全 文 ：第 25卷第 8期
2005年 8月
生 态 学 报
ACTAECOLOGICASINICA
Vol.25,No.8
Aug.,2005
沙吸附 DNA的分布及转化活性
欧剑虹,倪丽娜,叶学成,黄永胜,谢志雄*,陈向东,沈 萍
(武汉大学生命科学学院,武汉 430072)
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20207005,30070408和 30070010)
收稿日期:2004-03-12;修订日期:2004-06-28
作者简介:欧剑虹(1979～),男,广东人,硕士生,主要从事微生物遗传学研究.
*通讯作者 Authorforcorrespondence.E-mail:whubmg@whu.edu.cnorhsiech@263.net
Foundationitem:TheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.20207005,30070408&30070010)
Receiveddate:2003-03-12;Accepteddate:2004-06-28
Biography:OUJian-Hong,Mastercandidate,mainlyengagedinmicrobialgenetics.
摘要:尽管自然环境中存在着大量的 DNase,大分子体外 DNA在土等生态环境中存在并保持转化活性。实验表明 DNA被沙土
吸附之后会被沙土保护而产生对 DNase的抗性。然而对沙中 DNA的检测多是通过 PCR或者探针杂交的方法来进行,采用转
化方法进行来检测的却鲜有报道。为了研究 DNA释放进沙之后的分布及转化活性,建立了流过式微型离心沙柱。将 20µL
pUC18置于 1.0g直径介于 1.2～2.5mm之间的沙中,1.5mL0.1mol/LCaCl2洗脱之后再用 200µLTEN缓冲液提取。结果表
明吸附于沙中的 DNA经提取后仍然具有生物转化活性,并且与洗脱液、提取液具有不同的转化活性和对 DNaseⅠ抗性,说明
DNA与沙粒的结合不只是一种简单的附着,而是 3种复杂的复合体结构。相对于没有沙保护而只能在室温下保留 7d转化活性
的 DNA,在被沙吸附保护之后的 DNA可以保存转化活性达 35d以上。研究结果还表明在存在感受态细胞的情况下,生物释放
出来的DNA并非直接与沙粒结合,而是优先与感受态细胞结合。推测认为沙吸附DNA的转化活性同DNA的构象及同感受态
细胞接触的机会相关,而与 DNA的浓度不直接相关。这些结果为研究环境中存在的 DNA库及其与混居的微生物间的相互作
用,水平基因转移及其生态效应提供了有价值的信息。
关键词:沙;DNA;转化;水平基因转移
文献标识码:A文章编号:1000-0933(2005)08-2019-06 中图分类号:Q933 文献标识码:A
Thedistributionandtransformingabilityofsand-absorbedDNA
OUJian-Hong,NILi-Na,YEXue-Cheng,HUANGYong-Sheng,XIEZhi-Xiong*,CHENXiang-Dong,
SHENPing (CollegeofLifeSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,China).ActaEcologicaSinica,2005,25(8):2019～2024.
Abstract:InspiteofthepresenceofubiquitousDNaseintheenvironment,high-molecular-weightextracelularDNAmolecules
cansurviveinnaturalhabitatssuchassoilandmaintainthetransformingability.IthasbeenevidencedthatDNAmolecules,
oncebeingabsorbedinsand,canbeprotectedfromDNasedegradation.However,themechanismofDNA-sandinteractionand
itseffectontransformingabilityremainunclear.Inthepresentstudy,wedevelopedaflow-throughsystemofsand-filedmicro
Bio-SpincolumnstodeterminethedistributionofextracelularDNAinsandandemployedE.colitransformationmethodto
directlymonitoritstransformingability.20µLoffreeplasmidpUC18DNA wasintroducedinto1.0gsand(1.2mm <
diameter< 2.5mm),elutedby1.5mLof0.1mol/LCaCl2andextractedby200µLofTENbuffer.Thetransformingability
andstabilityoftheplasmidDNAintheeluate,extractandsandwereexaminedwiththreedifferenttransformationprotocols.
TheresultsindicatedthattheDNAtransformingabilityandaccessibilitytoDNaseⅠ ineluate,extractandsandweredifferent,
suggestingatleastthreetypesofDNA-sandcomplexes.Moreover,thetransformingabilityofadsorbedDNAinsandwas
detectedoveraperiodof35days,whereastheactivityoffreeplasmidwithoutprotectionofsandonlymaintainedfor7days.In
thepresenceofcompetentcels,theDNAmolecules,releasedfrom otherorganisms,wereuptakenbythecompetentcels
insteadofbeingabsorbedbysand.Thisresultsuggestedthatthetransformingabilityofsandadsorbed-DNAwasaffectedby
theconformationofDNAmoleculesandtheaccessibilitytocompetentcels,butnottheDNAconcentration.Ourdatashowed
thattherewereatleastthreeformsofDNAintheenvironment,whichmightmakedifferentcontributionstot
===================================================================
hedynamic
changeofextracelularDNApool.
Keywords:sand;DNA;transformation;horizontalgenetransfer(HGT)
许多细菌具有从环境中摄取DNA改变自身遗传结构的能力[1～4]。这种遗传物质在不同的生物个体之间交流的现象被称为
水平基因转移(HorizontalGeneTransfer,HGT)[5]。细菌的水平基因转移机制主要有转化、接合和转导 3种方式[6]。转化一般
是指某一基因型的细菌从周围介质中摄取来自另一基因型细菌的游离(free)DNA而使受体的基因型和表型发生相应变化的
现象[7]。转化的发生有两个必要条件:一是遗传物质的存在,二是感受态细胞的形成[8]。自 1928年在 Streptococcuspneumoniae
中首次发现自然遗传转化现象以来,发现越来越多的细菌可以建立自然感受态[7,9]。尽管环境中存在大量的DNase,但越来越多
的实验证明环境中存在大量的来自于死亡细胞释放或特定生理状态下细胞分泌的遗传物质[10]。环境中大量存在的遗传物质的
命运逐步引起人们的关注。Lorenz等以化学纯净的海沙为研究对象,研究 DNA在沙土中的命运,结果表明这些遗传物质由于
受到沙土的保护作用而大量存留在沙土中可达 60d以上[10]。然而,这些研究多采用先提取再用 PCR或探针检测,却少见采用
转化方法研究沙环境中 DNA的转化活性的报道,而且沙环境中遗传物质的检测工作多集中在 DNA提取液上,却忽视了经提
取之后沙土中残留的遗传物质转移能力的研究。
本研究以沙为研究对象,对 DNA在进入沙之后,沙对 DNA的吸附机制及 DNA转化活性进行研究,为研究环境中存在的
DNA库及与其混居的微生物间的相互作用、水平基因转移及其生态效应提供有价值的信息。
1 材料和方法
1.1 菌株、质粒和培养基
菌株 大肠杆菌(Escherichiacoli)TG-1和携带质粒 pUC18的 E.coliTG-1,本室保存。
质粒 pUC18,依照《分子克隆》SDS碱裂解法大量制备[11]。
培养基 Luriabroth(LB)培养基(%,wt/vol) 蛋白胨 1,酵母抽提物 0.5,NaCl0.5,pH7.2～7.4。
选择平板(g/100mL) LB培养基中加入琼脂粉 1.5,灭菌后加入氨苄青霉素至终浓度 100µg/mL。
半固体 LB培养基(g/100mL) LB培养基中加入琼脂粉 0.6,灭菌后加入氨苄青霉素至终浓度 100µg/mL。
1.2 实验器材及溶液
1.2.1 器材 1.2mL微型离心柱,海门市三和建华玻塑仪器厂。
1.2.2 DNA提取缓冲液 TENP缓冲液[12]:50mmol/LTris-HCl(pH8.0),200mmol/LEDTA(pH8.0),100mmolNaCl,
1g/100mLpolyvinylpolypyrolidone(PVPP);
PTENCS缓冲液[13]:100mmol/Lsodiumphosphate(pH7.0),100mmol/LTris-HCl(pH7.0),100mmol/LEDTA(pH
8.0),1.5mol/LNaCl,1g/100mLhexadecyltrimethylammoniumbromide(CTAB),2g/100mLSDS;
TEN缓冲液:100mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0),100mmol/LNaCl;
Crombach缓冲液 (Cr.b)[14]:33mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0;
NNEP缓冲液[15]:100mmol/LNaAc(pH5.5),500mmol/LNaCl,50mmol/LEDTA(pH8.0),2g/100mLPVPP;
NNESP缓冲液[15]:100mmol/LNaAc(pH5.5),1mol/LNaCl,50mmol/LEDTA(pH8.0),1g/100mLSDS,2g/100mL
PVPP。
1.3 实验方法
1.3.1 沙粒的处理方法 沙来自于湖北省武汉市长江江滩。沙经过 80℃烘干 2h,除去水份后过筛,保留小于 20目大于 70目
的沙,按如下步骤净化除杂:加入适量洗衣粉沸水浴 10min,双蒸水洗 3～5次直至洗液清澈,0.5molNaOH-NaCl盐溶液浸泡
30min,双蒸水洗 3～5次直至 pH值达到 7.0后,用 0.5molHCl浸泡 30min,双蒸水洗 3～5次直至 pH值达到 7.0[16]。沙经
121℃湿热灭菌 20min,-20℃保藏备用。使用前沙需在室温下用 10mmolTris-HCl(pH7.0)平衡 20min。
1.3.2 沙柱离心系统的建立及 DNA的吸附 所有的实验都是在无菌环境下通过沙微型离心柱系统完成。1.2mL微型生物离
心柱内装入 1.0g处理过的沙土,1mL0.1molCaCl2溶液洗涤两次,滴加含有 20µLpUC18DNA(100ng/µL)的 0.1molCaCl2
溶液 200µL,室温静置 10min。
1.3.3 吸附DNA的洗脱 以每 3min滴加 500µL0.1mol/LCaCl2溶液的速度进行洗涤,每 500µL收集洗液于 1.5mL无菌离
心管内备用。
1.3.4 吸附 DNA的提取 无菌环境下,滴加 200µL提取液于洗涤过的、吸附有 DNA的流过式沙土柱系统中,60℃水浴
10min。室温下 13,200r/min离心 1min,收集离心液。反复提取两次并合并提取液备用[17]。
1.3.5 洗脱液及提取液中 DNA的纯化 洗脱液或提取液中加入十分之一倍体积乙酸钠,两倍体积乙醇沉淀 10min,12000
0202 生 态 学 报 25卷
r/min离心 10min,沉淀干燥后溶于 20µLddH2O中,1µL10URNase37℃消化 10min,备用[11]。
1.3.6 感受态细胞的建立及转化
(1)转化所用 DNA的定义
洗脱液中 DNA 沙柱中吸附的 DNA经洗脱后,对所洗脱的 DNA进行纯化所得样品。
提取液中 DNA 沙柱中吸附的 DNA经提取后,对所提取的 DNA进行纯化所得样品。
沙中 DNA 沙柱中吸附有 DNA的沙样品。
(2)感受态的建立及转化方法 洗脱液及提取液中 DNA转化按《分子克隆》描述的方法用氯化钙法制备和转化感受态
E.coliTG1;沙柱中转化,如无特殊描述,E.coliTG1感受态细胞按《分子克隆》描述的氯化钙法制备[11]。
沙柱转化方法 1 沙中 DNA经过提取液提取之后,向沙柱系统中加入 200µL感受态细胞,冰浴 30min,42℃静置 3min,迅
速冰浴 3min,加入 200µL2倍LB培养基,37℃培育 60～90min,将微型离心柱中所有的沙粒加入 3mL半固体培养基中,混合均
匀,倒入选择平板,37℃过夜培养检测转化子。
沙柱转化方法 2 沙中 DNA经过洗脱之后未经提取之前,向沙柱系统中加入 200µL感受态细胞,其余同方法 1。
沙柱转化方法 3 (包含沙中感受态细胞的制备方法):以 1%接种量转接过夜活化的大肠杆菌培养物于 50mLLB培养基
中,37℃振荡(250r/min)培养至 OD6000.4～0.6;取 5mL菌液,12,000r/min离心 20～30s收集菌体,0.1mol/LCaCl2溶液洗涤
1～2次。在沙柱体系中未加入质粒之前,将CaCl2洗涤好的细胞用 200µL0.1mol/LCaCl2重悬之后加入到微型离心柱中,冰浴
2～7h。加入 20µL100ng/µL的 pUC18静置 10min,冰浴 30min,42℃静置 3min,迅速冰浴 3min,加入 200µL2倍 LB培养基,
37℃温育 60～90min,将微型离心柱中所有的沙粒加入 3mL半固体培养基中,混合均匀,倒入选择平板,37℃过夜培养检测转
化子。
1.3.7 沙粒对 DNA吸附作用的检测方法 在含有 1.0g沙粒的微型离心柱中加入 500µLpUC18(100ng/µL),按前文所述方
法对沙中的 DNA进行 10次洗脱后,再经 Cr.b提取液进行提取,洗脱液和提取液经过纯化后,用电泳检测洗脱液和提取液中
DNA含量情况,以确定沙粒对 DNA是否有吸附作用。
图 1 洗脱液及提取液中 DNA的凝胶电泳结果
Fig.1 ElectrophoresisofDNAelutedandextractedfromsand
M:DNA/HindⅢ/EcoRⅠ Markers;1～10;泳道:顺序洗脱液中
DNA;11泳道:提取液中 DNA
lanes1～10:DNAinserialeluate;lane11:extractedDNA
1.3.8 沙柱系统中 DNA分布情况的检测方法 将含有 1.0g
沙粒的微型离心柱中加入 200µL100ng/µL的 pUC18静置
10min后只经过洗脱或者经过洗脱及提取。对洗脱液,提取液及
沙中 DNA采用转化方法进行检测。
2 结果
2.1 沙粒对 DNA的吸附作用
实验结果表明,当沙粒大于 20目时,表体面积比过小,同时
由于实验体系较小,不利于实验操作;当沙粒小于 70目时,电泳
结果表明不利于DNA的吸附或提取(数据未给出)。因此本实验
均采用介于 20目与 70目之间的沙粒。
经电泳检测洗脱液及提取液中 DNA,如图 1所示,前 3次洗
脱液中(洗脱液总体积 1.5mL)可以检测到递次减少的 DNA信
号,从第四次洗脱开始无法检测到有效的DNA信号(图 1,1～10
泳道)。提取液中出现一定量的 DNA(图 1,11泳道)。
结果表明沙粒对 DNA具有吸附作用。
2.2 提取液的选择
为了便于实验分析,对已报道的各种不同的 DNA提取液进行了筛选。微型离心柱中沙所吸附的 DNA经过洗脱后使用不
同提取液对微型离心柱中沙吸附的 DNA进行提取,将洗脱液及提取液中 DNA纯化后经电泳(图 2)及转化方法 1(图 3)检测,
结果表明 TENP,TEN及 Cr.b提取液效果好于其它提取液。以后的实验未加特殊说明提取液均为 TEN提取液。
2.3 沙柱系统中 DNA的分布情况
沙柱系统中 DNA分布情况分析结果表明,洗脱液中有活性的 DNA含量少于提取液中的,沙中经过洗脱、提取之后仍然残
留有一部分具有活性的 DNA;只经过洗脱的沙中会残留有较多量的具有活性的 DNA(图 4a,b)。
2.4 沙中感受态细胞的制备及转化能力
为了模拟沙中存在着感受态细胞的情况下,DNA从生物中释放出来进入沙中的转化情况,按转化方法 3在沙中完成细胞
感受态的诱导及转化(图 4c),表明感受态制备与转化过程均可在沙中原位完成。同时表明,当沙中存在感受态细胞时,生物释
12028期 欧剑虹 等:沙吸附 DNA的分布及转化活性
放出来的具有转化活性的 DNA物质将迅速为感受态细胞摄取并完成转化。
图 2 各种提取液提取的 DNA电泳检测结果
Fig.2 EffectsofdifferentbuffersonDNAextraction
M:DNA/HindⅢ Markers;1～6:与左对应的各提取液提取前洗
脱液中所含 DNA检测结果,洗脱液中 DNA含量基本一致,说明各
微型离心柱中的初始状态较为一致 relevantDNAseriesineluate
图 3 不同提取液提取的 DNA转化结果
Fig.3 TransformationofDNAextractedwithdifferentbuffers
(a)DNAextracteddirectly;(b)沙柱系统经洗脱后提取液中的
DNA转化结果 DNAextractedaftereluting
图 4 洗脱液、提取液及经洗脱提取后沙土中 DNA分布转化检测
结果
Fig.4 TransformationofDNAineluateandextractedfromsand
1st,2ndand3rdelute:先后 3次洗脱液中 DNA转化结果 DNAin
eluate1st,2ndand3rd;Extract:提取液中 DNA转化结果 Extract:
extractedDNA;Sand:沙土中 DNA转化结果 DNAremainedin
sand;a:采用转化方法 1 Transformationmethod1;b:采用转化方
法 2 Transformationmethod2;c:采用转化方法 3 Transforma-
tionmethod3
2.5 有 DNaseⅠ存在情况下的沙中不同分布的 DNA转化能力
将含有 1.0g沙粒的微型离心柱中加入 200µL100ng/µL的
pUC18静置 10min后,加入不同浓度存在于 5mmol/LMgCl2
10mmol/LTris-HCl,pH7.0反应缓冲液中的 DNaseⅠ溶液,
37℃水浴 30min,60℃水浴 30min终止反应。进行洗脱提取,对洗
脱液、提取液及经过洗脱提取之后的沙以转化方法 1进行检测,
观察有DNaseⅠ存在的情况下不同分布DNA的转化能力。结果
表明,当 DNaseⅠ浓度达到 5ng/µL时,洗脱液中的 DNA就无法
得到转化子;对于提取液中的 DNA,当 DNaseⅠ浓度达到
50ng/µL时无法得到转化子;而在对于残留于沙中的DNA而言,
DNaseⅠ浓度达到 500ng/µL时仍可以得到少量转化子(图 5)。
即沙中的 DNA对 DNaseⅠ呈现出 3种不同层次的抗性。
2.6 经提取后沙中 DNA活性存留时间
吸附于沙中的 DNA经过洗脱提取之后,在室温下放置不同
时间,按转化方法 1进行转化,检测吸附于沙粒中的 DNA活性
存留时间。结果表明经过洗脱提取之后残留于沙中的 DNA可以
在室温下保持转化活性 35d以上,而洗脱液中 DNA活性保留不
到 7d(图 6)。
3 讨论
本文对引入沙中的 DNA分布及转化活性进行了研究,发现经过提取后沙中仍然残留有具生物转化活性的 DNA,这表明
DNA与沙粒的结合不只是一种简单的附着,而是一个复杂的结合体,这为研究环境中存在的 DNA库及与其混居的微生物间
的相互作用、水平基因转移、生态效应提供了新的信息。
3.1 沙中 DNA存在形式有 3种
许多研究表明,"裸露"的 DNA分子可以吸附结合于沙土上,并受到沙土的保护而产生对 DNaseⅠ降解的抗性,可以在沙
土中存留达 60d之久[10]。但对DNA在沙中的结合状况及分布未见详细报道,只有Lorenz等依据沙对DNA吸附保护的能力在
加入不同浓度离子时会有所不同,认为沙与 DNA之间至少会存在两种不同的复合体结构[10]。
实验表明在经过洗脱及提取之后,沙中仍大量残留有转化活性的 DNA(图 4),并且洗脱液、提取液及沙中残留 3种不同状
态下的 DNA对 DNaseⅠ抗性能力的不同,因此认为 DNA与沙土之间至少还存在着一种复合体结构,即沙中 DNA依据其与沙
的相互作用强弱表型分为 3种类型:容易洗脱的 DNA、可以提取的 DNA及沙吸附的 DNA。这 3种不同存在类型的 DNA具有
2202 生 态 学 报 25卷
不同的转化活性。由图 4a中可以看出,可以提取的 DNA中具转化活性的量最高,容易洗脱的 DNA及沙吸附的 DNA具转化活
性的量都较少。
由于转化过程对DNase是敏感的,所以转化能力的变化可以反应DNA受DNase的损害程度。有DNaseⅠ存在情况下的沙
土中 DNA的转化能力试验中,提取液中的 DNA转化能力较沙土中余留的 DNA转化能力随 DNaseⅠ浓度的增加下降速率稍
快,推测认为 3种复合体结构有种 3种不同的保护 DNA免受降解的能力。
图 5 不同 DNA对 DNaseⅠ抗性的转化结果
Fig.5 EffectofDNaseⅠonthetransformationofsand-adsorbedDNA
=>经过提取后沙中 DNA DNAremainedinsandaftere?@tingAB>提取液中 DNA ECtractedDNAAD>洗脱液中 DNA DNAine?@ate
图 E 沙土吸附 DNA的转化活性存留时间
FigFE Gransformingabi?itHchangeofsand-adsorbedDNAIheneCJosedtoKG
a>混合后室温静置的洗脱提取液中 DNA DNAine?@ateAb>沙土的 DNA Land-adsorbedDNA
MFN 当沙中存在感受态细胞时,生物释放出来的具有转化活性的 DNA物质将优先与感受态细胞结合
当 DNA从生物中释放出来进入沙中之后DNA是先被沙吸附保护还是先为感受态细胞接受在本实验中得到探讨。经过吸
附于沙中的 DNA不能为提取液提取出来却能为转化实验检测到的事实证明感受态细胞对 DNA的结合能力强于沙粒,同时也
为感受态细胞摄取环境中 DNA的过程可能是受生理调控的主动过程提供了佐证。按转化方法 3在沙中完成感受态细胞的制
备并转化,模拟了沙中存在着感受态细胞的情况下,DNA被生物释放后的可能走向O图 4P。结果表明当沙中先存在感受态细胞
后加入 DNA时转化频率与先让 DNA同沙相结合后再进行转化时各分布的 DNA的转化频率总和相当,高于任何单一分布
DNA的转化能力。证明当沙中存在感受态细胞时,生物释放出来的具有转化活性的 DNA物质将优先与感受态细胞结合。
MFM QRK或探针检测的 DNA结果不能表示沙中结合的 DNA的转化活性
有文献报道认为,沙中被吸附的可交换类型的 DNA才具有转化活性STUV。沙中 DNA的转化活性与 DNA同沙的结合类型
无关,除了 DNA本身的构象对转化活性的影响之外,沙环境中 DNA与细胞接触的能力也是一个重要的因素。图 W中 TXE各
洗脱液中 DNA构象都很一致,多表现为线形,这就揭示了图 4中洗脱液中 DNA含量很高转化活性却较低的原因。而提取液中
DNA超螺旋构象含量较高O图 WGEN泳道P,所以转化活性也较高。因为沙中的空间位阻效应,部分DNA失去了与细胞接触的
3WYWU期 欧剑虹 等>沙吸附 DNA的分布及转化活性
能力,也会表现出转化活性下降的现象。而PCR及探针等检测手段并不能体现质粒构象及沙表面空间位阻效应的区别,所以也
就不能表现出沙中结合的 DNA的转化活性的不同。
综上所述,自然环境中,生物释放到环境中的 DNA可以为沙土以较强的作用所吸附而得到保护,抵抗 DNaseⅠ的降解,长
时间保持生物活性,并且可能在流水等自然作用下由沙土携带迁移,克服水平基因转移发生的时空障碍,从而影响某一基因在
整个流域范围内的生态分布。
References:
[1] StewartGJ,CarlsonCA.Thebiologyofnaturaltransformation.AnnuRevMicrobiol,1986,40:211～235.
[2] GaloriE,FranchiM,RinaldiL,etal.InterspecificTransformationofBacillussubtilisbyClay-BoundDNA inNon-SterileSoil.
Symbiosis,1998,25(1-3):311～322.
[3] NielsenKM,VanWeereltMDM,BergTN,etal.NaturaltransformationandavailabilityoftransformingDNA toAcinetobacter
calcoaceticusinsoilmicrocosms.Appl.Environ.Microbiol.,1997,63(5):1945～1952.
[4] FinkelSE,KolterR.DNAasanutrient:novelroleforbacterialcompetencegenehomologs.J.Bacteriology,2001,183:6288～6293.
[5] OuJH,NiLN,ShenP,etal.HorizontalGeneTransfer.Heredity,2003,25(5):623～627.
[6] EisenJA.Horizontalgenetransferamongmicrobialgenomes:newinsightsfromcompletegenomeanalysis.CurrOpinGenetDev,2000,
10:606～611.
[7] ShenP.Microbiology.Beijing:HighEducationPress,2000.220～222.
[8] LorenzM G,WackernagelW.NaturalgenetictransformationofPseudomonasstutzeribysand-adsorbedDNA.Arch.Microbiol.,1990,
154(4):380～385.
[9] DubnauD.DNAuptakeinbacteria.Annu.Rew.Microbiol.,1999,53:217～244.
[10] LorenzMG,WackernagelW.AdsorptionofDNA toSandandVariableDegradationRatesofAdsorbedDNA.Appl.Environ.
Microbiol.,1987,53(12):2948～2952.
[11] SambrookJ,RusselDW.Molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001.26～99.
[12] PicardC,PonsonnetC,PagetE,etal.DetectionandenumerationofbacteriainsoilbydirectDNAextractionandpolymerasechain
reaction.Appl.Environ.Microbiol.,1992,58:2717～2722.
[13] HurtRA,QiuX,WuL,etal.SimultaneousrecoveryofRNAandDNAfromsoilsandsediments.Appl.Environ.Microbiol.,2001,67
(10):4495～4503.
[14] CrombachW HJ.DNAbasecompositionofsoilarthrobactersandothercoryneformsfromcheeseandseafish.AntonievanLeewenhoek
J.Microbiol.,1972,38:105～120.
[15] LiuZ,ChenY.ArapidDNAisolationmethodforaridanddesertplantmaterials.JDesertRes,1997,17(3):274～279.
[16] ZhaoY.Biochemistrytechniquesandapplications,2nded.Wuhan:WuhanUniv.Press,2000.40～112.
[17] CulenDW,HirschPR.SimpleandrapidmethodfordirectextractionofmicrobialDNAfromsoilforPCR.SoilBiol.Biochem.,1998,
30(8/9):983～993.
[18] DemanecheS,Jocteur-monrozierL,QuiquampoixH,etal.Evaluationofbiologicalandphysicalprotectionagainstnucleasedegradation
ofclay-boundplasmidDNA.Appl.Environ.Microbiol.,2001,67(1):293～299.
参考文献:
[5] 欧剑虹,倪丽娜,沈萍,等.水平基因转移.遗传,2003,25(5):623～627
[7] 沈萍主编,微生物学.北京:高等教育出版社,2000.220～222.
[15] 刘志学,陈妍珂,沙漠植物 DNA快速提取方法.中国沙漠,1997,17(3):274～279.
[16] 赵永芳.生化技术原理(第 2版).武汉:武汉大学出版社,2000.40～112.
4202 生 态 学 报 25卷