全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊苑冤院员员愿愿 耀 员员怨远
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员猿 原 园愿 原 园怨摇 接受日期院圆园员源 原 园员 原 园愿
基金项目院科技部科技基础平台项目野核桃尧板栗资源标准化整理尧整合及共享试点冶渊圆园员源 原 园源愿冤袁农业部保种项目野核桃尧板栗种质资源繁殖更
新尧鉴定评价与利用冶渊圆园员源晕宰月园园怨冤袁山东省农业良种工程项目渊鲁科农字咱圆园员员暂园愿远冤袁中俄国际科技合作专项渊圆园员圆阅云砸猿园苑园园冤
作者简介院徐丽袁女袁助理研究员袁主要从事种质资源研究遥 耘鄄皂葬蚤造院曾怎造蚤员圆源缘岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院刘庆忠袁男袁研究员袁主要从事果树生物技术与资源育种研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 择扎造蚤怎园园员岳 员圆远援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园苑鄄员员愿愿鄄园怨
核桃 宰砸运再源基因的克隆与表达分析
徐摇 丽摇 陈摇 新摇 魏海蓉摇 张力思摇 王甲威摇 宗晓娟摇 刘庆忠
渊山东省果树研究所 辕山东省果树生物技术重点实验室袁山东 泰安摇 圆苑员园园园冤
摘摇 要院宰砸运再转录调控因子广泛参与植物的生长发育尧生物胁迫和非生物胁迫等生理过程遥 本研究利
用 则藻增藻则泽藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶鄄责燥造赠皂藻则葬泽藻 糟澡葬蚤灶 则藻葬糟贼蚤燥灶渊砸栽鄄孕悦砸冤及 则葬责蚤凿 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 糟阅晕粤 藻灶凿泽 渊砸粤悦耘冤技
术克隆了核桃 渊 允怎早造葬灶泽 则藻早蚤葬 蕴援 冤 宰砸运再 基因 糟阅晕粤 全长序列袁命名为 宰砸运再源 渊郧藻灶月葬灶噪 登录号为
运悦苑怨缘缘缘员郾 员冤遥 结果表明袁克隆到的片段长度为 圆 员苑源 遭责袁完整开放阅读框为 员 缘缘源 遭责袁编码 缘员苑 个氨基
酸遥 序列分析表明 宰砸运再源 基因含有 圆 个 宰砸运再保守结构域和 圆 个 悦圆匀圆 锌指结构域袁属于 宰砸运再基因
家族第玉类成员遥 利用实时荧光定量 孕悦砸分析 源益低温和自然低温条件对该基因表达的影响以及组织
表达模式遥 结果表明 宰砸运再源 受低温诱导表达袁能够在低温胁迫的早期响应这一生理过程遥 宰砸运再源 在
树皮渊韧皮部冤尧雌花尧花芽和叶片中均有表达袁且在树皮中表达量最高袁具有组织特异性遥 研究结果可
为核桃抗寒基因工程育种提供基因资源遥
关键词院核桃曰宰砸运再转录因子曰基因克隆曰实时荧光定量 孕悦砸
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园苑援 员员愿愿
摇 摇 宰砸运再 是一类植物特有的新型抗逆相关转录调
控因子袁因其 晕端都至少含有 员 个 宰砸运再结构域而得
名咱员 原 圆暂 遥 宰砸运再结构域由高度保守的 远园 个氨基酸组
成袁晕 端 苑 个高度保守的氨基酸残基 宰砸运再郧匝运 是
宰砸运再结构域的核心序列袁悦 端是保守的 悦鄄载源 原缘 原 悦鄄
载圆圆 原 圆猿 原 匀鄄载鄄匀 辕 悦 锌指结构咱员袁猿暂 遥 宰砸运再 蛋白可以通
过结合启动子序列中的 宰 盒 渊 栽冤 栽郧粤悦悦 渊粤 辕 栽冤和
杂哉砸耘 渊泽怎早葬则鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 糟蚤泽鄄藻造藻皂藻灶贼冤来调控相应基因
的表达咱源 原 缘暂 遥 根据 宰砸运再 结构域的数量及锌指结构
的特征可将其分为为 郧则燥怎责玉尧郧则燥怎责域葬尧郧则燥怎责域遭尧
郧则燥怎责域糟尧郧则燥怎责域凿尧郧则燥怎责域藻 和 郧则燥怎责 芋咱源暂 遥 宰砸运再
基因参与植物生长尧发育和衰老及多种代谢途径袁并且
在调控生物和非生物胁迫过程中起着重要作用咱远 原 愿暂 遥
员怨怨源 年 陨泽澡蚤早怎则燥 等咱怨暂在甘薯渊 陨责燥皂燥藻葬 遭葬贼葬贼葬泽冤中首次
克隆得到 宰砸运再 转录因子 杂孕云员袁此后人们陆续在烟
草咱员园暂 尧 大 麦咱员员暂 尧 棉 花咱员圆暂 尧 拟 南 芥 渊 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽
贼澡葬造蚤葬灶葬冤 咱员猿暂 尧油菜渊月则葬泽泽蚤糟葬 灶葬责怎泽冤 咱员源暂 尧橡胶树渊匀藻增藻葬
遭则葬泽蚤造蚤藻灶泽蚤泽冤 咱员缘暂 尧菊花咱员远暂和小白菜 渊月则葬泽泽蚤糟葬 糟葬皂责藻泽贼则蚤泽
泽泽责援 糟澡蚤灶藻灶泽蚤泽冤 咱员苑暂等多种植物中克隆到 宰砸运再 转录因
子遥
温度是自然界影响植物生长与分布的主要限制因
素之一袁已有研究表明袁一些 宰砸运再 蛋白参与低温胁
迫反 应遥 在澡燥怎 等咱员愿暂 把 大 豆 的 猿 个 转 录 因 子
郧皂宰砸运再员猿尧郧皂宰砸运再圆员 和 郧皂宰砸运再缘源 在拟南芥中
过量表达袁发现过量表达 郧皂宰砸运再圆员 的转基因植株
可以抵抗冷害曰仇玉萍等咱员怨暂用 晕燥则贼澡藻则灶 月造燥贼 证实水稻
中 苑 个 宰砸运再 基因渊韵泽宰砸运再愿袁员圆袁员猿袁员源袁员苑袁圆猿 和
源缘冤能被 源益低温诱导表达曰李立芹咱圆园暂从烟草中获得
与低温胁迫相关的宰砸运再员圆 基因袁且通过 晕燥则贼澡藻则灶 月造燥贼
试验证明袁该基因表达受 源益低温胁迫诱导表达遥 罗
昌国等咱圆员暂对湖北海棠 酝澡宰砸运再源园遭 基因的表达分析
结果显示袁酝澡宰砸运再源园遭 在根尧茎和叶等组织中均有表
达袁并且该基因明显受低温尧高盐和干旱胁迫诱导表
达遥 目前国内尚没有关于核桃 渊 允怎早造葬灶泽 则藻早蚤葬 蕴援 冤
宰砸运再转录因子的研究报道袁尤其是在低温胁迫下的
调控机制遥 核桃是我国重要的坚果和油料树种袁具有
愿愿员员
摇 苑 期 核桃 宰砸运再源 基因的克隆与表达分析
很高的经济价值遥 普通核桃是核桃属中栽培最广的树
种袁但由于其抗寒能力较弱袁低温及其霜冻等会造成花
芽枯死和枝条抽干等袁从而影响了其产量造成经济损
失袁且严重限制了其地理分布遥 本研究选择核桃为试
材袁通过 砸粤悦耘 技术克隆了与低温胁迫相关的核桃
宰砸运再基因 糟阅晕粤 全长序列袁分析了该基因的生物信
息学袁研究该基因在低温胁迫下的表达模式遥 该研究
能够为核桃抗寒分子标记辅助育种提供基因资源袁为
利用基因工程手段培育抗寒新品种奠定基础袁具有重
要的理论意义和实际应用价值遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
植物材料为香玲核桃袁保存在山东泰安国家核桃
板栗资源圃中遥 分别于 圆园员圆 年 员员 月 员缘 日渊非冷适应
期袁日均温 苑益以上冤尧员圆 月 圆缘 日渊冷适应期袁日均温
苑益以下冤和 圆园员猿 年 员 月 圆远 日渊寒冬时期袁温度降到
园益以下冤尧猿 月 远 日渊解除冷适应期袁日均温回升至
苑益以上冤取花芽袁用于研究自然寒冷条件下核桃
宰砸运再基因的表达模式遥 在 猿 月份分别取雌花尧花芽尧
树皮渊韧皮部冤和叶片袁用于检测 宰砸运再 基因在核桃不
同组织器官中的表达情况遥 核桃组培苗以 阅运宰咱圆圆暂作
基本培养基袁附加蔗糖 源园 早窑蕴 原员袁远 原 月粤 员郾 园 皂早窑蕴 原员袁
陨月粤 园郾 园员皂早窑蕴 原员袁琼脂 远 早窑蕴 原员袁责匀 值 缘郾 远 耀 缘郾 愿袁温度
渊圆缘 依 圆冤益袁光照 员远 澡窑凿 原员遥 源益低温处理继代 圆园 凿的
核桃组培苗 园尧圆尧源尧愿 和 圆源 澡袁分别采集叶位相同的叶
片袁用于研究 宰砸运再基因在人工低温胁迫下的表达模
式遥 所有材料取后立即投入液氮冷冻袁随后保存于 原
愿园益冰箱遥
员郾 圆摇 砸晕粤提取和 宰砸运再基因的克隆
以低温处理的核桃叶片为材料袁采用北京天根
栽陨粤晕 郧耘晕 砸晕粤 责造葬灶贼 责造怎泽 砸藻葬早藻灶贼提取 砸晕粤遥 反转录
参照 云藻则皂藻灶贼葬泽 公司说明书进行袁以 韵造蚤早燥渊凿栽冤员愿为引
物合成 糟阅晕粤第一链遥 根据 郧藻灶月葬灶噪 上登录的 宰砸运再
基因氨基酸的保守序列设计简并引物 宰砸运再鄄云孕渊缘忆 原
栽郧郧酝郧晕粤粤砸栽粤再郧郧晕悦粤砸粤粤砸鄄猿忆冤和 宰砸运再鄄砸孕 渊缘忆
原 郧栽砸栽郧再栽栽晕悦悦再栽悦砸栽粤晕郧栽鄄猿忆冤遥 以上述 糟阅晕粤 为
模板进行 孕悦砸 扩增袁 孕悦砸 反应条件院怨源益 预变性 缘
皂蚤灶曰怨源益变性 猿园 泽袁缘园益退火 猿园 泽袁苑圆益延伸 源缘 泽袁猿缘
个循环曰最后 苑圆益延伸 员园 皂蚤灶遥 孕悦砸 产物经 员郾 园豫琼
脂糖凝胶电泳检测袁目的片段进行回收和连接袁转化大
肠杆菌 阅匀缘琢袁菌落 孕悦砸检测后挑取 缘 个阳性菌落送
交上海生工生物公司测序遥 根据已得到的中间区段序
列设计 缘忆 砸粤悦耘 和 猿忆 砸粤悦耘 特异引物 郧杂孕员 渊缘忆 原
郧郧悦郧粤悦郧栽郧郧粤粤郧悦粤粤郧粤郧郧粤郧粤郧郧鄄猿忆冤和 郧杂孕圆 渊缘忆
原 悦悦栽悦栽悦悦栽悦栽栽郧悦栽栽悦悦粤悦郧栽悦郧悦悦鄄猿忆冤分别与通用
引物 哉孕酝 渊缘忆 原 悦栽粤粤栽粤悦郧粤悦栽悦粤悦栽粤栽粤郧郧郧悦粤粤郧鄄
悦粤郧栽郧郧栽粤栽悦粤粤悦郧悦粤郧粤郧栽鄄猿忆冤配对袁进行 缘忆端和 猿忆
端的克隆遥 具体操作参照 悦蕴韵栽耘悦匀 公司的 杂酝粤砸鄄
栽栽酝 砸粤悦耘 糟阅晕粤 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 运蚤贼 说明书进行遥 将所
获得的两端序列和中间区段序列进行拼接袁为了保证
分离出的片段来自同一个基因袁分别在 缘忆端起始密码
子的上游和 猿忆端终止密码子的下游设计特异引物 云员
渊缘忆 原 粤郧郧粤粤栽粤郧粤郧郧郧栽栽粤郧粤郧栽郧粤郧粤粤悦鄄猿忆冤 和 云圆
渊缘忆 原 悦栽粤粤悦粤悦郧郧悦粤栽粤栽粤栽粤郧栽栽郧粤粤郧悦鄄猿忆冤进行全
长 糟阅晕粤 的扩增袁然后将扩增的 阅晕粤 片段连接到
责酝阅员愿 原 栽载体上进行测序袁利用 月蕴粤杂栽 和 阅晕粤酝粤晕
软件进行序列比对袁比较测序结果与拼接结果袁将测序
正确的 宰砸运再鄄糟阅晕粤序列命名为 宰砸运再源遥
员郾 猿摇 核桃 宰砸运再基因的生物信息学分析
用 晕悦月陨 提供的在线 韵砸云 云蚤灶凿藻则 渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援
灶糟遭蚤援 灶造皂援 灶蚤澡援 早燥增 辕 早燥则枣 辕 早燥则枣援 澡贼皂造冤寻找基因的开放阅
读框渊韵砸云冤曰用 月蕴粤杂栽 渊 澡贼贼责院 辕 辕 遭造葬泽贼援 灶糟遭蚤援 灶造皂援 灶蚤澡援
早燥增冤 进行核苷酸及氨基酸序列的同源序列搜索曰用
阅晕粤酝粤晕软件进行序列翻译比对及构建系统进化树遥
用 孕则燥贼孕葬则葬皂 渊 澡贼贼责院 辕 辕 怎泽援 藻曾责葬泽赠援 燥则早 辕 贼燥燥造泽 辕 孕则燥贼孕葬则葬皂援
澡贼皂造冤 预测编码蛋白的分子量尧等电点等理化特性曰通
过 孕则燥贼杂糟葬造藻 软件 渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 藻曾责葬泽赠援 燥则早 辕 糟早蚤遭蚤灶 辕
责则燥贼泽糟葬造藻援 责造冤进行疏水性 辕亲水性分析遥
员郾 源摇 荧光定量 孕悦砸表达分析
提取不同处理材料的总 砸晕粤袁反转录合成 糟阅晕粤遥
以反转录 糟阅晕粤 为实时荧光定量 孕悦砸 的模板袁采用
粤月陨苑缘园园 实时定量 孕悦砸 仪进行荧光定量 孕悦砸 扩增遥
荧光 定 量 孕悦砸 引 物 分 别 为 匝憎鄄云 渊 缘忆鄄悦粤粤悦鄄
粤郧粤栽悦悦悦粤粤粤郧悦栽郧栽悦粤栽粤粤悦鄄猿忆冤 和 匝憎鄄砸 渊 缘忆 原
粤粤悦悦栽郧栽悦栽悦栽栽栽粤粤郧悦粤郧栽郧粤悦栽郧鄄猿忆冤袁扩增片段为
员缘园 遭责遥 员愿杂基因作为内参袁引物分别为 员愿杂鄄云渊缘忆 原
郧郧栽悦粤粤栽悦栽栽悦栽悦郧栽栽悦悦悦栽栽鄄猿忆冤 和 员愿杂鄄砸 渊 缘忆 原
栽悦郧悦粤栽栽栽悦郧悦栽粤悦郧栽栽悦栽栽鄄猿忆冤袁扩增片段为 员怨愿 遭责遥
方法参照荧光定量试剂盒 杂再月砸 孕则蚤皂藻 杂糟则蚤责贼栽酝 砸栽鄄
孕悦砸 运蚤贼渊栽葬运葬砸葬冤说明书袁每处理重复 猿 次遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 宰砸运再源 基因的克隆和序列分析
利用简并引物渊宰砸运再鄄云孕 和 宰砸运再鄄砸孕冤扩增出
约为 苑园园 遭责 的单一条带 渊图 员冤遥 用 缘忆砸粤悦耘 和 猿忆
怨愿员员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
砸粤悦耘特异引物进行 缘忆和 猿忆端扩增袁结果获得了约
员 猿园园 遭责的 缘忆端片段和 怨园园 遭责的 猿忆端片段渊图 员冤遥 测
序结果表明中间片段长度为 远愿猿 遭责袁缘忆端片段 员 猿园员
遭责袁猿忆端片段 愿怨愿 遭责遥 利用 阅晕粤酝粤晕 软件袁将 缘忆和 猿忆
端序列与中间片段进行拼接袁得到了一条长度为 圆 员苑源
遭责的 糟阅晕粤序列遥 根据拼接好的序列设计引物 云员 和
砸员 对 宰砸运再源 编码区进行扩增袁得到一条约 员 苑园园 遭责
的特异带袁与预期结果一致渊图 员冤遥 回收目的条带袁插
入 责酝阅员愿 原 栽克隆载体袁转化大肠杆菌 阅匀缘琢袁获得阳
性重组质粒袁测序结果表明该基因编码区序列长 员 缘缘源
遭责袁与拼接结果序列完全一致袁证明了克隆的 猿 个片段
注院酝援 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员援 宰砸运再源 基因保守区段扩增产物曰 圆郾 缘忆砸粤悦耘 孕悦砸扩增产物曰 猿郾 猿忆砸粤悦耘 孕悦砸扩增产物曰
源援 宰砸运再源 基因全长 孕悦砸扩增产物遥
晕燥贼藻院酝援 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员援 悦燥灶泽藻则增藻凿 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 宰砸运再源曰 圆援 孕悦砸 责则燥凿怎糟贼 燥枣 缘忆砸粤悦耘曰 猿援 孕悦砸 责则燥凿怎糟贼 燥枣 猿忆砸粤悦耘曰
源援 栽澡藻 孕悦砸 责则燥凿怎糟贼 燥枣 枣怎造造 造藻灶早贼澡 燥枣 宰砸运再源援
图 员摇 宰砸运再源 基因 孕悦砸扩增产物电泳分析
云蚤早援 员摇 耘造藻糟贼则燥责澡燥则藻泽蚤泽 燥枣 葬皂责造蚤枣蚤藻凿 责则燥凿怎糟贼 燥枣 宰砸运再源 早藻灶藻
确实来自于同一个基因遥 用 韵砸云 云蚤灶凿藻则 分析表明袁该
基因 糟阅晕粤全长为 圆 员苑源 遭责袁包含 员 个 员 缘缘源 遭责的完整
开放阅读框序列渊韵砸云冤袁起始密码子为 粤栽郧袁终止密
码子为 栽粤粤袁包括 圆园愿遭责的 缘忆非翻译区渊缘忆 原 哉栽砸冤和
源员圆遭责的 猿忆非翻译区渊猿忆 原 哉栽砸冤袁共编码 缘员苑 个氨基
酸遥 核苷酸序列分析发现该 糟阅晕粤 序列含有两个
宰砸运再保守结构域和 圆 个 悦圆匀圆 不同的锌指基序渊图圆冤袁一个是 悦鄄载源 原 悦鄄载圆圆 原 匀鄄载员 原 匀袁另一个是 悦鄄载源 原悦鄄载圆猿 原 匀鄄载员 原 匀袁表明其属于第玉类 宰砸运再 家族成
员遥 孕则燥贼孕葬则葬皂 软件分析显示其分子式为 悦源远源怨 匀苑苑源远
晕员缘缘源韵员怨园员杂猿愿源袁分子量为 员圆愿郾 员源 噪阅葬袁等电点为 源郾 怨远袁不
稳定系数为 源苑郾 园圆袁属于不稳定蛋白遥 亲水性平均数
为 园郾 怨园愿袁预测该蛋白为疏水性蛋白遥 通过 孕则燥贼杂糟葬造藻
软件对蛋白质整体分析显示袁疏水性氨基酸均匀分布
在整个多肽链中袁推测该编码蛋白是一个疏水性蛋白袁
与 孕则燥贼孕葬则葬皂 软件预测结果一致遥 利用 晕悦月陨 网站
月蕴粤杂栽进行序列比对袁该 糟阅晕粤 序列与其它植物的
宰砸运再 基因具有较高的相似性袁与中国李 渊 孕则怎灶怎泽
泽葬造蚤糟蚤灶葬冤尧 葡 萄 渊 灾蚤贼蚤泽 贼澡怎灶遭藻则早蚤蚤 冤 和 蓖 麻 渊 砸蚤糟蚤灶怎泽
糟燥皂皂怎灶蚤泽冤 宰砸运再 基因渊 允晕远苑缘苑园愿郾 员尧粤酝愿愿远员远远郾 员 和
载酝赃园园圆缘圆怨怨苑愿郾 员冤 的核苷酸序列相似性分别为 苑怨豫 尧
苑愿豫 和 苑远豫 袁氨 基 酸 序 列 相 似 性 分 别 为 苑园豫 尧
远怨豫 和 苑园豫 遥 这表明分离得到的 糟阅晕粤 序列是核桃
宰砸运再基因袁将其命名为 宰砸运再源袁郧藻灶月葬灶噪 登录号为
运悦苑怨缘缘缘员郾 员遥
圆郾 圆摇 宰砸运再源 编码氨基酸的同源性与系统进化分析
利用 月蕴粤杂栽程序在 郧藻灶月葬灶噪上进行搜索袁获得了
与 宰砸运再源 具有较高相似性的同源基因袁 利用
阅晕粤酝粤晕软件对 员猿 个不同物种的宰砸运再类转录因子
氨基酸序列进行多重比对袁结果显示 宰砸运再源 与中国李
渊 粤耘匝圆愿苑远园郾 员 冤尧 蓖 麻 渊 载孕 赃 园园圆缘猿园园圆源郾 员 冤尧 苹 果
园怨员员
摇 苑 期 核桃 宰砸运再源 基因的克隆与表达分析
渊粤阅蕴猿远愿缘圆郾 员 冤 和大豆 渊 载孕 赃 园园猿缘缘员苑源怨郾 员 冤 等的
宰砸运再氨基酸均具有典型的 圆 个 宰砸运再 保守结构域
和 悦圆匀圆 锌指结构域袁属于 宰砸运再家族的第玉类成员袁
且在保守结构域高度同源渊图 猿冤遥 说明 宰砸运再源 基因
是典型的 宰砸运再家族成员遥
为了进一步分析 宰砸运再源 与其它 宰砸运再类转录因
子的亲缘关系袁根据这 员猿 个 宰砸运再基因的氨基酸序列
构建系统进化树渊图 源 冤袁系统进化关系表明袁该蛋白
与来自于蔷薇科的中国李 渊 粤耘匝圆愿苑远园郾 员 冤尧苹果
渊粤阅蕴猿远愿缘圆郾 员冤和草莓渊载孕赃园园源猿园源圆远苑郾 员冤的转录因子
宰砸运再聚在一起袁说明其亲缘关系最近袁与豆科大豆
和苜蓿的 宰砸运再亲缘关系次之遥
圆郾 猿摇 宰砸运再源 基因的时空表达模式
以 员愿杂为内参袁对核桃 宰砸运再源 基因自然越冬条件
下在花芽中的表达情况和在 源益低温胁迫处理下叶片
中的表达模式进行了初步研究遥 结果如图 缘 所示院在
自然条件下 员圆 月份花芽中 宰砸运再源 基因表达量达到最
高丰度袁次年 员 月份表达量开始下降袁猿 月份表达量明
显降低袁这可能与气温的升高有关系遥 源益低温处理叶
片 圆 澡后袁叶片中 宰砸运再源 基因的表达量迅速升高袁达
到最大表达量袁处理 源尧愿 和 圆源澡 后表达量没有明显变
化袁但表达量均比对照时期 渊园 澡冤高 渊图 远冤遥 说明
宰砸运再源 基因能够在低温胁迫的早期响应这一生理过
程遥
采用实时荧光定量 孕悦砸的方法袁以 员愿杂基因为内
参袁对核桃不同组织器官中 宰砸运再源 基因的表达情况进
行了分析袁结果表明院在树皮渊韧皮部冤中表达量最高袁
其次为雌花和叶片袁花芽中表达量最低遥 虽然在核桃
的树皮渊韧皮部冤尧叶片尧雌花和花芽中都有 宰砸运再源 基
因的表达袁但是不同组织器官中的表达量存在差异袁表
明 宰砸运再源 基因在核桃中具有组织表达特异性渊图 苑冤遥
猿摇 讨论
宰砸运再是植物特有的一类转录因子袁不同物种
宰砸运再家族成员的多少及序列特征存在较大差异袁拟
南芥基因组中约有 苑源 个 宰砸运再基因袁水稻基因组已明
确 员园缘 个完整的 宰砸运再 基因袁苜蓿共有 圆愿 个 宰砸运再
基因咱员猿袁 圆猿 原 圆源暂 遥 根据 宰砸运再结构域的数目和锌指结构
的特征可将 宰砸运再转录因子分为 猿 类院玉类含有 圆 个
宰砸运再结构域袁其锌指结构类型为 悦圆匀圆 渊悦鄄载源 原缘 原 悦鄄
载圆圆 原 圆猿 原 匀鄄载员 原 匀冤咱员暂 曰域类与芋类都只含有一个宰砸运再结构域袁域类锌指结构与玉类相同袁都为 悦圆匀圆
型袁而芋类锌指结构为 悦圆 原 匀悦渊悦鄄载苑 原 悦鄄载圆猿 原 匀鄄载员
注院灰色区域为 宰砸运再转录因子的特征序列 宰砸运再郧匝运曰方框内是起
始密码子渊粤栽郧冤和终止密码子渊栽粤粤冤曰下划线部分是锌指结构域悦圆匀圆 袁 其中 悦和 匀残基用方框标出遥晕燥贼藻院 栽澡藻 早则葬赠 葬则藻葬 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡藻 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤泽贼蚤糟 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 宰砸运再郧匝运蚤灶 贼澡藻 宰砸运再 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则曰 贼澡藻 蚤灶蚤贼蚤葬贼蚤燥灶 糟燥凿燥灶 渊 粤栽郧 冤 葬灶凿贼藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 糟燥凿燥灶 渊 栽粤粤冤 憎藻则藻 造葬遭藻造藻凿 遭赠 遭燥曾曰 贼澡藻 糟燥灶泽藻则增藻凿 悦圆匀圆凿燥皂葬蚤灶 憎葬泽 澡蚤早澡造蚤早澡贼藻凿 遭赠 葬灶 怎灶凿藻则造蚤灶藻 蚤灶 憎澡蚤糟澡 贼澡藻 皂燥贼蚤枣 悦圆匀圆 憎葬泽造葬遭藻造藻凿 遭赠 遭燥曾援
图 圆摇 核桃 宰砸运再源 基因的 糟阅晕粤
序列及编码的氨基酸序列云蚤早援 圆摇 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶凿 贼澡藻 藻灶糟燥凿藻凿 葬皂蚤灶燥葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 宰砸运再源 蚤灶 允怎早造葬灶泽 则藻早蚤葬 蕴援
员怨员员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
注院下划线所示 宰砸运再保守结构域遥
晕燥贼藻院栽澡藻 怎灶凿藻则造蚤灶藻 则藻早蚤燥灶 泽澡燥憎藻凿 糟燥灶泽藻则增藻凿 凿燥皂葬蚤灶援
图 猿摇 宰砸运再源 和其它宰砸运再类转录因子蛋白的保守结构域比对
云蚤早援 猿摇 粤造蚤早灶皂藻灶贼 燥枣 贼澡藻 糟燥灶泽藻则增藻凿 凿燥皂葬蚤灶 燥枣 宰砸运再源 葬灶凿 宰砸运再 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 燥贼澡藻则 责造葬灶贼泽
原 悦冤型咱圆缘暂 遥 研究表明最初的转录因子表现形式是第
玉类 宰砸运再转录因子袁通过分裂或者丢失过渡到第域
类袁可能是通过锌指结构中的 匀转变成 悦 残基形成第
芋类遥 在各类 宰砸运再 基因家族中袁第玉类最为保守袁
是最原始的的 宰砸运再 类型袁第域类较保守袁第芋类进
化最活跃咱猿袁 圆远暂 遥 本研究应用 砸粤悦耘 技术从 源益低温诱
导的核桃叶片中克隆得到了核桃 宰砸运再 基因袁这是首
次从核桃中克隆得到 宰砸运再 家族成员遥 初步分析表
明袁该基因具有典型 宰砸运再型转录因子具备的 宰砸运再
结构域及 悦圆匀圆 型锌指结构袁属于最古老的第玉类宰砸运再转录因子袁命名为 宰砸运再源遥 系统进化分析表明
该蛋白与其它物种间的同源性较高袁与来自于蔷薇科
的中国李尧苹果和草莓亲缘关系最近遥
宰砸运再基因能广泛参与植物的生物胁迫和非生
物胁迫反应袁研究表明 宰砸运再基因在植物体内是诱导
型表达的咱员猿暂 遥 匀怎葬灶早 等咱圆苑暂在茄科植物基因组中克隆
到了抗冻蛋白 宰砸运再袁晕燥则贼澡藻则灶 遭造燥贼泽 检测表明其只在
员员 月至 员圆 月的植物叶片中表达袁表明其受低温环境
圆怨员员
摇 苑 期 核桃 宰砸运再源 基因的克隆与表达分析
注院 允糟院 麻 疯 树 渊 粤郧允缘圆员缘圆郾 员 冤曰 砸糟院 蓖 麻 渊 载孕 赃
园园圆缘猿园园圆源郾 员冤曰 栽糟院 可可 渊 耘韵再园猿缘缘圆郾 员 冤曰 郧澡院 陆地 棉
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图 源摇 核桃宰砸运再源 与不同物种
宰砸运再蛋白的系统进化分析
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燥贼澡藻则 宰砸运再 责则燥贼藻蚤灶 枣则燥皂 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 责造葬灶贼 泽责藻糟蚤藻泽
诱导表达曰大麦 匀增宰砸运再猿愿 基因通过非 粤月粤依赖的途
径早期暂时上调表达袁但是在冰冻条件和干旱的条件
下袁该转录因子却会持续地上调表达袁表明了它在非生
物胁迫调节方面的作用咱圆愿暂 遥 宰砸运再 家族转录因子在
植物响应外界环境胁迫中起着重要的调控作用袁并且
能被非生物逆境因子诱导表达袁因此研究核桃 宰砸运再源
基因在低温胁迫下的表达模式有助于了解核桃
宰砸运再源 基因的功能袁还可为寻找核桃抗寒基因奠定基
础遥 本研究中核桃 宰砸运再源 基因在 源益低温胁迫下均
有不同程度的上调表达袁并且在处理 圆 澡 后达到最大
图 缘摇 宰砸运再源 基因在自然低温条件下的表达模式
云蚤早援 缘摇 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 宰砸运再源 早藻灶藻 怎灶凿藻则
灶葬贼怎则葬造 造燥憎 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻
图 远摇 源益低温处理 宰砸运再源 基因的表达
云蚤早援 远摇 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 宰砸运再源 早藻灶藻 遭赠 源益 糟燥造凿 贼则藻葬贼皂藻灶贼泽
表达量袁说明核桃 宰砸运再源 基因受低温胁迫的诱导表
达袁而且能快速的响应低温胁迫遥 研究表明 韵泽宰砸运再
转录因子家族成员中有 员苑 个是寒冷诱导的袁而且大部
分都是早期应答响应基因咱 圆怨暂 遥 利用实时荧光定量分
析 悦泽宰砸运再源远 和 悦泽宰砸运再圆员 均响应低温胁迫袁且被诱
导上调表达咱猿园暂 遥 核桃花芽中 宰砸运再源 基因在自然低温
条件下的表达模式表明袁严冬时期渊员圆 月份冤宰砸运再源
基因的表达量最高袁圆园员圆 年 员员 月至 圆园员猿 年 员 月
宰砸运再源 基因在花芽中的表达量高于 圆园员猿 年 猿 月份袁
可能是由于气温的回升导致表达量下降袁表明 宰砸运再源
受低温诱导表达袁并且参与信号转导途径中的早期基
猿怨员员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
图 苑摇 宰砸运再源 基因在组织中的表达
云蚤早援 苑摇 栽蚤泽泽怎藻泽 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 宰砸运再源 早藻灶藻
因调控袁在受到外界胁迫时能快速大量表达遥 这与已
报道平榛 悦澡宰砸运再员 基因咱猿员暂 尧辣椒 悦葬宰砸运再员 基因咱猿圆暂
在低温胁迫下的表达模式相似袁说明 宰砸运再源 基因可能
在适应寒冷环境中起一定的作用遥 宰砸运再 基因表达
除具有快速瞬时特点袁还具有组织特异性袁在植物的不
同器官如根尧茎尧叶尧花尧果实和维管组织中发现都有相
关 宰砸运再基因的表达袁且表达量有所不同咱猿猿 原 猿源暂 遥 利用
实时荧光定量 孕悦砸 的方法对 在皂宰砸运再猿猿 的表达谱进
行分析袁结果显示袁在玉米的根尧茎尧叶尧雄蕊尧雌蕊尧幼
嫩的籽粒中均有表达袁但在根中的表达量最高咱猿缘暂 遥 王
学兰等咱猿远暂利用 择砸栽鄄孕悦砸 分析各组织部位的表达情
况袁发现 宰砸运再远愿 在拟南芥根中的表达量是最高的袁其
次是幼嫩的叶片和老的荚果中遥 本研究 宰砸运再源 基因
组织表达分析结果显示在核桃 源 个不同组织中均有表
达袁但表达量不同袁且在树皮渊韧皮部冤中的表达量最
高袁其次是雌花和叶片袁在花芽中的表达量相对最少袁
表明 宰砸运再源 基因的表达具有明显的组织特异性遥
源摇 结论
本研究利用 砸栽鄄孕悦砸 和 砸粤悦耘 技术克隆了核桃
宰砸运再基因 糟阅晕粤全长序列袁命名为 宰砸运再源袁序列分析
表明 宰砸运再源 属于 宰砸运再 基因家族第玉类成员遥 实时
荧光定量 孕悦砸 分析表明 宰砸运再源 受低温诱导表达遥
宰砸运再源 在树皮渊韧皮部冤尧雌花尧花芽和叶片中均有表
达袁在树皮中表达量最高遥 研究结果可为核桃抗寒基
因工程育种提供基因资源遥
参考文献院
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摇 苑 期 核桃 宰砸运再源 基因的克隆与表达分析
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砸藻责燥则贼泽袁 圆园员圆袁 猿怨渊源冤院源缘缘猿 原 源缘远源
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圆园园愿袁 远渊缘冤院 源愿远 原 缘园猿
咱员怨暂摇 仇玉萍袁 荆邵娟袁 付坚袁 李璐袁 余迪求援 员猿 个水稻 宰砸运再 基因
的克隆及其表达谱分析咱 允暂 援 科学通报袁 圆园园源袁 源怨渊员愿冤院员愿远园 原
员愿远怨
咱圆园暂摇 李立芹援 烟草 宰砸运再员圆 基因的分离尧表达与多克隆抗体的制备
咱允暂 援 核农学报袁 圆园员员袁 圆缘渊猿冤院源远员 原 源远愿
咱圆员暂摇 罗昌国袁 渠慎春袁 张计育袁 王三红袁 乔玉山袁 张仕杰袁 刘丹袁 章
镇援 湖北海棠 酝澡宰砸运再源园遭在几种胁迫下的表达分析咱 允暂 援 园艺
学报袁 圆园员猿袁 源园渊员冤院员 原 怨
咱圆圆暂摇 阅则蚤增藻则 允 粤袁 运怎灶蚤赠怎噪蚤 粤 匀援 陨灶增蚤贼则燥 责则燥责葬早葬贼藻 燥灶 责葬则葬凿燥曾 憎葬造灶怎贼
则燥燥贼泽贼燥糟噪 咱允暂 援 匀燥则贼 杂糟蚤藻灶糟藻袁 员怨愿源袁 员怨渊源冤院缘园苑 原 缘园怨
咱圆猿暂摇 在澡葬灶早 在 蕴袁 载蚤藻 在袁 在燥怎 载 蕴袁 悦葬泽葬则藻贼贼燥 允袁 阅葬增蚤凿 匀袁 杂澡藻灶 允援 粤 则蚤糟藻
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泽蚤早灶葬造蚤灶早 责葬贼澡憎葬赠 蚤灶 葬造藻怎则燥灶藻 糟藻造造泽 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 圆园园源袁
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咱圆源暂摇 江腾袁 林勇祥袁 刘雪袁 江海洋袁 朱苏文援苜蓿全基因组 宰砸运再转
录因子基因的分析咱允暂 援 草业科学袁 圆园员员袁 圆园渊猿冤院圆员员 原 圆员愿
咱圆缘暂摇 悦澡藻灶 悦袁 悦澡藻灶 在援 陨泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 贼憎燥 责葬贼澡燥早藻灶鄄葬灶凿
泽葬造蚤糟赠造蚤糟 葬糟蚤凿鄄蚤灶凿怎糟藻凿 早藻灶藻泽 藻灶糟燥凿蚤灶早 宰砸运再 阅晕粤 遭蚤灶凿蚤灶早 责则燥贼藻蚤灶泽
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遭蚤贼贼藻则泽憎藻藻贼 灶蚤早澡贼泽澡葬凿藻袁 杂燥造葬灶怎皂 凿怎造糟葬皂葬则葬 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 酝燥造藻糟怎造葬则
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咱圆愿暂摇 酝葬则藻 悦袁 酝葬扎扎怎糟燥贼藻造造蚤 耘袁 悦则燥泽葬贼贼蚤 悦袁 云则葬灶糟蚤葬 耘袁 杂贼葬灶糟葬 粤 酝袁
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咱圆怨暂摇 孕藻灶早 再袁 月葬则贼造藻赠 蕴 耘袁 悦葬灶造葬泽 孕袁 砸燥灶葬造凿 孕 悦援 韵泽宰砸运再 陨陨葬
贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则泽 皂燥凿怎造葬贼藻 则蚤糟藻 蚤灶灶葬贼藻 蚤皂皂怎灶蚤贼赠咱允暂 援 砸蚤糟藻袁圆园员园袁
猿院 猿远 原 源圆
咱猿园暂摇 张颖援 黄瓜低温胁迫应答转录因子 悦泽宰砸运再源远 和 悦泽宰砸运再圆员 的
表达特征与功能分析咱阅暂援北京院中国农业科学院袁圆园员圆
咱猿员暂摇 赵天田袁 王贵禧袁 梁丽松袁 马庆华袁 陈新援 平榛 悦澡宰砸运再员 转录
因子的克隆及表达模式分析咱 允暂 援 核农学报袁 圆园员圆袁 圆远渊圆冤院圆猿愿
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