者弄清热动力学
条件限制下生长的微生物功能群及互营菌的同源多样性 ，在探讨环境中微生物的互营或其它形式的营养关系
进而探讨微生物群落的结构．功能关系方面具有广阔的应用前景。
4．5 宏基因组学 (Metagenomics or eeogenomies)
宏基因组学，或者叫微生物群落的非培养基因组学，是一个 日益发展的新领域，使人们可以更好地认识不
可培养微生物的遗传多样性及其与环境之间的关系 ，并且有广阔的应用前景 ，已经有从土壤口 、海
水∞。 和酸性矿水 中构建宏基因组文库的成功例子。
要从由复杂群落构建的宏基因组文库中找到特定的目的基因，需要筛选和测序成千上万的克隆。通过
SIP实验使参与特定代谢过程(例如甲烷氧化)的生物基因组富集，克隆从 SIP实验中获得的 ℃标记的核酸，从
而构建一个因吸收了特定的基质而在特定的环境过程中执行特定代谢功能的环境微生物的功能宏基因组文
库，就可重建一个较小的目标微生物群基因组，从而极大地减少需要筛选的基因克隆数量 。如 Radajewski
等在对甲醇营养菌的研究中，根据 PCR扩增所用引物的不同，利用 ℃．DNA扩增产物构建了两个分别包括 100
个克隆(细菌 16S rRNA)和 5O个克隆(mxaF)的文库 。Lu和 Conrad在对水稻根际产甲烷菌的研究中，以
pGEM．T为载体构建了轻／重两个 RNA克隆文库 Lr}lA和 HrhA 。他们都是先将分离出的 ℃．核酸进行 PCR扩
维普资讯 http://www.cqvip.com
5期 葛源 等 ：稳定性同位素探测技术在微生物生态学研究中的应用
增，再构建克隆文库。同时也可直接利用分离出的”c一核酸直接构建克隆文库，例如 Dumont等在一个验证性
实验中，利用从”c H4标记的森林土壤样品中提取纯化的”C—DNA，用限制性酶切割后插入细菌人工染色体
(BAC)载体，构建了一个中型的包括2300个克隆的宏基因组文库；通过与 pmoA基因杂交对文库进行筛选，对
其中一个可与探针杂交的 BAC克隆的测序分析表明，其序列大小为 15．2kb，包含一个完整的pMMO基因操纵
子和几个侧翼基因(编码一些在单碳化合物上生长所必须的酶的基因)[4 3。这表明，通过 SIP实验直接克隆
”C—DNA，以及在一个较小的克隆文库中获取目的基因也是可行的。
5 问题与展望
使用 SIP技术存在的主要问题是：(1)对于多碳源利用方式的微生物，用来标记的”c在细胞内会被稀释，
但现在仍不清楚要有多少”c被引入微生物体内才能从复杂群落中将”C—DNA分离出来；(2)大多数 SIP实验在
微宇宙中进行，因此并不能完全代表微生物生长的实际环境条件；(3)在培养过程中可能存在交叉取食的风
险，即通过取食或目标微生物死体的分解而使”c转移到其它微生物体内 ]。当然，正如在前面所谈到的，最近
的一些 SIP实验已通过优化培养条件和分离技术 、缩短培养时间等手段 ，以减少上述不利因素 的影响。关于
交叉取食问题 ，一些研究者也从另一种思路通过在培养过程 中的多次取样 ，以及 DNA—SIP和 RNA—SIP的联合
使用，追踪”c在微生物群落中的流动过程，及微生物群落的结构演替和功能演替，化不利为有利。
SIP是一项具有重要应用前景的技术，已在根际微生物生态学、环境微生物生态学、甲基营养菌群落研究
等领域得到应用，提供了许多关于微生物多样性和功能的有用信息。因其在微生物的种类鉴定和功能鉴定间
建立了直接 的联系，将来会在功能宏基因组学 、厌氧环境中互营微生物生态学 、确定参与重要地球化学循环过
程 的关键微生物功能种群 、及人体肠道内微生物群落生态学等方面得到更广阔的应用。
References：
Dafis K E R，Joseph S J，Janssen P H．Efects of growth medium，inoculum size，and incubation time on cuhurability and isolation of soil bacteria．
Applied and Environmental Microbiology，2005，71(2)：826—834．
Radajewski S，Ineson P，Parekh N R，et a1．Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology．Nature，2000，403(6770)：646—649．
Lu Y．Conrad R．In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere．Science，2005，309(5737)：1088—1090．
Dumont M G．MureH J C．Stable isotope probing-linking microbial identity to function．Nature Reviews Microbiology，2005，3(6)：499～504．
Manefield M，Whiteley A S，Griffiths R I，et a1．RNA stable isotope probing，a novel means of linking microbial community function to phylogeny．
Applied and Environmental Microbiology，2002，68(11)：5367—5373．
Radajewski S，McDonald I R，Murel J C．Stable-isotope probing of nucleic acids：a window to the function of uncultured microorganisms．Curent Opinion
in Biotechnology，2003，14(3)：296—302．
Manefield M，Whiteley A S，Bailey M J．What can stable isotope probing do for bioremediation?International Biedeterioration& Biedegradation，2004，54
(2．3)：163—166．
Boschker H T S，Nold S C，Wellsbury P，et a1．Direct linking of microbial populations to spe cific biogeochemical processes by”C-labelling of biomarkers．
Nature，1998，392(6678)：801—805．
Singer A C，Thompson I P，Bailey M J．The tritrophic trinity：a source of pollutant-degrading enzymes and its implications for phytoremediation．Current
Opinion in Microbiology，2004，7(3)：239—244．
Lueders T，Wagner B，Claus P， et a1．Stab le isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community an d trophic interactions with
funsi and protozoa in oxic rice field soil．Environmental Microbiology，2004，6(1)：60—72．
Rangel—Castro J I，Killham K，Ostle N，et a1．Stable isotope probing analysis of the influence of liming on root exudate utilization by soil microrganisms ．
Environmental Microbiology，2005，7(6)：828—838．
Hutchens E，Radajewski S，Dumont M G，et ．Analysis of methanotrophic bacteria in Movile Cave by stable isotope probing．Environmental
Microbiology，2004，6(2)：111—120．
Miller L G ，Warner K L，Baesman S M ，et a1．Degradation of methyl bromide and methyl chloride in soil mi crocosms ：use of stable C isotope fractionation
and stable isotope probing to identify reactions and the responsible microrganisms ．Geochimca et Cosmochimca Acta，2004，68(15)：3271～3283．
Boredina E，Cox M J，McDonald I R，et a1．Use of DNA—stable isotope probing and functional gene probes to investigate the diversity of methyl chloride—
utilizing bacteria in soil．Environmental Microbiology，2005，7(9)：1318—1328．
； i ] ] ] ] ] ] ] ] r= 纠 ¨ ⋯ 川
； } [ [ [ [ [ [ [ [
维普资讯 http://www.cqvip.com
l582 生 态 学 报 26卷
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
[20]
[21]
[22]
[23]
[24]
[25]
[26]
[27]
[28]
[29]
[30]
[31]
[32]
[33]
34
35
36
37
[38]
[39]
[40]
Lin J—L，Rndajewski S，Eshinimaev B T，et ．Molecular diversity of methanotrophs in Transbaikal soda lake 8edimen乜and identifcation of potentialy
active populations by stable isotope probing．Environmental Microbiology，2OO4，6(10)：1049—1060．
Singleton D R，PoweH S N，Sangaiah R，et 02 ．Stable—isotope probing of bacteria capable of dngr~ ng salicylate，naphthalene，or phenanthrene in a
bioreactor treating contaminated soil．Apphed and Environmental Microbiology，2005，71(3)：1202～1209．
LuedersT，ManefeldM，FriedrichM W ．Enhanced sensitivity ofDNA—and rRNA—based stableisotope probing byfractionationand quantitative analysis of
isopycnic eentrifugation gradients．Environmental Microbiology，2OO4，6(1)：73～78．
Jeon C 0，Park W ，Padmanabhan P，et 02 ．Discovery of a bacterium，with distinctive dioxygenasc，that is responsible for in situ biodegradation in
contaminated sediment．Proceedings of the National Academy of Sciences 0f the United States of America。2003。100(23)：13591～13596．
Pedmanabhan P，Padmanabhan S，DeRito C，et ．Respirationof ℃一labeled sub6trates added tosoilinthefeldand subsequent16S rRNA gene analysis
0f 3c—labeled soil DNA
． Applied and Environmental Microbiology，2003，69(3)：1614—1622．
Tilmann S， Il C，Timmls K N，et 02．Stableisotope probing reveals the dominant role of BurkhoMer／a species in aerobic degradation ofPCBs．FEMS
Microbiology Ecology，2005，52(2)：207～217．
Treonis A M，Ostle N J，Stott A W ，et 02．Identifcation of groups of metabolically·active rhizosphere microorganisms by stable isotope probing of PLFAs．
Soil Biology and Biochemistry，2OO4，36(3)：533～537．
Wardh D A。Bardgett R D，Klironomos J N， 02．Ecologicallinkages between aboveground and belowground biota．Science，2OO4，304(5677)：1629～
1633．
Johnson D，IJdo M，Genney D R，et 02 ．How do plants regulate the function，community structuro，and diversity of mycorrhizal fungi?Journal of
Experimental Botany，2005，56(417)：1751～1760．
Grifiths R I，Manefield M，Ostle N，et 02． 3C02 pulse labelling of plants in tandem with stable isotope probing：methodological considerations for
examinng microbial function in the rhizosphere．Journal ofMicrobiological Methods，2004，58(1)：119—129．
Johnson D，Krsek M，Welington E M H，et a1．Soil invertebrates disrupt carbon flow through funs~networks．Science，2005，309(5737)：1047．
McDonald I R，Radajewski S。Murrel J C．Stable isotope probing of nucleic acids in methanotrophs and methylotropba：A review．Or~ dc Geochemistry，
2005，36(5)：779—787．
Bul I D，Parolda N R，Hal G H，et 02．Detection and classifcation of atmospheric methane oxidizing bacteria in soil．Nature，2OOO，405(6783)：175～
178．
Ginige M P， Hugenh oltz P， Daims H， et ． Use of stable·isotope probing， fuU·cycle rRNA analysis， and fluorescence situ hybridization·
microautorediography to study a methanol·f甜 denitifying microbial community．Applied and Environmental Microbiology，2004，70(1)：588—596．
Waekett L P．Stable isotope probing in biodegradation research．Trends in Biotechnology，2004，22(4)：153—154．
Butler J L，Williams M A，Bottomley P J，et ．Microbial com unity dynamics associated with rhizosphere carbon flow．Applied and Environmental
Microbiology，2003。69(11)：6793～6800．
hl Y。Murase J，Watanabe A。et ．Linking microbial com unity dynamics to rhizosphere carbon flow in a wetland rice soil．FEMS Microbiology Ecology ，
2004。48(2)：179—186．
Orphan V J，House C H。Hinrichs K·U，et ．Methane·consuming archaea revealed by directly coupled isotopic and phylogenetic analysis．Science，2001，
293(5529)：484～487．
Lueders T，Pom erenke B，Ftiedtich M W ．Stable—isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits：syntrophic propionate oxidation in
flooded soil．Applied and Environmental Microbiology，2004，70(10)：5778—5786．
Daniel R．Themetagenomics of soil．Nature BedewsMicrobiology，2005，3(6)：470—478．
Tringe S G，yon Meting C。Kobayashi A，et ．Comparative metagenomics of microbial communities．Science，2005，308(5721)：554～557．
Lorenz P，Eck J．Metagenomics and industrial applications．Nature Reviews Microbiology．2005，3(6)：510～516．
Rondon M R，August P R，Bettermann A D，et ．Cloning the soil metagenome：a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured
microorganism ．Applied and Environmental Microbiology．2000，66(6)：2541～2547．
Venter J C，Remington K，Heidelberg J F，et ．Environmental genome shotgun sequencing of the Sar{rass0 Sea．Science。2004。304(5667)：66～74．
Tyson G W，Chapman J，Hugenhohz P，et ．Com unity structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment．
Nature，2004。428：37～43．
Wellington E M，Berry A，Krsek M．Resolving functional diversity in relation to microbial com unity structure in soil：exploiting genomi cs and stable
isotope probing．Curent Opinion in Microbiology，2003，6(3)：295—301．
维普资讯 http://www.cqvip.com