为寻找2株萎缩芽孢杆菌与铬去除相关的差异基因,探索PFGE技术在寻找差异基因方面的可行性,本研究以萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)ATCC 9372菌株和Ua菌株为材料,分别考察2株菌对Cr(VI)的耐受性和去除能力;采用PFGE技术进行基因组酶切片段分析,以期获得差异基因;利用转基因技术对得到的差异基因Cr(VI)去除功能进行验证。结果表明:2株菌在48h时菌体生长和对Cr(VI)的去除率达到最大值,ATCC 9372菌株的生长状况和Cr(VI)去除能力明显高于Ua菌株;基因组通过内切酶EcoRI- HindIII组合酶切后,PFGE分析得到了一条3kb左右的差异条带,测序比对结果表明该序列含有YthA基因和YtiB基因;差异序列的酶切位点与内切酶组合一致,PCR结果表明差异序列只存在于Ua菌株中,转基因菌株ATCC 9372-YtiB的Cr(VI)去除率下降了约12%,表明YtiB基因与Cr(VI)的去除负相关。本研究利用PFGE技术成功发现2株萎缩芽孢杆菌的铬去除差异基因,经验证该技术可行性高,为寻找差异基因提供了一种新途径。
全 文 ：核 农 学 报!"#$%!"&"# $$#%" ($##
!"#$%&"()#*+&$,-$.*#/#$&0*.+%*+1
收稿日期!"#$)*$$*$,!!接受日期!"#$%*#,*$
基金项目!国防科技项目"$)d9$#$# !国家-&+,.计划""#$)K-A)##,# !四川省生物质资源利用与改性工程中心项目"$,d^@N#"#
作者简介!王超!男!主要从事重金属污染的治理研究% 0*1234$\28:62$$;$,>:71!
通讯作者!陈晓明!女!教授!主要从事微生物与核素相互作用的研究% 0*1234$:6X8 3^271389;@\=@T>XP=>:8
文章编号!$###*A%%$""#$%##*$#%"*#&
" 株萎缩芽孢杆菌铬去除差异基因的 JDR0分析
王!超$!"!陈晓明$!"!许!燕$!"!阮!晨$!"!刘小玲$!"
郝希超$!"!宋!收$!"!罗学刚$!陈彩霞$!罗宇霞$
" $ 西南科技大学生命科学与工程学院!四川 绵阳!"$#$#&" 西南科技大学核废物与环境安全国防
重点学科实验室!四川 绵阳!"$#$##
摘!要!为寻找 " 株萎缩芽孢杆菌与铬去除相关的差异基因!探索 JDR0技术在寻找差异基因方面的可
行性!本研究以萎缩芽孢杆菌6&*.#1&/$">5&+#1(.UKK&,+" 菌株和 f2菌株为材料!分别考察 " 株菌
对 K?mF(的耐受性和去除能力$采用 JDR0技术进行基因组酶切片段分析!以期获得差异基因$利用转
基因技术对得到的差异基因 K?mF(去除功能进行验证# 结果表明%" 株菌在 )A6 时菌体生长和对 K?
mF(的去除率达到最大值!.UKK&,+" 菌株的生长状况和K?mF(去除能力明显高于f2菌株$基因组通
过内切酶 H*"?NQ4.%3NNN组合酶切后!JDR0分析得到了一条 ,N] 左右的差异条带!测序比对结果表明该
序列含有 L/5,基因和 L/.6基因$差异序列的酶切位点与内切酶组合一致!JKL结果表明差异序列只存
在于 f2菌株中!转基因菌株 .UKK&,+" BL/.6的 K?mF(去除率下降了约 $"Q!表明 L/.6基因与 K?
mF(的去除负相关# 本研究利用 JDR0技术成功发现 " 株萎缩芽孢杆菌的铬去除差异基因!经验证该
技术可行性高!为寻找差异基因提供了一种新途径#
关键词!铬污染$萎缩芽孢杆菌$脉冲场凝胶电泳$基因差异分析$L/.6基因
/EF$$#G$$A&H5>3@@8>$##*A%%$G"#$%G#%>$#%"
!!铬是重要的战略及经济资源!由于世界各国对铬
产品的需求加大!导致大量的铬渣)含铬废水)废气排
放到自然环境中!最后导致人类及动物患病甚至死
亡 $( % 针对日益严重的核素污染!近几年出现了生物
修复法 " B)( % 萎缩芽孢杆菌 .UKK&,+" 菌株对 K?
"mF#有较强的去除能力!因此研究其基因组意义重
大% .UKK&,+" 菌株和 f2菌株同为芽孢杆菌属萎缩
芽孢杆菌!而二者的 K?"mF#耐受性与去除能力存在明
显差异!这可能与其基因组差异有关 %( %
寻找物种间差异基因的方法很多!例如基因芯片
技术 ( )原位杂交技术 +( )免疫印迹杂交技术 A(等%
这些成熟技术具有准确性与高通量等优点!但它们在
实际应用中有各自的局限性% 我们选用脉冲场凝胶电
泳系统"S=4@XP [3X4P 9X4X4X:T?7S67?X@3@!简称 JDR0#来
寻找两株菌的差异基因%JDR0技术原理是利用有规
律地)变化的电场!使得大分子 /M.在泳道中不停的
改变方向!使得大分子 /M.结构趋于线性!易于在凝
胶中前行!从而分离开来 &( % 由于 JDR0技术的独特
优势!使其在染色体 /M.分离及电泳核型分析等领域
中广泛应用 $#( % 但是目前利用 JDR0技术分析差异
基因鲜有报道%
选取不同的限制性内切酶对样品基因组进行酶
切!酶切后的 /M.利用 JDR0技术进行分离!对差异
条带进行测序比对!得到的序列即为物种间的差异基
因% 本研究利用 JDR0技术!成功发现了同属于萎缩
芽孢杆菌的不同亚种 .UKK&,+" 菌株和 f2菌株在基
因水平上的不同!并对其 K?"mF#去除功能进行了验
证!填补了 JDR0技术在寻找同种菌株不同亚种间基
因片段差异的空白%
"%#$
! 期 " 株萎缩芽孢杆菌铬去除差异基因的 JDR0分析
!"材料与方法
!#!"菌株
萎缩芽孢杆菌 .UKK&,+" "6&*.#1&/$">5&+#1!简
写为 .UKK&,+" 菌株#!原名枯草芽孢杆菌黑色变种
"6&*.#11#=/..11#=1>K1#=/..1#!购于中国普通微生物
菌种保藏中心 $$( %
萎缩芽孢杆菌 f2"6&*.#1&/$">5&+#1!简写为 f2
菌株#!由某铀尾矿分离得到% 在铀尾矿库取矿渣样!
挑取可培养的优势菌株!用K?"mF#浓度为 $## 19*` B$
的液体 -`"4=?32*]X?T283#培养基筛选% 经鉴定为萎缩
芽孢杆菌 $"( %
!#$"菌株对N5"EO#的的耐受性及去除能力研究方法
将 .UKK&,+" 菌株和 f2菌株活化培养 $A 6 后!
稀释菌液 E/##值至 #GA!按 $#Q的接种量!分别接种
到含有 K?"mF#浓度为 #)"#))#)#)A# 19*`B$的 -`
液体培养基中!总体积为 $## 1` % ,+O!$"# ?*138 B$
震荡培养% 分别在 #)$")")),))A)# 6 时取样!测定
其培养基中剩余 K?"mF#的含量及菌体浓度 E/##值%
对照组为含同浓度 K?"mF#的培养基但是不加菌!每组
, 个重复% 以菌液 E/##值表征菌株的 K?"mF#耐受
性!以 K?"mF#去除率表征菌株的 K?"mF#去除能力%
!#%"菌株差异基因的分析方法
对于同种属的 .UKK&,+" 菌株和 f2菌株!其 K?
"mF#的耐受性及去除能力不同!这可能与两者基因的
差异相关% 为了寻找两株菌的差异基因!本研究选用
JDR0技术分析 " 株菌的基因组%
将 " 株菌制备成凝胶块后通过几种常用的限制性
内切酶处理!本研究分别采用 6&84F)H*"?F):1/F)
08&F核酸内切酶"大连 U2L2i2#对其 /M.进行单酶
切!同时分别采用 H*"?NQ4.%3NNN"0Y#)H*"?NQ6&84N
"0-#)6&84NQ4.%3NNN"-Y#, 种组合对其 /M.进行双
酶切!酶切条件见表 $!每组 , 个重复% 利用脉冲场凝
胶电泳系统进行酶切后的基因差异分析!分离 /M.条
带% 选择电泳缓冲液为 #G% CU-0)电泳温度 $)O)脉
冲角度 $"#u)电压 m*:1B$!脉冲转换时间为 "G$ (
,GA @!电泳时间为 & 6 $, B$%( % 对差异条带进行胶回
收!测序%
!#<"S/&技术寻找差异基因可行性验证
将差异条带进行分析比对!得到相对应的基
因% 从 MK-F上查阅差异基因的序列!对该序列上
的酶切位点进行分析!验证该序列是否存在相应酶
切位点%
表 !"不同内切酶的酶切条件
L6),4!"@*04:.*-9I-98*.*-9:;-58*;;4549.498-9GI,46:4
内切酶名称
08P78=:4X2@X
酶切缓冲液
-=[X?
酶切温度
UX1SX?2T=?X7[P39X@T378HO
6&84% i ,#
H*"?% Y ,+
:1/% Z ,+
08&% U ,#
H*"?NQ4.%3& Y)Z ,+
H*"?NQ6&84N Y)i ,)
6&84NQ4.%3& i)Z ,)
M7TX$i$ "##1ZU?3@*YK4! $##1ZZ9K4" ! $#1Z/UU! $###1ZiK4! SY
kAG%>!Y$ %##1Z U?3@*YK4! $##1Z Z9K4" ! $#1Z /UU! $###1Z
iK4! SYk+G%>! Z$ $##1Z U?3@*YK4! $##1Z Z9K4" ! $#1Z /UU!
%##1ZiK4! SYk+G%>!U$ ,,#1Z U?3@*YK4! $##1Z Z9.K! $#1Z
/UU! #1Zi.K! SYk+G&>
以差异基因序列为模板设计引物 $( !JKL验证差异基
因是否存在于供试菌株基因组中%
!#="差异基因的 N5"EO#去除功能验证
选取差异基因作为研究对象!对其 K?"mF#去除功
能进行验证 $+( % 以.UKK&,+" 菌株作为宿主菌)S-0*
I /M.为载体!利用转基因技术将差异基因导入
.UKK&,+" 菌株中 $A B"#( % 在含 )# 19*`B$ K?"mF#的
-`培养基中!,+O!$"# ?*138 B$震荡培养% 分别在 #)
$")")),))A)#6 时取样!测定其培养基中剩余 K?
"mF#含量及 E/##值% 以 .UKK&,+" 菌株为对照!每
组 , 个重复%
$"结果与分析
$#!"2LNNY%?$ 菌株与 H6 菌株对 N5"EO#耐受性
的差异
图 $)图 " 是 .UKK&,+" 菌株和 f2菌株分别在含
#)"#))#)#)A# 19*` B$ K?"mF#的 -`培养基中的生长
曲线% 由图 $)图 " 可知!.UKK&,+" 菌株对 K?"mF#的
耐受性明显强于 f2菌株!并且在相同 K?"mF#浓度下!
其生长状况明显强于 f2菌株% .UKK&,+" 菌株在 )A
6 时生长达到稳定!菌体浓度达到最大值!对 #
19*` B$ K?"mF#耐受性较好!K?"mF#达到 A# 19*` B$时!
菌体浓度急剧下降&f2菌株在 ") 6 时生长趋于平稳!对
"# 19*` B$ K?"mF#耐受性较好% 对比发现在不同 K?
"mF#浓度下f2菌株最大生长浓度分别仅为.UKK&,+"
菌株的 A$G)Q)"G$)Q)%)G&&Q和 %$G#,Q&随着 K?
"mF#浓度的增大!" 株菌生长状况呈现下降趋势$.UKK
,%#$
核!农!学!报 "& 卷
&,+" 菌株的菌体浓度 E/##组由 )G$$ 降至 "G%,!f2菌
株的菌体浓度由 )G#& 降至 $G"&%
图 !"N5"EO#中 2LNNY%?$ 菌株的生长状况
/*01!"&5-C.MI-98*.*-9:-;2LNNY%?$
:.56*9:*9N5"EO# :-,G.*-9
图 $"N5"EO#中 H6 菌株的生长状况
/*01$"&5-C.MI-98*.*-9:-;H6 :.56*9:
*9N5"EO# :-,G.*-9
$#$"2LNNY%?$ 菌株与 H6 菌株对 N5"EO#去除能
力的差异
图 ,)图 ) 是 .UKK&,+" 菌株和 f2菌株分别对
"#))#)#)A# 19*`B$ K?"mF#的去除曲线% 对比 " 株
菌的去除曲线发现!.UKK&,+" 菌株对 K?"mF#的去除
率明显高于 f2菌株% 在 "# 19*` B$ K?"mF#中!.UKK
&,+" 菌株对 K?"mF#的去除率可达到 &&G#$Q!f2菌
株的去除率达到了 A$G$"Q&在 )# 19*` B$ K?"mF#中!
.UKK&,+" 菌株对 K?"mF#的去除率达到了 &G"$Q!
而 f2菌株去除率仅为 %"G,$Q!约为 .UKK&,+" 菌株
的 $H"&在 # 及 A# 19*` B$ K?"mF#中!.UKK&,+" 菌株
对 K?"mF#的去除率有所下降!最高去除率分别为
A$G$,Q),G+"Q!此时 f2菌生长受到抑制!K?"mF#
去除率很低!仅为 ,%G"AQ)$&G,%Q%
图 %"2LNNY%?$ 菌株的 N5"EO#去除曲线
/*01%"T4A-36,4;;4I.-;2LNNY%?$ :.56*9:.- N5"EO#
图 <"H6 菌株的 N5"EO#去除曲线
/*01<"T4A-36,4;;4I.-;H6 :.56*9:.- N5"EO#
$#%"2LNNY%?$ 菌株和 H6 菌株差异基因分析
将 " 株菌的 /M.分别经单酶切和双酶切后!利用
JDR0技术分离 /M.条带!结果显示单酶切和双酶切
组合 H*"?NQ6&84N)6&84NQ4.%3NNN均未发现差异条
带!仅 H*"?NQ4.%3NNN组合明显发现差异条带% 由图 %
可知!由内切酶 H*"?NQ4.%3NNN组合酶切后!.UKK&,+"
菌株和 f2菌株 /M.在 ,N] 大小的地方出现了差异条
带!且清晰可见!经过 F129X 2`] 软件分析后得到相同
结果%
对差异条带进行胶回收并测序!得到 , $"A ]S 的
/M.片段"图 #% 经 -42@T比对发现!差异序列包含
L/5,基因序列和 L/.6基因序列% 将 L/5,基因序列
)%#$
! 期 " 株萎缩芽孢杆菌铬去除差异基因的 JDR0分析
注$0Y为 H*"?NQ4.%3NNN内切酶组合&-Y为 6&84NQ4.%3NNN内切酶组合&Z$HZ" 为 Z2?NX?%
M7TX$0Y$ H*"?NQ4.%3NNNK-Y$ 6&84NQ4.%3NNNKZ$HZ"$ Z2?NX?>
图 ="2LNNY%?$ 菌株和 H6 菌株双酶切电泳图
/*01="H6 6982LNNY%?$ :.56*9:@B2S/&+6..4598*04:.*90 )7 498-9GI,46:4I-A)*96.*-9:
"$ ,&,]S#与差异片段比对后发现 L/5,基因序列完全
包含在差异片段基因序列中!一致性达到 )$G%Q"图
中下划线的碱基序列#&将 L/.6基因序列"%A]S#与
差异片段比对后发现 L/.6基因序列位于差异片段基
因序列尾部!共有 ,+%]S 匹配!一致性达到 &%G"Q
"图 中方框中的碱基序列#%
$#<"S/&技术寻找差异基因的可行性验证
通过分析 JDR0技术得到的差异序列上的酶切位
点和对差异序列进行 JKL扩增!进行 JDR0技术寻找
差异基因的可行性验证%
对图 中差异基因序列进行分析!起始端碱基
..UUK与内切酶 H*"?F酶切位点 R*..UUK相对应!
末端碱基 .与内切酶 4.%3FFF酶切位点 .*.RKUU相对
应!这与研究中所用的内切酶相符合% 利用 /M.Z.M
软件对 L/.6基因序列进行分析!得到 L/.6基因上的酶
切位点如图 +% 由于 L/.6基因序列上存在 4.%3FFF内
切酶酶切位点!使得 L/.6基因序列在中间被切断!差
异片段中 L/.6基因序列表现出不完整性%
从 MK-F上 查 阅 L/.6 基 因 序 列 " RX8XF/$
&,A#A+#!利用 J?31X?J?X13X?G# 设计检测引物!以
.UKK&,+" 菌株和 f2菌株为模板进行 JKL反应!电
泳检测 L/.6基因是否存在于供试菌株基因组中%
引物序列 $$D$$%r*.RRR.K..KR..K.UR.RUK
U*,r!L"$%r*.RUKR.UKKKRUUKKUR...*,r
引物序列 "$ D"$%r*RR.U.KUKRUKURRUUR..KU
R*,r!L"$%r*.K.KUKRKUUKK.KUR..UK.*,r
引物序列 $ 可扩增 L/.6基因全基因序列"图 A B
.#!序列 " 可扩增 L/.6基因序列内 ,")]S 的序列"图
A B-#%
由图 A 可知!L/.6基因完整存在于 f2菌株基因组
中!而不存在于 .UKK&,+" 菌株基因组中% 由此证
明!该差异基因确实存在!利用 JDR0技术寻找差异基
因的方法是可行的%
$#="差异基因的 N5"EO#去除功能验证
由于差异条带中包含的 L/5,基因与 MK-F上查阅
的序列一致性较低!仅为 )$G%Q!而 L/.6基因序列与
查阅到的序列相似度较高!为 &%G"Q!所以本研究选
取 L/.6基因进行差异基因 K?"mF#去除功能的验证%
利用转基因技术!选取 .UKK&,+" 菌株为宿主
菌!以 S-0*I /M.为载体!将 L/.6基因导入 .UKK
&,+" 菌株中"将导入 L/.6基因的 .UKK&,+" 菌株命
名为 .UKK&,+" BL/.6#得到 .UKK&,+" BL/.6菌株!
在含 )# 19*` B$ K?"mF#的 -`培养基中培养%
图 &)图 $# 分别为 )# 19*`B$ K?"mF#中 .UKK
&,+" BL/.6菌株的生长曲线和去除曲线!以 .UKK
&,+" 菌株为对照!每组 , 个重复% 由图 & 可知!以
.UKK&,+" 菌株为对照!K?"mF#浓度为 # 19*`B$时!
.UKK&,+" BL/.6菌株的生长状况未发生明显变化!
说明转基因操作和目的基因未对菌株造成伤害!但在
)# 19*`B$ K?"mF#的培养基中!.UKK&,+" BL/.6对
K?"mF#耐受性下降% 由图 $# 可知!.UKK&,+" 菌株的
去除能力高于 .UKK&,+" BL/.6菌株% 对 )# 19*`B$
%%#$
核!农!学!报 "& 卷
图 >"差异条带测序结果
/*01>"@*:I54+69I4:4RG49I4;560A49.
K?"mF#! .UKK &,+" 菌 株 在 )A6 的 去 除 率 达 到
&G,,Q!.UKK&,+" BL/.6菌株仅达到 A)G,AQ!去除
率下降了约 $"Q%
!!由图 & 与图 $# 可知!L/.6基因与菌株对 K?"mF#
的去除作用负相关%
%"讨论
%#!"N5"EO#对微生物生长的影响
K?"mF#的毒性很大且易溶于水!不易形成络合
物!有很强的氧化性!可对人类与环境造成巨大威
%#$
! 期 " 株萎缩芽孢杆菌铬去除差异基因的 JDR0分析
图 ?"7"/8基因酶切位点图
/*01?"9Z7A4,-I*-;7"/8&494
注$图 .为引物 $ 的 JKL反应&图 " 为引物 " 的 JKL反应%
M7TX$ D39=?X.3@T6X?X@=4T7[JKL?XP:T378 7[S?31X?@$>D39=?X-3@T6X?X@=4T7[JKL?X23T378 7[S?317?">Z$ /` "### Z2?NX?>
图 ["SNT反应
/*01["&4,+*I.G54-;SNT
胁 "$( % K?"mF#对微生物的生长有一定影响!随着 K?
"mF#浓度的增大!微生物生长受到的抑制作用也更
大% 由图 ,)图 ) 可知!菌株的生长曲线与去除率曲线
的趋势基本一致!这说明菌体的浓度与 K?"mF#的去除
效应正相关%
本研究中 .UKK&,+" 菌株对 K?"mF#耐受及去除
能力明显高于 f2菌株% 随着 K?"mF#浓度的增大!"
株菌的去除能力下降!这可能是由于 K?"mF#对菌体的
毒害作用所导致!也有可能是由于菌株的 K?"mF#去除
量将要达到饱和所导致的%
%#$"S/&技术在基因差异研究中的应用及可行性
分析
相似微生物 .UKK&,+" 菌株和 f2菌株的耐受性
和去除效应存在差异!可能是由基因水平差异引起的!
所以对其差异基因进行分析是有必要的%
现在常用的研究差异基因的方法主要有基因芯片
技术)原位杂交技术)免疫印迹杂交技术等% 但是这些
方法需要较多的经费)较强的操作技能!虽然效果较
好!但是在实际操作中!其局限性明显% JDR0技术由
于其独特的优势!在染色体 /M.分离及电泳核型分析
等领域中得到广泛应用% 比如$骆利敏等 ""(利用脉冲
场电泳分析布鲁菌 $& 株标准菌株!将其聚类为三大
类&王红等 ",(研究肠道沙门菌 E$)"-#菌群!将 "& 株
肠道沙门菌 E$)"-#菌群分为 ") 个 JDR0型别%
本研究采用的是 JDR0中的钳位均匀电场电泳!
最高可分离 $# Z] 的/M.片段% JDR0技术需要考虑
众多影响因素% 首要是制备合格的样品!JDR0制样
是对 /M.的原位提取!将细胞固定在凝胶块中进行裂
解)去蛋白等操作!可以尽量减小对 /M.的伤害 ")( %
样品在裂解时!所用蛋白酶 i的纯度直接影响着电泳
条带的清晰程度!而内切酶的选择也要根据物种的不
同进行筛选% 在电泳条件的选择上需注意许多方面!
脉冲转换时间以及电泳时间是根据实际情况改变的%
本研究采用的条件为$#G% CU-0)电泳温度 $)O)脉冲
+%#$
核!农!学!报 "& 卷
注$.UKK&,+" B#H.UKK&,+" B)# 为 .UKK&,+" 原始菌株
在 # H)# 19*` B$ K?"mF#中的生长曲线&.UKK&,+" BL/.6B
#H.UKK&,+" BL/.6B)# 为 .UKK&,+" 转基因菌株在 # H)#
19*` B$ K?"mF#中的生长曲线%
M7TX$.UKK&,+" B#H.UKK&,+" B)#$.UKK&,+" @T?238@38
#H)# 19*` B$ K?"mF# @74=T378>.UKK&,+" BL/.6B#H.UKK
&,+" BL/.6B)#$ .UKK&,+" BL/.6@T?238@38 #H)# 19*`B$
K?"mF# @74=T378>
图 Y"N5"EO#中两株菌的生长状况
/*01Y"&5-C.MI-98*.*-9:-;.C- :.56*9:
*9N5"EO# :-,G.*-9
注$.UKK&,+").UKK&,+" BL/.6分别为 .UKK&,+" 原始菌
株和转基因菌株对 K?"mF#的去除率曲线%
M7TX$.UKK&,+"$ .UKK&,+" T7)# 19*`B$ K?"mF#>.UKK
&,+" BL/.6$ .UKK&,+" BL/.6T7)# 19*` B$ K?"mF#>
图 !\"$ 株菌的 N5"EO#去除曲线
/*01!\"T4A-36,4;;4I.-;.C- :.56*9:.-
<\ A0%X]! N5"EO#
角度 $"#u)电压 m*:1B$!与前人研究条件一致!脉冲
转换时间选择 "G$ (,GA @!这与文献"" B",(报道
有所不同!因为本研究中的萎缩芽孢杆菌 /M.经过酶
切后大片段较多!增大脉冲时间有利于大片段的 /M.
分离% 电泳总时间影响着 /M.片段在凝胶中的分布!
本研究中采用电泳时间为 & 6%
%#%"差异基因 N5"EO#去除功能的验证
基因功能研究方法有很多!常见有$转基因技
术 "%( )基因敲除技术 "(及微阵列技术等方法!这些技
术较为经典)针对性强 "+( % 本研究选取转基因技术进
行功能验证%
差异序列包含 L/5,基因和 L/.6基因% L/5,基因
能够编码细胞色素 ]P 型辅酶氧化酶!该酶常常出现在
某些固氮菌中!去除氧或减少氧作为电子传递链的一部
分&L/.6基因能够编码碳酸酐酶!该酶能够催化碳酸分
解为二氧化碳和水$YKE,
B hYh"Y"KE, hY"E!在细
胞内有着维持酸平衡的作用 "A( % .UKK&,+" 菌株与 f2
菌株在对核素的耐受性及去除能力上表现出的不同!可
能是由于这类酶的表达量不同或是由于编码该酶的基
因缺失所引起的% " 株菌只有在/M.水平有所差异后!
通过同种酶切后才能切出不同的条带!而这些基因的差
异有很大可能会影响该基因编码的酶类的表达!所以通
过研究差异基因能找到.UKK&,+" 菌株与f2菌株去除
核素差异的机理% 经验证!转基因菌株 .UKK&,+" B
L/.6的 K?"mF#耐受性及去除能力均下降!表明 L/.6基
因与 K?"mF#的去除是负相关的%
%#<"S/&技术存在的缺陷
本研究利用 JDR0技术发现了 " 株萎缩芽孢杆菌
的差异基因!但是在研究过程中!JDR0技术也暴露了
一定的弊端% 寻找两株菌间未知的差异基因!我们需
要选取合适的内切酶来进行酶切!本研究采用了 + 种
酶切方式!仅 $ 种酶切方式发现了差异条带!所以内切
酶的选取与 JDR0技术能否成功关系重大&电泳总时
间的长短决定了条带的分布$时间长!大片段分离效果
好!但片段整体下移!一些小片段会跑出凝胶&时间短!
片段整体上移!小片段未跑出胶块!但 /M.大片段则
会聚集在一起% JDR0技术寻找差异基因可行性较
高!但是发现的差异基因可能与特定的功能无关!这也
是目前脉冲场凝胶电泳中普遍存在的问题%
<"结论
萎缩芽孢杆菌 .UKK&,+" 菌株和 f2菌株对 K?
"mF#的耐受及去除能力存在明显差异!经 JDR0技术
分析得到该两株菌的差异基因% 利用 JDR0技术寻找
亚种菌株间的差异基因是切实可行的!为寻找差异基
因提供了一种新途径!但该技术需要进一步的完善%
A%#$
! 期 " 株萎缩芽孢杆菌铬去除差异基因的 JDR0分析
参考文献!
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