全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊苑冤院员员远怨 耀 员员苑源允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员猿 原 园苑 原 圆圆摇 接受日期院圆园员源 原 园员 原 园愿
基金项目院山西省自然科学基金渊圆园员员园员员园圆怨 原 圆冤袁山西省农业科学院育种项目渊再再在允悦阅园苑冤
作者简介院董志刚袁男袁主要从事遗传育种及栽培研究遥 耘鄄皂葬蚤造院早泽泽凿扎早岳 早皂葬蚤造援 糟燥皂
通讯作者院唐晓萍袁女袁研究员袁主要从事遗传育种及栽培研究遥 耘鄄皂葬蚤造院贼曾责 原 员怨缘怨园源园员岳 员远猿援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园苑鄄员员远怨鄄园远
根癌农杆菌介导的葡萄遗传转化体系的优化
董志刚摇 马小河摇 王国平摇 赵旗峰摇 李晓梅摇 谭摇 伟摇 王摇 敏摇 唐晓萍
渊山西省农业科学院果树研究所袁山西 太谷摇 园猿园愿员缘冤
摘摇 要院以梅鹿辄葡萄离体叶片为转化材料袁对根癌农杆菌介导的遗传转化过程中涉及的几个主要影响
因素院抗菌素羧苄青霉素渊悦葬则遭冤的浓度尧乙酰丁香酮渊粤杂冤的浓度尧农杆菌菌液的浓度及卡那霉素筛选压
进行优化遥 结果表明袁抗菌素羧苄青霉素在浓度 猿园园皂早窑蕴 原员下即可有效去除农杆菌袁且对胚性愈伤组
织的分化的影响不大曰乙酰丁香酮渊粤杂冤的最适浓度为 缘园滋皂窑蕴 原员曰农杆菌菌液的浓度控制在 韵阅远园园
园郾 缘 耀 园郾 苑 时转化率最高曰卡那霉素的筛选浓度控制在 员园园皂早窑蕴 原员遥 利用优化的农杆菌介导法进行转
化袁对再生苗进行 孕悦砸检测袁结果显示袁外源基因已导入了葡萄基因组中遥 本研究优化了农杆菌介导的
葡萄遗传转化影响因素袁并获得了转基因植株遥
关键词院葡萄曰根癌农杆菌曰遗传转化曰灶责贼 原域基因
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园苑援 员员远怨
摇 摇 葡萄渊 增蚤贼蚤泽冤在全球果品生产中袁产量和栽培面积
均居第二位咱员暂 遥 近几年的研究发现袁其保健药用价值
甚至与其食用与加工价值同样重要遥 但由于其遗传背
景复杂袁生命周期长等特点袁使得常规育种方法在品种
改良上受到了极大限制遥
随着生物技术的日益完善袁基因工程的广泛应用袁
使人们能按预先的设想将外源基因导入栽培品种而培
育新的品种遥 目前在水稻尧玉米尧番茄尧大豆等作物中
均取得了很大进展咱圆 原 源暂 遥 这些成功事件为葡萄的品种
改良及新品种选育开辟了一条新思路遥 许多研究工作
者尝试将优良的外源基因导入葡萄中袁改良其品种特
性袁提高其抵抗生物胁迫和非生物胁迫的能力袁增加产
量袁改善品质袁更有效地解决常规育种无法解决的问
题咱缘 原 苑暂 遥
转基因技术在葡萄上成功应用咱愿 原 员远暂 袁为葡萄的遗
传转化工作奠定了基础袁但仍然存在转化效率不高和
基因型依赖等问题遥 因此袁尚需对葡萄遗传转化的影
响因素进一步优化遥
本研究以梅鹿辄葡萄叶片为转化材料袁对农杆菌
介导的葡萄遗传转化的影响因素进行了优化袁并将外
源基因导入了葡萄基因组袁获得了转基因植株遥
员摇 材料和方法
员郾 员摇 供试材料
员郾 员郾 员摇 无菌苗的获得摇 苑 原 愿 芽长的梅鹿辄葡萄新梢
采自山西省农业科学院果树研究所国家葡萄种质资源
圃袁经清水洗涤袁剪成长 园郾 缘 耀 员郾 园糟皂 小段袁苑园豫酒精
消毒 员园泽袁园郾 员豫升汞消毒 缘皂蚤灶 后袁接种在 员 辕 圆酝杂 培养
基上袁光照培养袁待幼嫩新梢长至 圆糟皂 时袁转移至生根
培养基中袁源园凿即可获得无菌苗遥
员郾 员郾 圆摇 菌株及质粒摇 遗传转化受体材料为山西省农
业科学院果树研究所组培实验室培育的梅鹿辄葡萄无
菌苗曰试验所用工程菌株为根癌农杆菌 蕴月粤源源园源 以及
改造质粒 责悦粤酝月陨粤员猿园员袁由山西省农业科学院果树研
究所葡萄课题组保存遥
员郾 圆摇 生化试剂及培养基
员郾 圆郾 员摇 生化试剂摇 试验所用链霉素渊杂皂冤尧羧苄青霉
素渊悦葬则遭冤尧卡那霉素渊运葬灶冤尧乙酰丁香酮 渊粤杂冤均为
杂蚤早皂葬 公司渊美国冤产品袁基本培养基所需的各种药品
及其他试剂均为进口或国产分析纯遥
员郾 圆郾 圆摇 培养基摇 农杆菌培养所用培养基为 再耘月渊每
怨远员员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
图 员摇 包含 灶责贼 原域基因载体的 栽鄄阅晕粤区域
云蚤早援 员摇 栽澡藻 凿蚤葬早则葬皂 燥枣 栽鄄阅晕粤 则藻早蚤燥灶 憎澡蚤糟澡 糟燥灶贼葬蚤灶泽 灶责贼 原域增藻糟贼燥则
员蕴培养基中含 员 早酵母提取物尧员园 早 蛋白胨尧缘 早 蔗糖
和 园郾 缘 早 酝早杂韵源 苑匀圆韵袁责匀值 苑郾 园冤袁预培养所用培养基
为 员 辕 圆 酝杂 培养基曰共培养培养基为酝杂 垣园郾 员皂早窑蕴 原员
陨月粤 垣 源皂早窑蕴 原员 栽阅在 垣 缘园滋皂窑蕴 原员 粤杂曰恢复培养基
为 酝杂 垣 园郾 员皂早窑蕴 原员 陨月粤 垣 源皂早窑蕴 原员 栽阅在 垣 猿园园皂早
窑蕴 原员 悦葬则遭曰筛选培养基为 酝杂 垣 园郾 员皂早窑蕴 原员 陨月粤 垣
源皂早窑 蕴 原员 栽阅在 垣 员园园皂早窑蕴 原员 运葬灶 垣 猿园园皂早窑蕴 原员
悦葬则遭曰生根培养基为 员 辕 圆酝杂 垣 园郾 猿缘皂早窑蕴 原员 陨月粤 垣
员园园皂早窑蕴 原员 运葬灶 垣 猿园园皂早窑蕴 原员 悦葬则遭遥 试验中所用药
品均为真空过滤后加入培养基中遥
员郾 猿摇 遗传转化方法
员郾 猿郾 员摇 农杆菌菌液的制备摇 从 再耘月 固体平板培养基
上挑取单菌落接种于 缘 皂蕴 再耘月 液体培养基渊员园园 皂早
窑蕴 原员 杂皂袁员园园 皂早窑蕴 原员 运葬灶冤袁圆愿益袁员缘园 则窑皂蚤灶 原员振荡
培养 员远 耀 圆园澡后袁按体积比 员颐 员园园 转接到 再耘月 液体培
养基中袁振荡培养至 韵阅远园园 值为 园郾 远袁将菌液转接入灭
好菌的 缘园皂造离心管中袁缘园园园 则窑皂蚤灶 原员室温离心 员园皂蚤灶袁
弃上清液袁用 酝杂培养液渊含乙酰丁香酮 缘园 滋皂窑蕴 原员冤
悬浮菌液袁然后离心管置于 圆愿益恒温振荡培养 员澡 左
右袁以活化菌株袁所有转接操作均在超净工作台中进
行遥
员郾 猿郾 圆摇 转化方法摇 在无菌条件下袁将已在 酝杂 固体培
养基上培养渊圆缘益恒温袁每天光照 员远 澡袁光强 猿园园园 蕴曾冤
缘 周后的葡萄健壮无菌苗叶片袁分别切成 园郾 缘 糟皂圆 的
小叶盘袁放在装有 酝杂培养液渊含 缘园滋皂窑蕴 原员 粤杂冤的三
角瓶中备用袁在农杆菌活化好后袁倒掉三角瓶中的 酝杂
培养液袁倒入活化好的菌液侵染小叶盘袁恒温摇床慢速
摇 缘皂蚤灶袁去除菌液袁无菌滤纸吸干叶片表面残留菌液袁
接种于共培养培养基上袁每个培养皿接种叶片 员园 片袁
每个试验设计 缘 次重复袁培养皿置于组培室中 圆缘益条
件下黑暗培养 猿凿袁然后将外植体转入恢复培养基上暗
培养恢复 苑凿袁再转入筛选培养基上暗培养 员源凿袁而后转
为光照培养袁直至抗性新梢长出后袁转入生根筛选培养
基中生根袁最终获得完整的抗性植株遥
抗菌素羧苄青霉素浓度的确定院葡萄离体叶片经农
杆菌菌液侵染后袁转移至共培养培养基上进行 猿凿 的黑
暗共培养袁然后接种于添加卡那霉素 员园园皂早窑蕴 原员袁羧苄
青霉素的浓度分别设定为 员园园尧圆园园尧猿园园及 缘园园 皂早窑蕴 原员
的筛选培养基上暗培养 员源凿 后光培养 圆愿凿袁每个处理随
机抽取 猿园个外植体统计叶片褐化率袁愈伤组织形成率
及不定芽再生率袁以确定适宜的羧苄青霉素浓度遥
乙酰丁香酮浓度的确定院在活化好的 韵阅远园园 园郾 缘
耀 园郾 苑 值根癌农杆菌及共培养培养基中分别添加不同
的 粤杂浓度为 园尧圆园尧缘园尧苑缘滋皂窑蕴 原员袁侵染葡萄离体叶
片袁然后接种到共培养培养基上黑暗培养 猿凿袁继而接
种到筛选培养基上暗培养 员源凿袁随后每个处理随机抽
取 猿园 个外植体统计叶片褐化率袁并进行 郧哉杂 组织化
学染色袁统计 早怎泽基因瞬时表达率遥
农杆菌菌液浓度的确定院用活化好的不同 韵阅 值
根癌农杆菌菌液渊韵阅远园园 园郾 员尧园郾 猿尧园郾 缘尧园郾 苑尧园郾 怨冤侵染
葡萄离体叶片袁然后接种到共培养培养基上黑暗培养
猿凿袁继而接种到筛选培养基上暗培养 员源凿袁然后每个处
理随机抽取 猿园 个外植体统计叶片褐化率袁并进行 郧哉杂
组织化学染色袁统计 早怎泽基因瞬时表达率遥
卡那霉素筛选压的确定院葡萄离体叶片经农杆菌
菌液侵染后袁接种于共培养培养基上进行 猿凿的黑暗共
培养袁然后接种于添加卡那霉素 园尧圆园尧缘园尧苑缘尧员园园 及
员缘园皂早窑蕴 原员的筛选培养基上袁暗培养 员源凿 后袁光照培
养 圆愿凿袁 每个处理随机抽取 猿园 个外植体统计叶片褐化
率袁愈伤组织形成率及不定芽再生率袁以确定适宜的卡
那霉素筛选压遥
员郾 源摇 郧哉杂染色
参照孙仲序等咱苑暂的方法进行 郧哉杂 染色及统计分
析遥
郧哉杂 垣斑数 辕外植体 越肉眼观察 郧哉杂 染色斑数 辕
统计的外植体数 伊 员园园豫 曰郧哉杂 垣面积 辕外植体 越显微
观察的 郧哉杂染色面积 辕外植体面积遥
员郾 缘摇 葡萄总 阅晕粤的提取及转基因植株检测
葡萄总 阅晕粤的提取参照余智莹等咱怨暂的 阅晕粤提取
方法袁从葡萄幼叶中提取基因组 阅晕粤袁园郾 愿豫琼脂糖凝
园苑员员
摇 苑 期 根癌农杆菌介导的葡萄遗传转化体系的优化
胶电泳检测袁耘责责藻灶凿燥则枣 公司渊德国冤生产的 月蚤燥鄄孕澡燥鄄
贼燥皂藻贼藻则核酸检测仪检测 阅晕粤 溶液浓度与纯度袁并将
浓度稀释至 圆园灶早窑滋蕴 原员遥 取 员园园 灶早 作模板进行 孕悦砸
扩增袁扩增目的基因的上游引物为 云鄄灶责贼鄄域 郧栽郧悦鄄
悦悦栽郧粤粤栽郧粤粤悦栽郧悦粤郧曰 砸鄄灶责贼鄄域 悦郧郧郧栽粤郧悦鄄
悦粤粤悦郧悦栽粤栽郧栽悦曰扩增产物的长度为 缘员源 遭责袁扩增程
序为院怨缘益变性 缘 皂蚤灶曰怨源益变性 源缘 泽袁缘缘益复性 源缘 泽袁
苑圆益延伸 源缘 泽袁循环 猿缘 次曰苑圆益延伸 员园 皂蚤灶遥 反应产
物用 园郾 愿豫琼脂糖凝胶电泳检测遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 不同浓度羧苄青霉素对去除农杆菌及胚性愈伤
组织分化的影响
羧苄青霉素的浓度分别设定为 员园园尧圆园园尧猿园园 及
缘园园皂早窑蕴 原员袁从试验中可以看出袁在加入 员园园皂早窑蕴 原员
及 圆园园皂早窑蕴 原员浓度羧苄青霉素培养基中袁胚性愈伤组
织生长受到影响较小袁但对农杆菌抑制作用较差曰添加
猿园园皂早窑蕴 原员浓度羧苄青霉素培养基上农杆菌被有效
抑制袁同时对胚性愈伤组织的分化基本上不产生影响袁
分化率达到 愿园豫以上曰当羧苄青霉素浓度继续增加
时袁虽然对农杆菌抑制效果明显袁但胚性愈伤组织的分
化也受到影响袁因此袁本研究认为羧苄青霉素的最适浓
度为 猿园园皂早窑蕴 原员遥
圆郾 圆摇 不同的乙酰丁香酮渊粤杂冤浓度对转化效率的影响
采用 源 种不同的处理院乙酰丁香酮渊粤杂冤的浓度
分别设定为 园尧圆园尧缘园尧苑缘 滋皂窑蕴 原员袁从试验中可以看
出袁乙酰丁香酮的作用在于对农杆菌 栽蚤 质粒 灾蚤则 区
基因的激发活化袁有利于质粒 栽鄄阅晕粤的有效转移袁在
侵染菌液和共培养培养基中加入不同梯度乙酰丁香
酮渊滋皂窑蕴 原员 冤袁共培养后进行 郧哉杂 组织染色分析遥
当加入的 粤杂浓度为 园滋皂窑蕴 原员时袁每个外植体的 郧哉杂
垣斑数和 郧哉杂 垣 面积仅为 员郾 员远 和 园郾 员员皂皂圆曰当 粤杂
浓度为 圆园滋皂窑蕴 原员时袁外植体的 郧哉杂 垣斑数和 郧哉杂 垣
面积增加为 猿郾 远苑 和 园郾 猿怨皂皂圆曰粤杂 浓度为 缘园滋皂窑蕴 原员
时袁外植体的 郧哉杂 垣 斑数和 郧哉杂 垣 面积为 缘郾 怨猿 和
园郾 源愿 皂皂圆袁转化效率明显提高曰但当 粤杂 的浓度继续
增大时袁外植体的 郧哉杂 垣 斑数和 郧哉杂 垣 面积又明显
降低袁导致转化效率下降遥 因此袁结果认为加入 粤杂
的最适浓度为 缘园滋皂窑蕴 原员遥
圆郾 猿摇 不同的菌液浓度对转化效率的影响
分别用不同 韵阅 值根癌农杆菌渊韵阅远园园 园郾 员尧园郾 猿尧
园郾 缘尧园郾 苑尧园郾 怨冤侵染葡萄的离体叶片袁当 韵阅远园园园郾 员 时袁
同样观察 郧哉杂 垣斑数和 郧哉杂 垣面积二项指标袁仅分别
摇 摇 摇 摇 表 员摇 粤杂浓度对转化效率的影响
栽葬遭造藻 员摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 粤杂 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥灶
贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 枣则藻择怎藻灶糟赠
粤杂 浓度
粤杂 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 辕
渊滋皂窑蕴 原员 冤
郧哉杂 垣斑数
晕燥援 燥枣 郧哉杂 垣 扎燥灶藻泽 辕
责藻则 藻曾责造葬灶贼
郧哉杂 垣面积 辕
郧哉杂 垣 糟燥增藻则葬早藻
责藻则 藻曾责造葬灶贼 辕 皂皂圆
园 员郾 员远 园郾 员员
圆园 猿郾 远苑 园郾 猿怨
缘园 缘郾 怨猿 园郾 源愿
苑缘 猿郾 怨圆 园郾 源园
为 缘郾 员 和 园郾 源袁菌液浓度不利于农杆菌附着在外植体
上曰当菌液浓度 韵阅远园园 为 园郾 猿 耀 园郾 苑 时袁郧哉杂 垣斑数和
郧哉杂 垣面积二项指标明显提高袁且转化效率较为一致袁
转化效率明显提高曰当 韵阅远园园 为 园郾 怨 时袁郧哉杂 垣斑数和
郧哉杂 垣面积二项指标显著降低袁外植体受到农杆菌过
度伤害袁导致伤口处褐化腐烂袁不利于共培养后农杆菌
的去除袁其转化效率反而又下降遥 因此袁合适的农杆菌
菌液浓度应在 韵阅远园园 为 园郾 猿 耀 园郾 苑 之间遥
表 圆摇 菌液浓度对转化效率的影响
栽葬遭造藻 圆摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 遭葬糟贼藻则蚤葬造 糟燥灶糟藻贼则葬贼蚤燥灶 燥灶
贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 枣则藻择怎藻灶糟赠
菌液浓度
月葬糟贼藻则蚤葬造 糟燥灶糟藻贼则葬贼蚤燥灶
韵阅远园园
郧哉杂斑数
晕燥援 燥枣 郧哉杂 垣 扎燥灶藻泽 辕
责藻则 藻曾责造葬灶贼
郧哉杂面积
郧哉杂 垣 糟燥增藻则葬早藻 责藻则
藻曾责造葬灶贼 辕 皂皂圆
园郾 员 猿郾 愿 园郾 圆缘远
园郾 猿 缘郾 源 园郾 源缘猿
园郾 缘 远郾 员 园郾 源苑圆
园郾 苑 缘郾 缘 园郾 源远员
园郾 怨 源郾 圆 园郾 猿员圆
圆郾 源摇 不同的卡那霉素筛选压对转化效率的影响
采用 远 种不同的处理院卡那霉素的浓度分别为 园尧
圆园尧缘园尧苑缘尧员园园 及 员缘园皂早窑蕴 原员袁从试验结果中可以看
出袁在 园 及 圆园皂早窑蕴 原员筛选压的培养基中袁离体葡萄叶
片在暗培养结束时袁离体叶片的四周切口处可产生松
散的黄白色愈伤组织曰当卡那霉素浓度为 缘园尧苑缘皂早窑
蕴 原员时袁再生率逐渐下降袁圆园豫 耀 远园豫的葡萄胚性愈伤
组织变褐袁生长受影响曰卡那霉素浓度为 员园园皂早窑蕴 原员
时袁愿园豫的葡萄胚性愈伤组织变褐袁坏死曰卡那霉素的
浓度为 员缘园皂早窑蕴 原员时袁葡萄胚性愈伤组织迅速变褐袁
坏死遥 综合考虑葡萄胚性愈伤组织的再生与由于筛选
压降低造成的假阳性之间的平衡袁卡那霉素的筛选浓
员苑员员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
图 圆摇 卡那霉素筛选压的确定
云蚤早 圆摇 栽澡藻 凿藻贼藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 运葬灶葬皂赠糟蚤灶
注院员 原 愿 为转基因再生植株曰悦运 原为非转基因对照株曰悦运 垣为阳性质粒对照曰酝为标准 阅晕粤 酝葬则噪藻则遥
晕燥贼藻院 员 原 愿 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 造蚤灶藻泽曰悦运鄄 晕燥灶鄄贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 糟燥灶贼则燥造曰悦运 垣 责造葬泽皂蚤凿曰酝 阅晕粤 酝葬则噪藻则援
图 猿摇 部分转基因葡萄植株基因组 阅晕粤的 孕悦砸结果
云蚤早援 猿摇 孕悦砸 粤皂责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 造蚤灶藻泽
度定为 员园园皂早窑蕴 原员遥
圆郾 缘摇 转化植株的检测结果
对经过 运葬灶初步筛选出的抗性葡萄幼苗袁提取总
阅晕粤袁用特异性 灶责贼 原域引物进行 孕悦砸 扩增袁以质粒为
阳性对照袁用相应品种未转化的无菌苗总 阅晕粤作阴性
对照袁结果表明袁未转化的无菌苗 悦运鄄 孕悦砸 检测未扩
出目的条带袁愿 株植株渊编号 员尧圆尧猿尧源尧缘尧远尧苑尧愿冤袁其中
除 圆 未扩增出条带外袁其余均扩增出 缘员源遭责与 悦运 垣阳
性质粒对照一致的特异性条带袁初步确定 灶责贼 原域基因
已整合到葡萄基因组中渊图 猿冤遥
猿摇 讨论
猿郾 员摇 抗菌素羧苄青霉素对根癌农杆菌生长的影响
目前袁选用的去除农杆菌的抗菌素主要包括头孢
霉素与羧苄青霉素两种袁已有许多报道关于不同葡萄
品种应用不同浓度抗菌素的研究袁所以抗菌素的作用
一定是对外植体毒性伤害最小袁但去除农杆菌增殖效
果最大咱员员袁员苑 原 圆园暂 遥 本试验中袁主要设计 源 种羧苄青霉素
浓度 员园园尧圆园园尧猿园园 及 缘园园皂早窑蕴 原员在对梅鹿辄胚性愈
伤组织的分化伤害最小化与有效去除农杆菌侵染最大
化之间寻求平衡遥 研究结果表明袁猿园园 皂早窑蕴 原员的羧苄
圆苑员员
摇 苑 期 根癌农杆菌介导的葡萄遗传转化体系的优化
青霉素即可有效去除农杆菌袁又不会影响胚性愈伤组
织的分化遥 与金万梅等咱员苑暂及韩继成等咱员愿暂的研究结果
基本一致遥
猿郾 圆摇 乙酰丁香酮对转化效率的影响
已有许多研究表明袁乙酰丁香酮可以促进农杆菌
对植物基因组的遗传转化袁其作用主要表现为活化农
杆菌 栽蚤质粒毒性区袁促进转化质粒 栽鄄阅晕粤 的转移袁从
而有效提高遗传转化的效率咱猿袁 源袁圆员 原 圆圆暂 遥 本试验研究结
果表明袁乙酰丁香酮能促进农杆菌介导的葡萄离体叶
片的遗传转化效率袁在共培养培养基中添加 缘园滋皂窑
蕴 原员乙酰丁香酮袁可以显著提高胚性愈伤组织中 郧哉杂
的瞬时表达效率遥 与邓杰等咱远暂的使用 粤杂 浓度相比袁
显著降低袁但又比孙仲序等咱苑暂使用浓度显著提高袁分
析可能与转化受体材料不一样有关遥
猿郾 猿摇 卡那霉素对转基因阳性材料筛选的影响
有效筛选阳性愈伤组织对遗传转化效率和随后的
植株再生起着重要的作用袁因此袁一直是遗传转化研究
的重点咱圆 原 员园暂 遥 在葡萄的遗传转化中袁应用最广泛的选
择标记基因是抗卡那霉素的 灶责贼 原 域渊新霉素磷酸转
移酶基因冤袁但存在两个明显的问题院一尧葡萄的诱导
愈伤组织对卡那霉素的浓度非常敏感袁即使在相对较
低的浓度时袁愈伤组织的再生也会受到抑制袁但相对较
低的卡那霉素浓度袁又容易产生嵌合体曰二尧灶责贼 原 域
渊新霉素磷酸转移酶基因冤对卡那霉素产生抗性的机
理是其基因表达产生解毒酶袁致使选择试剂渊卡那霉
素冤的有效浓度下降袁而这样非转基因细胞会受到交
叉保护袁产生再生植株袁出现假转化体袁因此袁找到合适
的针对不同品种的筛选浓度非常关键遥
为了解决这一难题袁 本试验在共培养中选用不同
梯度的卡那霉素浓度 远 种处理袁在能有效杀死假阳性
转化事件袁又兼顾转化效率的情况袁将卡那霉素浓度定
为 员园园皂早窑蕴 原员遥 李金凤等咱愿暂 尧杨丽娜等咱怨暂 尧余智莹
等咱员园暂的研究均为在前期诱导再生时添加浓度袁浓度较
低袁分别为 圆郾 缘尧猿郾 园尧缘郾 园 皂早窑蕴 原员曰而金万梅等咱员苑暂 尧孙
仲序等咱远暂 尧阅葬泽等咱员员暂的研究均为后期筛选袁浓度较高袁
分别为 圆园尧缘园皂早窑蕴 原员遥 本研究与王华咱员怨暂研究一致袁
虽然再生率降低袁但阳性率明显提高遥
源摇 结论
本实验以梅鹿辄葡萄离体叶片为转化受体袁采用
农杆菌介导法袁通过评估外植体 郧哉杂 基因的瞬时表达
率袁对转化过程中涉及的几个主要影响因素进行了优
化遥 浓度为 猿园园 皂早窑蕴 原员的抗菌素羧苄青霉素即可有
效去除农杆菌袁且对胚性愈伤组织的分化影响不大曰浓
度为 缘园滋皂窑蕴 原员的乙酰丁香酮渊粤杂冤对外源基因的导
入最为适宜曰韵阅远园园 园郾 缘 耀 园郾 苑 的农杆菌菌液浓度转化
率最高曰员园园 皂早窑蕴 原员的卡那霉素对于转化体的筛选最
为适宜遥 以上述优化的转化体系为基础袁以梅鹿辄葡
萄离体叶片为转化受体袁利用农杆菌介导法进行转化袁
获得了转基因植株遥
参考文献院
咱 员 暂摇 李云袁冯慧袁田砚亭援 葡萄遗传转化研究进展咱 允暂 援 生物工程进
展袁圆园园园袁圆园渊猿冤院员园 原 员源
咱 圆 暂摇 白云凤袁王国英袁苟明月袁赵晋锋袁董志刚援 农杆菌介导玉米转基
因的影响因素研究咱允暂 援中国生态农业学报袁圆园园远袁员源渊猿冤院员苑猿 原
员苑缘
咱 猿 暂摇 马志梅袁王忆袁许雪峰袁孔瑾袁韩振海援 根癌农杆菌介导的山定子
遗传转化的研究咱允暂 援 核农学报袁圆园园愿袁圆圆渊圆冤院员远园 原 员远源
咱 源 暂摇 乔利仙袁于新玲袁隋炯明袁范乾程袁孙世孟袁王晶珊援 农杆菌介导
的花生遗传转化体系的优化咱 允暂 援 核农学报袁圆园员圆袁圆远渊怨冤院员圆源源
原 员圆源愿
咱 缘 暂摇 陈力耕袁刘淑芳袁胡西琴援 葡萄高效再生体系的建立及转 蕴耘粤云再
基因的研究咱允暂 援 浙江大学学报袁圆园园员袁圆苑渊缘冤院缘圆猿 原 缘圆远援
咱 远 暂 摇 邓杰袁曹银生袁刘彩玉袁刘新袁薛仁镐援 农杆菌介导霞多丽葡萄胚
性细胞系遗传转化条件的优化咱允暂 援 果树学报袁圆园园愿袁圆缘渊圆冤院圆猿远
原 圆猿怨
咱 苑 暂摇 孙仲序袁陈受宜袁王建设袁李桂芬袁管雪强援 农杆菌介导 月粤阅匀基
因转化葡萄的研究咱允暂 援 果树学报袁圆园园猿袁圆园渊圆冤院愿怨 原 怨圆
咱 愿 暂摇 李金凤袁杨丽娜袁周蓓蓓袁章镇袁陶建敏援 葡萄砧木 缘月月 农杆菌介
导法的遗传转化体系咱 允暂 援 江苏农业学报袁圆园园怨袁圆缘渊猿冤院苑员缘 原
苑员苑
咱 怨 暂摇 余智莹袁张平袁徐志胜袁孙兴民袁章镇袁陶建敏援 根癌农杆菌介导
耶魏克爷葡萄遗传转化体系的优化咱允暂 援 果树学报袁圆园员圆袁圆怨渊猿冤院
猿员 原 猿缘
咱员园暂摇 杨丽娜袁刘捷袁庄智敏袁周蓓蓓袁陶建敏援 根癌农杆菌介导 月葬则灶葬泽藻
基因转化耶美人指爷葡萄的研究咱 允暂 援 南京农业大学学报袁圆园园怨袁
猿圆渊员冤院猿源猿 原 猿源怨
咱员员暂摇 阅葬泽 阅袁 砸藻凿凿赠 酝袁 哉责葬凿澡赠葬赠葬 杂袁 杂燥责燥则赠 杂援 粤灶 藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼 造藻葬枣 凿蚤泽糟
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