全 文 ：第 25卷第 10期
2005年 10月
生 态 学 报
ACTAECOLOGICASINICA
Vol.25,No.10
Oct.,2005
铁限制条件下东海原甲藻分泌铁载体
王颜萍1,何 鹰2,郑晓玲2*,陈发荣2,李瑞香2,LeeFrankSC2,王小如2
(1.厦门大学 化学化工学院 现代分析科学教育部重点实验室,厦门 361005;2.国家海洋局 第一海洋研究所,青岛 266061)
基金项目:国家高技术研究发展计划资助项目(2001AA635040);国家海洋局青年基金资助项目(2005102);国家重点基础研究发展规划资助项
目(2001CB409702);青岛市科技将材计划资助项目
收稿日期:2004-08-26;修订日期:2005-04-21
作者简介:王颜萍(1978～),女,山东德州人,硕士生,主要从事海洋科学研究.
*通讯作者 Authorforcorrespondence.E-mail:heying@fio.org.cn
Foundationitem:TheNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(No.2001AA635040);YouthFoundationofState
OceanicAdministration(No.2005102);NationalKeyBasicResearchProgram(No.2001CB409702);ProjectofQingdaoGovernment(Jiangcai
plan)
Receiveddate:2004-08-26;Accepteddate:2005-04-21
Biography:WANGYan-Ping,Mastercandidate,mainlyengagedinmarinescience.
摘要:在铁限制条件下,进行东海原甲藻分泌铁载体的动态研究。对藻类在富铁与缺铁条件下生长状况、生长过程中分泌铁载体
的情况以及海藻接种量对铁载体分泌的影响进行了连续观测,结果表明:东海原甲藻在缺铁条件下生长状况远不如在富铁条件
下;随着藻类的生长,分泌铁载体不断增多,达指数生长期时,其分泌量也达到了最大值,之后藻类的生长和铁载体分泌都呈现
下降趋势;高接种量东海原甲藻能分泌较多的铁载体,并在较短时间到达峰值。
关键词:铁载体;铁限制;CAS实验;东海原甲藻
文章编号:1000-0933(2005)10-2788-04 中图分类号:Q178.1,Q946 文献标识码:A
ResearchonsiderophoresecretedbyProrocentrumdonghaienseLuunderiron-
limitedconditions
WANG Yan-Ping1,HEYing2,ZHENG Xiao-Ling2*,CHEN Fa-Rong2,LIRui-Xiang2,LeeFrankS.C2,
WANGXiao-Ru2 (1.TheKeyLab.ofModernAnalyticalScienceofMOE,CollegeofChemistryandChemicalEngineering,Xiamen
University,Xiamen361005;2.FirstInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Qingdao266061).ActaEcologicaSinica,2005,25
(10):2788～2791.
Abstract:Underiron-limitedconditions,marinemicroorganismsareabletosecretelow-molecular-weight,highlyspecificiron
chelatorstermedsiderophores.Thesecompoundsscavengeironfrom proteincomplexesorinsolublehydroxidesinthe
extracelularenvironmentandtransportittothecelcytosolviaamembrane-boundreceptorproteininthemicroorganism.Iron
isanecessaryrequirementinmarineecosystems.Thereforeresearchonsiderophoresisverysignificanttointerpretationofhigh
nitratelowchlorophyl(HNLC)regionsandironhypothesis.However,itisnotclearwhethereukaryoticphytoplanktoncan
producetheiron-specificchelatingcompounds.
Therefore,asystematicinvestigationwascarriedoutforsiderophoresecretedbyP.donghaienseLuunderiron-limited
conditions.Parametersstudiedincludedthegrowthofthealgaeiniron-addedandiron-deficientmedium,thesecretionof
siderophoreduringalgaegrowth,andtheeffectofalgaepopulationinoculatedonthesiderophoreproduction.Resultsshowed
thatthealgaegrowthrateiniron-deficientmediumwasslowerthanthoseiniron-richmedium.Underiron-limitedconditions,
thesiderophoreproductionincreasedalongwithalgaegrowth.Maximumproductionwasobservedintheexponentialgrowth
period.Thereaftertherateofalgaegrowthandsiderophoresecretionstartedtodecrease.Furthermore,increasingalgae
populationtresultedinsecretingmoresiderophoreandshorteningthetimeneededtoreachmaximumproduction.
Keywords:siderophore;iron-limited;CASassay;
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ProrocentrumdonghaienseLu
铁是海洋浮游植物生长所需的微量营养元素[1],也是引发近岸赤潮的重要因素之一。地壳中铁含量丰富,而海洋中游离态
铁的浓度却很低,主要以氢氧化物的沉积形式存在[1],微生物组织对铁的吸收相当困难,广阔的铁营养源不能充分利用,因而在
许多大洋中出现了高营养盐、低叶绿素(HNLC)海区[2]。在铁限制条件下,许多原核生物能够分泌出一种低分子量的化合物,能
够从氢氧化铁中夺取 Fe(Ⅲ),再经细胞膜受体将 Fe(Ⅲ)转移进生物体内,这种与铁具有极强配位能力的化合物通常称为铁载
体[1]。
关于铁载体的研究,国外起步较早,但多是针对陆源生物的病原菌、缺绿病等问题而进行的研究。随着近几年 HNLC海区
的出现以及铁限制假说的提出,人们对海洋原核生物分泌铁载体进行了广泛的研究,但对真核生物的研究相对较少[3]。本文对
海洋赤潮甲藻--东海原甲藻进行了铁限制培养,并对该藻类在富铁与缺铁条件下生长状况、生长过程中分泌铁载体的情况以
及海藻接种量对铁载体分泌的影响进行了连续观测。
1 材料与方法
1.1 藻种
东海原甲藻(ProrocentrumdonghaienseLu)由本实验室选种、自行培养而得。
1.2 培养液与培养过程
天然海水和人工海水经过滤、灭菌后作为藻类培养液的基底。天然海水采自西北太平洋海区,各种营养物质均按表 1加入。
人工海水和痕量金属采用 Aquil配方[4],营养盐和维生素采用 f/2配方,pH=8.0±0.1,盐度 30±2,各组分含量见表 1。配制人
工海水和营养盐时,除 MgCl2·6H2O和 CaCl2之外,其它组分均要过 Chelex-100柱,以消除铁及其它杂质的污染。
培养器皿经体积比为 15% HNO3浸泡过夜,再用超纯水洗净。将培养液置于光照培养箱中,待适应环境后进行接种,控制
温度(22±1)℃,光强 3500～4500lx,昼夜比 L:D=12h:12h。
表 1 人工海水培养液的组成
Table1 Compositionsinthemediumofartificialseawater
人工海水 Artificialseawater
组成 NaCl CaCl2 KBr H3BO3 Na2SO4 NaHCO3 SrCl2·6H2O MgCl2·6H2O
Compositions
浓度(gL-1) 21 1.17 0.1 0.03 4.1 0.2 0.017 11.12
Concentration
f/2营养盐 Nutrients f/2维生素 Vtamines
组成 NaH2PO4·H2O NaNO3 Na2SiO3·9H2O 组成 VB12 D-Biotin ThiamineHCl
Compositions Compositions
浓度(mgL-1) 6 75 10 浓度(µgL-1) 0.5 0.5 100
Concentration Concentration
Aquil痕量金属 Tracemetals
组成 CuSO4·5H2O (NH4)6Mo7O24·4H2O CoCl2·6H2O MnCl2·4H2O ZnSO4·7H2O
Compositions
浓度(µgL-1) 0.25 1.85 0.6 4.55 1.15
Concentration
1.3 富铁与缺铁条件下藻类生长的比对实验
在 Aquil痕量金属配方中,通过加或不加Na2EDTA·2H2O和FeCl3·6H2O以达到富铁与缺铁目的。取一定量处于指数生
长期的原甲藻接入培养液中,每隔 24h进行 1次细胞计数,观测藻类生长情况。
1.4 分泌铁载体实验
在 650nm左右,Fe(Ⅲ)-CAS配合物有最大的吸收峰,而 CAS配体则无吸收峰。由于铁载体对铁具有极强配位能力,可从
Fe(Ⅲ)-CAS配合物中夺取 Fe(Ⅲ)引起吸光度的变化,从而定性或半定量确定铁载体的分泌情况,此方法被称为 CAS实验[5]。
Fe(Ⅲ)-CAS+L→ Fe(Ⅲ)-L+CAS ΔA=A(未接种培养液)-A(接种培养液)
CAS反应液组成为 Fe3+(1.5×10-5molL-1)、CAS(1.5×10-4molL-1)、HDTMA(6×10-4molL-1),以哌嗪和 HCl为
缓冲液,调节 pH=5.6。已接种的培养液经 10000r/min离心分离 40min,取 4ml上清液与 1mlCAS溶液反应,90min后用
Agilent8453UV-Vis系统(灵敏度可达 10-6molL-1数量级)进行测定,未接种培养液作为空白。
1.5 培养液中的铁含量测定
采用AgilentICP-MS7500c测定人工海水或天然海水培养液中Fe含量,其碰撞反应池可减少基体杂质的干扰,采用H2模
式测定,灵敏度显著提高,检测限可达 10-6gL-1数量级。
987210期 王颜萍 等:铁限制条件下东海原甲藻分泌铁载体
图 1 东海原甲藻在缺铁或富铁天然海水中生长情况
Fig.1 GrowthofP.donghaienseLuiniron-deficientoriron-replete
mediaofnatureseawater
2 结果与讨论
2.1 富铁与缺铁条件下海藻生长的比对
东海原甲藻分别置于缺铁(14nmolL-1)和富铁(280nmol
L-1)的天然海水培养液中的生长情况见图 1。由此可见,接种早
期藻类生长差别并不明显,随着生长的不断进行,富铁条件下藻
类生长迅速,从 1.3×103celml-1增长至 1.6×103celml-1,4～
5d达到生长旺盛期,随后呈现缓慢下降趋势;缺铁条件下藻类
生长则处于衰减趋势(1.3×103～0.78×103celml-1),显然缺
铁条件下藻类的生长状况远远不如在富铁条件下。
缺铁条件下,含有铁的培养液在接种时引入铁元素,从而使
原甲藻在生长初期还能维持一定的生理需要、不断繁殖;但随着
藻类的不断增多,有限的铁元素难以维持藻类的正常需要,逐渐
出现了细胞密度降低、生长迟缓等现象,生长状态远远不如富铁
条件下的情况。再次验证了"铁是海洋浮游植物生长所需要的微
量营养元素"这一观点[1]。
2.2 藻类生长状况对铁载体分泌的影响
为了验证铁载体的分泌情况是否与藻类的生长周期有关,对缺铁条件下的原甲藻生长过程进行了 CAS跟踪实验。结果如
图 2所示:无论是天然海水还是人工海水培养液,随着藻类生长,铁载体分泌量不断增加,当藻类处于指数生长期或后期时,铁
载体的含量也达到了最大值;之后,随着藻类的不断衰减铁载体的分泌也呈现下降趋势。
在藻类不断生长繁殖过程中,对铁的需求也不断增加,但由于铁资源难以维系更多藻类生长的需要,不断增多的藻类就会
分泌出更多的铁载体,分泌的铁载体并不会无限制的增多,当藻类的生长出现衰减时铁载体的分泌量就会因藻体的减少而受到
影响。因此,在进行铁载体研究时,一定要把握住藻类生长的各个状态。
图 2 东海原甲藻分别在缺铁的天然海水(N)和人工海水(A)中生长以及 CAS反应的铁载体分泌情况
Fig.2 GrowthofP.donghaienseLuandCAS-reactivityiniron-deficientmediumsofnatureseawater(N)andartificialseawater(A)
2.3 培养液对原甲藻分泌铁载体的影响
在铁载体研究中,通常采用经 Chelex-100处理的人工海水作为培养液,而对天然海水作为基底的报道却较少。东海原甲藻
在不同基底培养液中的生长情况见图 2,结果发现:在天然海水和人工海水中,铁载体分泌随藻类生长的变化趋势虽然较为相
似,但也受到基底不同的影响,在人工海水培养液中铁载体分泌的高峰期出现在指数生长期(第 4天),而在天然海水培养液中
却出现的较晚(第 5天);此外,在铁载体连续观测中,天然海水培养液出现了起伏不定现象。
实验中使用的天然海水来自 HNLC海区,铁含量低[1],可以满足铁限制实验的要求,同时天然海水含有丰富的营养物质,
这是人工海水所无法比拟的。但是天然海水组分较为复杂,可能存在干扰铁载体检测的物质(如卟啉、腐殖质)[6],从而使铁载体
的检测在生长初期就受到干扰,出现起伏不定的现象。此外,铁载体的高峰期出现在指数生长期之后,不利于铁载体的进一步研
究。因此,在铁载体研究过程中,建议采用人工海水作为培养液较为适宜。
2.4 藻类的最初接种量对铁载体分泌的影响
东海原甲藻接种量对铁载体分泌的影响见图 3,由此可知:高接种量的藻类(1.8×104celml-1和 1.5×104celml-1)分泌
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的铁载体可多达 0.04AU～0.06AU,而低接种量的藻类(3200celml-1和 7100celml-1)分泌量只有 0.01AU～0.02AU;高
接种量藻类 4d就达到了分泌高峰期,而低接种量藻类的高峰期却相对延后。
藻类接种量对分泌铁载体量的影响可能与铁资源的竞争有关,由图 4可见,在接种之初,引入的铁杂质会随着接种量的增
加而增多,促进藻类的生长,高种量藻类(1.5×104celml-1和 1.8×104celml-1)的曲线起伏较大、坡度较陡,藻类繁殖能力
强,生长速度较快;与此同时,对有限铁资源的竞争也会越来越激烈,分泌的铁载体也就会越来越多,高峰期也相应的提前出现。
而低接种量的藻类(3200celml-1和 7100celml-1)的曲线起伏变化并不十分明显,与之对应的生长速度和繁殖能力也变得十
分缓慢;铁载体的分泌量也会削弱,到达高峰期的时间也会延长。
图 3 接种数量对铁载体分泌量的影响
Fig.3 EffectofpopulationinoculatedonSiderophoreproduction
图 4 不同接种量在缺铁条件下的生长
Fig.4 Growthofdifferentpopulationinoculatedtheiron-deficient
medium
3 结论
(1)铁元素的不足严重影响了东海原甲藻的正常生长状态,使其分泌出一定量的铁载体以满足自身对铁的需求。从这一角
度出发,东海原甲藻赤潮的发生是否与铁的含量及形态有关,还有待进一步研究探索。
(2)随着东海原甲藻进入不同的生长阶段,其分泌的铁载体也发生着显著的变化,一般在指数生长期达到最高值;高接种
量的藻类有利于获得更多的铁载体,并在较短时间到达峰值。藻类对铁载体分泌的动态影响不可忽视,这对深入研究铁载体的
性质及其转运铁的机理至关重要。
(3)选用人工海水培养液作为东海原甲藻的生长环境,不但可以避免大洋水引入的杂质干扰,而且也便于进行铁元素的
控制。
References:
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197210期 王颜萍 等:铁限制条件下东海原甲藻分泌铁载体