全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 0120054206
收稿日期 :2008204221 　接受日期 :2008206217
基金项目 :国家自然科学基金 (编号 10475041)
作者简介 :岳洁瑜 (19822) ,女 ,安徽阜阳人 ,博士研究生 ,主要从事作物遗传育种研究。E2mail :yueshan1982 @1631com
通讯作者 :唐灿明 (19652) ,男 ,江苏靖江人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事作物遗传育种研究。E2mail :cmtang @yahoo. cn
N + 离子注入陆地棉花粉对胚珠 DNA 及
M1 代 cDNA 表达的影响
岳洁瑜1 　杨郁文2 　于艳杰1 　倪万潮2 　吴李君3 　唐灿明1
(11 南京农业大学农学院 ,江苏 南京　210095 ;21 江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所 ,江苏 南京　210014 ;
31 中国科学院等离子体物理研究所 ,安徽 合肥　230031)
摘 　要 :通过对胚珠 DNA 的 SSR 标记分析 ,在 DNA 水平上检测氮离子束诱变后胚珠的多态性变化 ,结果
表明 ,离子注入陆地棉花粉后再授粉雌蕊 ,会对胚珠的 DNA 多态性产生影响 ,表明在一定程度上改变了
花粉中精细胞的 DNA 序列 ;利用抑制性消减杂交 (SSH)分离 N + 离子诱变花粉和正常花粉 (对照)分别给
雌蕊授粉后产生的 M1 代植株叶片间表达有差异的 cDNA 片段 ,建立差异表达 cDNA 文库。已测序的有
50 个缩减 cDNA 克隆 ,根据 BLAST网络服务检索查询 EMBL、Gen Bank、DDBJ 和 PDB 的核苷酸序列数据
库以及蛋白质氨基酸序列数据库 ,进行序列联配 ,结果发现 52 %序列在数据库中都有同源的棉属来源
的 EST。38 个 EST与其他物种已知基因部分区域的同源性为 56 %～100 % ,占总 EST的 76 % ;5 条 EST
序列能在数据库中检索到同源性序列 ,但其功能 (占 10 %)尚不清楚 ;9 个 EST能在数据库中发现为推测
蛋白 ,占 18 % ;4 个 EST在 GenBank 中没有查到对应的同源序列 ,占 8 %。
关键词 :抑制性消减杂交 (SSH) ; SSR 分子标记 ; N + 离子注入 ; 陆地棉
EFFECTS OF N+ ION IMPLANTATION INTO POLLEN OF UPLAND COTTON ( Gossypium
hirsutum L. ) ON THE EXPRESSION OF OVULE DNA AND THE cDNA FRAGMENTS OF M1 PROGENY
YUE Jie2yu1 　YANG Yu2wen2 　YU Yan2jie1 　NI Wan2chao2 　WU Li2jun3 　TANG Can2ming1
(11 College of Agronomy , Nanjing Agricultural University , Nanjing ,Jiangsu 　210095 ;
21 Institute of Agro2biotechnology , Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing ,Jiangsu 　210014 ;
31 Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering , Institute of Plasma Physics , Chinese Academy of Sciences , Hefei , Anhui 　230031)
Abstract :The SSR2based molecular markers technique was used to determine the polymorphism change of ovule DNA of
Gossypiom hirsutum L. after N + ion implantation. The results showed that the ovule DNA polymorphism were changed , which
indicated that the DNA sequences of sperm cell were altered. The ovule was developed after the pistils were pollinated by the
pollen grains which had been implanted with nitrogen ions. The suppressive subtraction hybridization (SSH) technique was
used to isolate the cDNA fragments that showed differential expression between the M1 progeny developed after the pistils were
pollinated by the pollen grains implanted with nitrogen ions and the nature ”Sumian 22”as control . Two differential expression
cDNA libraries were constructed using the cDNAs of the treated M1 progeny as driver and the cDNAs of untreated M1 progeny
as tester , vice versa. The results demonstrated that the insertion fragments of SSH library were ranging from 450 to 700 bp . 50
clones were randomly picked for PCR and sequencing. After matching the results in GenBank dbEST and the Blastn , 50
sequences were obtained. Of them , 38 of them had 56 %～100 % similarity with known genes , which was 76 % of the total
EST;5 sequences had their homology with the sequences in GenBank with unknown function , which was 10 % of the total
45　 核 农 学 报　2009 ,23 (1) :54～59Journal of Nuclear Agricultural Sciences
EST; 9 were hypothetical protein , which was 18 % of the total EST; 4 had no similarity with the sequences in GenBank ,
which might be new genes ;or the gene could not search the similarity with the sequences of other species , because the
sequences located in the easy2varied 3’2end , which was 8 % of the total EST.
Key words :suppressive subtraction hybridization (SSH) ; SSR2based molecular marker ; N+ ions implantation ; upland cotton
( Gossypium hirsutum L. )
　　诱变技术能使植物在原有遗传背景基本不变的情
况下出现性状变异 ,且突变性状稳定较快 ,从而加速育
种进程[1 ] 。作为诱变技术 ,离子束诱变育种发展近 20
年来已对不同作物在不同层次如细胞、生理生化、染色
体、核酸等方面开展了比较全面的研究[1～4 ] ,在创造新
种质和改良作物品质方面取得了重要进展[5 ] 。郑冬官
等[6 ] 分别采用氮离子和氩离子注人棉花干种子 ,并对
其后代的早熟性、株型、主茎高度和茎粗以及陆地棉与
海岛棉种间杂种性状变异进行了研究 ,发现离子注人
使棉花品种 (系)的形态特征或生育特性发生了一些对
选育新品种有用的突变 ,证实了离子注入这种新诱变
方式对棉花的诱变效应。离子注入诱变机理方面也取
得一定进展 ,虽然荷能离子在晶体和无定型固体中的
射程较近 ,30keV N + 的射程不足 012μm ,但在注入生物
样品时却可以达到种皮以内 30μm 以上的深度而直接
作用于胚部 ,并引起生物效应[7 ] 。随着剂量的增加 ,种
子存活率呈现降 - 升 - 降的波动变化趋势[8 ] ,这不同
于其他的辐照手段 ,如γ射线、中子等呈现线性或肩型
下降的趋势[9 ] 。但有关离子注入细胞后 ,细胞在活力、
结构、代谢及分裂方面的变化尚缺少研究 ,尤其是低能
离子注入细胞导致植物细胞遗传物质发生改变的机理
是个非常复杂的问题[10 ] ,目前还未能得出明确结论。
抑制性消减杂交技术 (SSH) 是由 Diatchenko 等[11 ]
于 1996 年以 mRNA 差别显示技术为基础建立起来的
筛选未知差异表达基因的新技术 ,已被广泛用于基因
差异表达方面的研究[12～14 ] ,它具有假阳性率低、敏感
性高、差异基因分离速度快等特点[11 ] 。离子注入细胞
虽能获得明显的诱变效应 ,但离子与细胞间的作用机
理尚不清晰 ,特别是离子注入处理对细胞 DNA 变异及
基因表达水平的影响尚少见报道。本试验通过对胚珠
DNA 的 SSR 标记分析 ,在 DNA 水平上检测氮离子束诱
变后的多态性变化 ; 通过抑制消减杂交技术 ,获得 N+
离子束诱变陆地棉花粉后 M1 代特异表达的 cDNA 片
段 ,构建 cDNA SSH文库 ,在 mRNA 水平上检测氮离子
束的诱变效应。旨在为进一步从分子水平上揭示 N+
离子束诱变的机理提供理论依据。
1 　材料与方法
111 　材料及其处理
陆地棉品种苏棉 22 号 ,种植于合肥市中国科学院
等离子体研究所内 ,常规栽培管理。2006 年 8 月中
旬 ,每天下午 4 :30 左右对将于第 2 天开放的花蕾去
雄 ,第 2 天上午将雄蕊上的花粉轻轻用手指弹在直径
为 9 厘米的玻璃培养皿中 ,使花粉粒薄薄的一层铺于
培养皿底部 ,尽量使花粉粒不重叠 ,N + 注入能量为
20keV ,注量为 0126 ×1016 、0139 ×1016 、0152 ×1016 、0178
×1016N + Πcm2 ,重复处理 3 次。以自然花粉作为对照 ,
将自然花粉和 N + 处理过的花粉分别在田间给去雄的
雌蕊授粉 (此母本为来自自交系的同一个单株) ,授粉
1 周后 ,分别取注量为 0139 ×1016 N + Πcm2 的氮离子处
理花粉和对照花粉授粉后形成的胚 ,用剪刀和解剖针
取出其中的胚珠 ,备用。10 月收获处理花粉及未处理
自然花粉授粉后形成的种子 ,于 2007 年种植于江苏省
农业科学院遗传所实验室内 ,常规栽培管理。
112 　胚珠 DNA的 SSR分析
11211 　棉花基因组 DNA 的分离纯化 　棉花基因组
DNA 提取采用 CTAB 法[15 ] ,并根据实际情况稍加修
改。
11212 　SSR 扩增　选用引物 500 对 ,序列编号来自于
Cotton DB 数据库 (http :ΠΠalgodon. tamu. eduΠhtdocs2cottonΠ
cottondb. html) 的 BNL (Brookhaven National Laboratory) 和
南京农业大学。由上海 Invitrogen 公司合成。PCR 反
应 体 系 : 67mmolΠL Tris2HCl ( pH818 ) , 16mmolΠL
(NH4 ) 2 SO4 ,01002 %明胶 ,012mmolΠL dNTPs ,215mmolΠL
MgCl2 , 正向引物和反向引物各 016 μmolΠL , 0125U
TaqDNA 聚合酶 (南京天为时代公司产品) ,模板基因
组 DNA 20ng。反应程序为 :95 ℃变性 2min ;94 ℃变性
40s ,57 ℃退火 45s ,72 ℃延伸 60s ,30 个循环 ;72 ℃延伸
7min。
11213 　扩增产物的 PAGE 电泳和银染检测 　扩增产
物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,凝胶浓度 8 % ,凝胶
大小为 180 ×120 ×2mm ,电泳缓冲液为 1 ×TBE ,恒压
电泳。电泳结束后 ,凝胶用蒸馏水稍微冲洗。按常规
55　1 期 N + 离子注入陆地棉花粉对胚珠 DNA 及 M1 代 cDNA 表达的影响
方法进行银染[16 ] 。
113 　M1 代植株叶片 SSH分析
11311 　 mRNA 的 分 离、纯 化 　 按 照 CTAB
(cetyltrimethylammonium bromide , CTAB) 法[17 ]提取棉花
叶片中的总 RNA ,mRNA 按 QIAGEN 试剂盒 Oligotex 方
法从总 RNA 中分离。检测 mRNA 样品的浓度、纯度与
完整性 ,用 DEPC 处理过的水将 mRNA 的终浓度调至
015μgΠμl。
11312 　抑制消减杂交与 SSH cDNA 文库的构建　抑制
消减杂交具体操作依照 Clontech 公司的 PCR2Select TM
cDNA Subtraction Kit 进行。以 N + 离子诱变的材料作为
试验方 (tester) ,以未处理的材料作为驱动方 (driver)进行
正向杂交 ;以未处理的材料作为试验方 (tester) ,以 N+ 离
子诱变的材料作为驱动方 (driver)进行反向杂交。通过
cDNA 双链合成 ,Rsa I酶消化 ,试验方 (tester) cDNA 片段
两端特殊接头连接 ,通过两次杂交和两次选择性 PCR
扩增 ,富集差异表达基因片段。SSH 产物按 QIANEN
PCR纯化试剂盒的方法纯化浓缩后 ,与 pGEM2T 载体
(Promega 公司)连接 ,采用电激法 ,转化于 DHα52 感受态
细胞中 ( E. coli) ,在含氨苄青霉素的 LBΠX2galΠIPTG平
板上经 37 ℃过夜培养 ,挑取白斑菌落于LB 液体培养基
中 进 行 振 荡 过 夜 培 养。采 用 NP1 引 物 ( 5′2
TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT23′) 和 NP2 引 物 ( 5′2
AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT23′)进行 PCR ,1 %的琼脂糖
凝胶电泳检测 ,用 ABI377 测序仪 ( Invitrogen 公司)测序。
11313 　DNA 同源序列的检索与比较分析　测序结果
去除 载 体 和 接 头 序 列 后 , 在 National Center for
Biotechnology Information (http :ΠΠwww. ncbi . hlm. nih. govΠ
BLAST) 的核酸数据库 [ BLASTN ] 和蛋白数据库
[BLASTX]中进行同源核苷酸和蛋白序列检索。参照
水稻、拟南芥等的 EST研究判定 EST功能。比较后确
定的功能未知的 EST 再与 GenBank 的 EST 库进行
BLASTn 比较 ,了解该 EST与哪些片段同源及这些片段
的来源等信息。
2 　结果
211 　离子注入花粉授粉对胚珠 DNA多态性的影响
利用 SSR 分子标记对注量分别为 0126 ×1016 、
0152 ×1016 、0178 ×1016 N + Πcm2 处理的花粉与自然花粉
授粉后形成的胚珠 DNA 进行多态性研究 ,结果表明 ,
随着注量的增加 ,处理样品的 DNA 多态性与对照 DNA
多态性之间的相似性变小 (表 1) ;离子注入剂量为
0126 ×1016 N + Πcm2 的样品与对照间的相似性为 0135 ,
注入 0152 ×1016N + Πcm2 与对照之间的相似性为 0128 ,
注入 0178 ×1016N + Πcm2 的样品与对照之间的相似性为
0117 ,注入 0126 ×1016N + Πcm2 与注入 0152 ×1016N + Πcm2
的样品之间的相似性大于注入 0126 ×1016N + Πcm2 与注
入 0178 ×1016 N + Πcm2 的样品之间的相似性 ,小于注入
0152 ×1016N + Πcm2 与 0178 ×1016 N + Πcm2 的样品之间的
相似性。方差分析结果表明 ,离子注入量为 0126 ×
1016N + Πcm2 的样品与对照样品 SSR 结果之间差异达到
显著 ,注入量为 0152 ×1016 和 0178 ×1016 N + Πcm2 的样
品与对照样品 SSR 结果之间差异极显著。
表 1 　胚珠 DNA SSR 分子标记多态性
Table 1 　The DNA polymorphism of ovule
注量 integral flux(N + Πcm2) 0 0126 ×1016 0152 ×1016 0178 ×1016
0 1100000
0126 ×1016 0135258 3 ( p = 01014) 1100000
0152 ×1016 012768833 ( p = 01000) 0132642 ( p = 01203) 1100000
0178 ×1016 01169333 ( p = 01003) 0131956 ( p = 01332) 0141389 ( p = 01514) 1100000
　　注 : 3 和33表示在 0105Π0101 水平上差异显著和极显著。
Note : 3 and 33 indicated significant and extremely significant at 0105 and 0101 levels , respectively.
212 　棉花 RNA的分离和 SSH文库的构建
采用改良的 CTAB 法抽提得到 RNA ,1 %琼脂糖凝
胶上进行检测 ,发现在 18S 与 28S 区域有明显的条带 ,
完整性良好 (图 12a) ;用紫外分光光度计检测试验和驱
动棉花叶片总 RNA ,二者的 OD260与 OD280比值都在 119
～210 ,纯度较高 ,可进一步用于纯化 mRNA。
利用 Oligotex mRNA Mini Kit 分离到的 mRNA 经
1 %的琼脂糖凝胶电泳 ,cDNA 呈现 015～315kbp 之间
的弥散状条带 ,较为完整 (图 12b) 。缩减产物主要集中
在 450 及 700bp 附近。将扩增产物纯化后 ,连接到克
隆载体上 ,再转入大肠杆菌中 ,共鉴定阳性克隆 110
个 ,插入片段的大小分布在 450～700bp 之间 (图 2) 。
213 　EST的获得与分析
已测序的 50 个缩减 cDNA 克隆 ,经检索 EMBL ,
65 核　农　学　报 23 卷
　　　　　　　
图 1 　总 RNA 的提取结果 (a)及 cDNA 合成结果 (b)
Fig. 1 　Results of total RNA isolation (a)
and Results of the synthesis of cDNAs(b)
Gen Bank ,DDBJ 和 PDB 的核苷酸序列数据库和蛋白质
氨基酸序列数据库及序列联配 (alignment) ,发现 52 %
的序列在数据库中有同源的棉属来源的 EST ,证实了
所得 EST序列来源于棉花 (部分与抗逆有关的结果列
于表 2) 。
应用 BLAST软件在 GenBank 中对 50 个单一序列
进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析。38 个
EST与其他物种已知基因部分区域的同源性为 56 %～
100 % ,占总 EST 的 76 % ;5 条 EST 序列能在数据库中
检索到同源性序列 ,但其功能尚不清楚 ,占 10 % ;9 个
EST在数据库中属于推测蛋白 ,占 18 % ; 4 个 EST 在
GenBank 中没有查到对应的同源序列 ,可能是新基因
或者由于序列位于变异丰富的 3’末端而无法查到与
其他物种基因的同源性 ,占 8 %。
然而 ,氮离子注入棉花花粉的生物效应是非常复
杂的 ,除了离子本身的作用外 ,还有温度、真空环境以
表 2 　部分克隆序列的 BLAST结果
Table 2 　Features of some sequenced clones and results of BLAST search
基因编号
gene number
基因登记号
number of gene registration
同源基因编码的片段
fragment coded by homologous genes
长度
length (bp)
同源性
homology( %)
Clone 1 ,25 ,31 ,61 gb| DV03862411l 尾花细辛的花 cDNA 中的 EST
specific subtracted floral cDNA library of asarum caudigerum 324 100 %
Clone14 ,38 gb| EB51295211 禾谷镰刀菌接种到小麦后特异表达的 cDNA 中的 ESTfusarium graminearum inculated wheat heads Triticum aestivum cDNA
clone Ta08 05f11 , mRNA sequence
285 99 %
Clone27 ,59 gi| 12620881| gb| AAG6112011| l 二磷酸核酮糖氧合酶Π羧化酶 ,核酮糖21 ,52二磷酸羧化Π加氧酶
ribulose21 ,52bisphosphate ,carboxylaseΠoxygenase activase 1 438 95 %
Clone42 gi| 62733297| gb| AAX9541411| 稻属二磷酸核酮糖氧合酶Π羧化酶 ,核酮糖21 ,52二磷酸羧化Π加氧酶对碘氧基苯甲醚前体
ruBisCO activase small isoform precursor
[Oryza sativa (japonica cultivar2group) ] 466 94 %
A04 dbj| BAB3342111 豌豆上与衰老相关的蛋白
senescence2associated protein [ Pisum sativum] 282 100 %
C07 gb| DN82612911 棉花接种黄杆菌后特异表达的 ESTG. hir28 ,14 hrs post inoculation 72 Leaf cDNA 8 ,14 hrs post inoculation with
xanthomonas campestris pv. malvacearum 3631 Gossypium hirsutum cDNA
272 97 %
C09 gb| AW74575511| 高梁在发生涝灾时特异表达的 EST
water2stressed 1 (WS1) sorghum bicolor cDNA 492 100 %
C11 gb| DN80170111| 棉花在干旱时特异表达的 ESTdrought stressed plants gossypium hirsutum cDNA 659 99 %
E01 ,E08 ,F03 gb| DN80170111| 干旱时棉花棉桃脱落时特异表达的 ESTDAA bolls drought stressed 856 15220 DAA bolls from drought stressed
plants gossypium hirsutum cDNA
659 100 %
E05 ,F05 ,D12 dbj| BAB3342111| 豌豆上与老化相关的蛋白
senescence2associated protein [pisum sativum] 282 89 %
E11 gb| EV31799111| 尖音库蚊感染细菌后特异表达的 ESTculex pipiens quinquefasciatus bacteria Infected library culex
pipiens quinquefasciatus cDNA
966 96 %
F02 gb| ABJ9767211| 云木香上与抗冻相关的蛋白
antifreeze protein [ saussurea involucrata ] 200 56 %
J01 sp| Q59296| CATA2CAMJ E 过氧化氢酶
catalase [campylobacter jejuni ] 507 96 %
75　1 期 N + 离子注入陆地棉花粉对胚珠 DNA 及 M1 代 cDNA 表达的影响
图 2 　SSH文库中克隆的插入片段大小检测
Fig. 2 　The sizes of the inserts in clones of SSH library
及当低能离子打在花粉时所产生的次级电子和软 X
射线等对花粉活力的影响。为了排除这些干扰因素 ,
说明诱变结果是由氮离子注入产生的 ,进行离子注入
时在花粉表面覆盖了 1 层 75μm 的打印纸 (屏蔽注入时
产生的温度效应 ,吸收注入过程中产生的次级电子和
软 X射线等) ,并增设真空对照。结果显示 ,真空对陆
地棉花粉的活力影响可忽略[18 ] 。随后的田间授粉用
的是自交系的同一单株 ,因此 ,对照与处理样品间最主
要的不同在于是否有氮离子的注入 ,由此得出的试验
结果是精确可靠的。
3 　讨论
离子注入诱变已广泛应用于植物与微生物育种 ,
注入的离子通过动量传递、质量沉积、动能沉积和电荷
交换效应联合作用而对遗传物质产生直接或间接的损
伤 ,同时生物体内各种修复机制被激活 ,对损伤进行修
复 ,在修复过程中可能出错或者损伤超过了生物体的
修复能力 ,就会引起突变和致死 ,突变就可能被稳定遗
传下来[10 ] 。随着离子注入剂量的增加 ,花粉损伤程度
变大 ,花粉活性下降 ,花粉内的遗传物质发生变化 ,染
色体有可能发生断裂、易位、重复和缺失。DNA 序列
多态性也可能发生改变。目前 ,辐射诱变在多种作物
的染色体及 DNA 水平上的变异研究已经取得了一定
的进展 ,Ken Naito 等[19 ,20 ]研究发现 ,γ射线或 C 离子诱
变拟南芥花粉时 ,会产生染色体片断的缺失、断裂、重
排和点突变 ,在辐照后代中也选育出一些具有优良性
状的突变体 ,但对辐照后代植株进行 SSH ,获取其中上
调表达基因的研究还没有报道 ,有关离子对细胞的作
用机理还没有被试验证明。由于离子的穿透力较弱 ,
它能否穿透细胞进入细胞内部使细胞核中的 DNA 发
生变异受到怀疑。本文首次以陆地棉花粉为材料 ,从
DNA、RNA 等分子水平上研究离子注入对花粉的诱变
效应。
311 　离子注入花粉授粉对胚珠 DNA多态性的影响
SSR 标记在我国作物育种上的应用研究发展很
快 ,在大豆、小麦、玉米、水稻等的遗传多态性检测、杂
种优势群划分、亲缘关系分析、遗传连锁图谱构建等方
面获得了一系列的成绩[21 ,22 ] 。本研究首次利用 SSR 分
子标记对注量分别为 0126 ×1016 、0152 ×1016 、0178 ×
1016N + Πcm2 处理的花粉与对照自然花粉授粉后形成的
胚珠 DNA 分子进行多态性研究 ,离子注入花粉内部或
可直接造成花粉内遗传物质发生改变 ,也可能通过旁
效应影响花粉内遗传物质的变化 ,授粉受精后 ,这些遗
传物质的改变均可能在胚珠发育过程中表现出来。结
果表明 ,随着注入能量的增加 ,处理样品的 SSR 结果
同对照之间的 DNA 多态性相似性变小 ,即离子注入花
粉授粉 ,会对胚珠的 DNA 多态性产生影响 ,说明离子
注入处理会在一定程度上改变花粉中精细胞的 DNA
序列。
胚珠是雌雄配子结合的产物 ,离子注入花粉授粉
后 ,花粉内精细胞的 DNA 若发生变异 ,有可能在胚珠
的 DNA 分子标记多态性上表现出来 ,通过 SSR 分子标
记来检测氮离子注入后 DNA 多态性是否发生改变。
离子注入对花粉遗传物质作用的研究 ,为解释离子诱
变效应及后代变异提供了依据。
312 　离子注入花粉授粉对 M1 代 cDNA表达的影响
SSH技术在植物的抗病反应、逆境处理、不同发育
阶段的基因表达差异分析上已取得重要进展[23 ,24 ] 。有
关 SSH文库构建的应用在玉米和小麦等植物上也有
报道[25～27 ] ,但诱变后代基因表达差异分析尚少见报
道。本研究表明 ,N + 离子注入陆地棉花粉后 ,处理花
粉授粉后形成的后代植株在基因表达方面发生明显改
变。即离子注入能够影响后代的基因表达 ,充分说明
离子注入有显著的效应。该效应可从花粉传到授粉后
85 核　农　学　报 23 卷
的下一代。本研究所构建的氮离子注入诱导陆地棉相
关的 SSH文库在国内外还是首次报道。
在我们所检测的缩减 cDNA 克隆中 ,50 %左右的
cDNA 克隆所代表的基因与抗逆有关。根据 Rundle S J
和 Zielinski R E 的研究 ,大麦在不同光照等条件下 ,二
磷酸核酮糖氧合酶Π羧化酶基因的表达情况是不同的。
在高温、自然光照等条件胁迫下二磷酸核酮糖氧合酶Π
羧化酶的表达量和活力发生变化 (活力上升) ,在暗胁
迫下活力则明显下降 ,说明该基因可能与非生物胁迫
产生的应激反应相关[28 ] 。过氧化氢酶在抵抗氧胁迫
中具有保护作用[29 ] 。氮离子注入前的抽真空作用对
生物材料有干燥作用 ,因此与干旱相关的一些蛋白的
表达可能就是生物体一种应激反应的产物 ,其余缩减
cDNA 克隆所代表的基因可能编码的产物在氮离子诱
变中的作用目前则还不清楚 ,需要进一步研究分析。
4 　结论
本研究结果表明 ,N + 注入陆地棉花粉后 ,遗传物
质发生了改变。首先在 DNA 水平上有变异条带出现 ,
这是当代的变异条带 ,如果在 M2 代仍有一部分保留
下来 ,说明当代引起的 DNA 变异是真实的。其次 ,在
mRNA 水平上 ,50 %左右的 cDNA 克隆所代表的基因与
抗逆境有关 ,这说明 N + 的注入引发的变异是遗传物
质表达水平上的变异。
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