全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 022253204
春兰离体根状茎生长和分化的研究
孔凡龙1 　贾玉芳1 　柴明良1 　徐晓薇2 　李　方1
(11 浙江大学园艺系 ,浙江 杭州　310029 ; 21 浙江省亚热带作物研究所 , 浙江 温州　325005)
摘 　要 :为优化春兰离体培养条件 ,以春兰 ( Cymbidium goeringii)芽诱导的离体根状茎为试材 ,研究了植物
生长调节剂 NAA 和 BA 以及有机添加物马铃薯匀浆、番茄匀浆、香蕉泥、蛋白胨和酵母提取物对根状茎
生长和新芽增殖的影响。结果表明 :从根状茎诱导丛生芽的适宜培养基为 1Π2MS + 011mgΠL BA + 015mgΠ
L NAA + 115gΠL AC(活性炭) ;根状茎增殖的适宜培养基为 1Π2MS + 011mgΠL BA + 510mgΠL NAA + 115gΠL
AC ;除香蕉泥外 ,其他有机添加物对根状茎生长和增殖均有不同程度的促进作用 ,但以蛋白胨的效果最
佳。
关键词 :春兰 ;离体根状茎 ;生长调节剂 ;有机添加物 ;增殖
GROWTH, PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION in vitro OF
RHIZOMES OF Cymbidium goeringii
KONG Fan2long1 　J IA Yu2fang1 　CHAI Ming2liang1 　XU Xiao2wei2 　LI Fang1
(11 Department of Horticulture , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 　310029 ; 21Subtropical Crop Research Institute , Wenzhou , Zhejiang 　325005)
Abstract :The effects of plant growth regulators (BA , NAA) and organic additives (potato homogenate ,tomato homogenate ,
banana homogenate ,peptone and yeast extract) on the growth , proliferation and differentiation of the rhizomes of Cymbidium
goeringii in vitro were measured. The results showed that the optimum medium for formation of cluster shoots from the rhizomes
was 1Π2MS + 011mgΠL BA + 015mgΠL NAA + 115gΠL AC , and the optimum medium for proliferation of the rhizomes was 1Π
2MS + 011mgΠL BA + 510mgΠL NAA + 115gΠL AC. Except banana homogenate , all the organic additives promoted the growth
and proliferation of the rhizomes , and among them peptone was the best .
Key words : Cymbidium goeringii ; in vitro rhizome ; growth regulator ; organic additive ; proliferation
收稿日期 :2008209209 　接受日期 :2008211221
作者简介 :孔凡龙 (19822) ,男 ,山东济宁人 ,硕士 ,研究方向为园林植物与观赏园艺。
通讯作者 :柴明良 (19642) ,男 ,浙江安吉人 ,副教授 ,研究方向为园艺植物生物技术。Tel :0571286971036 ; E2mail :mlchai @zju. edu. cn　　中国兰花 (简称国兰) 是兰科兰属 ( Cymbidium) 中的部分地生兰 ,主要有春兰 ( Cymbidium goeringii Rchb.f . ) 、蕙兰 ( C. f aberi Rolfe) 、建兰 ( C. ensifolium (L. )Sw. ) 、墨 兰 ( C. sinense Willd ) 、寒 兰 ( C. kanranMakino)等。兰花的离体繁殖始于上世纪 60 年代 ,Morel 采用大花蕙兰茎尖 ,将分生组织诱导形成类原球茎 ,并分化成植株 ,为兰花生产的工厂化奠定了基础[1 ] 。至今 ,在世界范围内石斛兰、蝴蝶兰、大花蕙兰等兰花的许多品种已实现试管工厂化育苗。上世纪 80 年代我国才开 始关注国兰离体培养 ,王熊等从 1981 年至 1991 年 ,以茎尖和侧芽为外植体 ,初步建立了建兰、蕙兰等离体培养体系 ,并对其形态发生过程进行了研究[2 ] 。此后 ,一些学者对墨兰、建兰种子、茎尖 (芽)的离体培养进行了研究 ;日本、韩国及我国台湾学者自从上世纪 90 年代也有少量相关研究[3～7 ] 。但国兰大都集中在建兰、蕙兰、墨兰等离体培养和体系建立 ,对于春兰只有关于形态建成的少量研究[8～10 ] ,在离体下各种因子对其生长和分化影响的系统研究未见有报道。本文以春兰芽诱导的根状茎为试材 ,研究生长调节剂、外源有机添加物等因子对根状茎生长、增殖和分化的影响 ,旨在优化春
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兰离体培养条件 ,为其离体快速繁殖和遗传转化提供
基础。
1 　材料与方法
111 　材料与培养条件
以春兰芽诱导的根状茎为试材。根状茎增殖和维
持培养基为 1Π2MS (大量元素减半 ,下同) + 210mgΠL
NAA + 011mgΠL BA + 115gΠL AC(活性炭) 。培养基均含
蔗糖 20gΠL、琼脂粉 710gΠL ,pH516。材料在光强 1000lx
左右 ,温度 25 ℃±2 ℃条件下培养。
112 　方法
11211 　NAA 对丛生芽的诱导　以 1Π2MS + 011mgΠL BA
+ 115gΠL AC 为基本培养基 ,分别添加 0、011、015、110
和210mgΠL 5 种不同浓度的 NAA (表 1) 。接种长约
110cm、含 3 个肉眼可见嫩芽的根状茎 ,每瓶接种 5 个 ,
接种前称量鲜重 ,重复 4 次。4 周后再称量鲜重 (两次
鲜重之比即为鲜重增长率 ,下同) 、统计丛生芽 (肉眼可
见的 3 个及以上的小芽连在一起计为一个丛生芽) 数
量。
11212 　不同浓度 NAA 对根状茎生长量和芽诱导的影
响 　以 1Π2MS + 011mgΠL BA + 115gΠL AC 为基本培养
基 , 分别添加 0、2、5、10 和 20mgΠL 5 种不同浓度的
NAA(表 2) 。接种生长一致、长度约为 110 cm、无明显
肉眼可见嫩芽的根状茎 ,每瓶接种 5 个 ,称量鲜重 ,每
处理重复 3 次。8 周后称鲜重并统计新芽 (长约 3mm
以上)的数量。
11213 　不同浓度的 BA 对根状茎生长量和芽诱导的影
响　以 1Π2MS + 510mgΠL NAA + 115gΠL AC 为基本培养
基 ,设 0、011、015、110 和 210mgΠL 5 个 BA 浓度梯度 (表
3) 。接种生长一致、长度约为 110cm、无明显肉眼可见
嫩芽的根状茎 ,每瓶接种 5 个 ,称量鲜重 ,重复 4 次。8
周后称量鲜重并统计新芽 (长约 3mm 以上)的数量。
11214 　不同有机添加物对根状茎增殖的影响　以1Π2
MS + 015mgΠL NAA + 011mgΠL BA + 115gΠL AC为基本培
养基 ,分别添加香蕉泥、马铃薯匀浆、番茄匀浆、酵母提
取物、蛋白胨 5 种有机添加物 ,前 3 种处理添加物含量
为 100gΠL ,后 2 种为 110gΠL ,以不加添加物为对照。每
瓶接种 6 段长约 110cm 的根状茎段 ,称量鲜重 ,重复 4
次。4 周后称量鲜重并统计新芽 (长约 3mm 以上)的数
量。
113 　数据分析
试验数据分析采用 DPS 分析软件 ,邓肯分析法 ,
5 %水平差异。
2 　结果与分析
211 　NAA对丛生芽诱导的影响
试验结果 (表 1) 表明 , BA 浓度为 011mgΠL 时 ,不
同浓度的 NAA 对根状茎生长和丛生芽诱导的影响无
规律。当 NAA 浓度为 015mgΠL 时 ,对根状茎鲜重增长
和丛生芽增殖的效果最佳 ,低于或高于此浓度 ,效果均
明显下降 ,说明 1Π2MS + 011mgΠL BA + 015mgΠL NAA +
115gΠL AC适宜丛生芽诱导和根状茎生长。
212 　NAA对根状茎生长和诱导芽的影响
试验结果表明 ,在 1Π2MS + 011mgΠL BA + 115gΠL
AC 的基本培养基上 ,不同浓度的 NAA 对春兰的影响
不同。当 NAA 浓度从 0mgΠL 提高到 210mgΠL 时 ,根状
茎生长显著增加 ,但之后随着浓度的增加 ,根状茎增殖
率间没有显著差异 ;而新芽形成表现为先增后降的趋
势 (表 2) 。当 NAA 浓度为 510mgΠL 时 ,根状茎生长量
最大 ,且新芽多 ,芽健壮 ,呈绿色 (图 1) 。
表 1 　NAA 对春兰根状茎生长和丛生芽增殖的影响
Table 1 　Effects of NAA on the growth and proliferation of
rhizomes of Cymbidium goeringii
NAA 浓度
concentration of NAA
(mgΠL) 鲜重增长率growth rate of freshweight ( %) 丛生芽增殖率proliferation rate ofcluster shoots ( %)
0 5187 ±0135 bc 4185 ±0115 ab
011 7125 ±0163 b 4125 ±0121 bc
015 9195 ±0137 a 5144 ±0127 a
110 4191 ±0170 c 3181 ±0124 c
210 4111 ±0136 c 3122 ±0117 c
表 2 　不同浓度的 NAA 处理对春兰根状茎生长
和新芽形成的影响
Table 2 　Effects of NAA on the growth of the
rhizomes and proliferation of the shoots
NAA 浓度
concentration of NAA
(mgΠL) 鲜重增长率growth rate of freshweight ( %) 新芽增殖率proliferation rateof shoots ( %)
0 1191 ±0110 b 1109 ±0155 d
210 2166 ±1133 a 3131 ±0117 c
510 2199 ±1150 a 5175 ±0129 a
1010 2137 ±0112 ab 4115 ±0121 b
2010 2166 ±0113 a 3122 ±0116 c
213 　BA处理对根状茎生长和诱导芽的影响
适宜浓度的 BA 既是根状茎增殖所必需的 ,也是
维持根状茎生长状态所不可缺少的。表 3 显示 ,BA 浓
度为 011mgΠL 时 ,根状茎鲜重增长率最高 ,增殖效果最
佳 (图 22B) ,为最适浓度。不添加 BA 时 ,根状茎分化
452 核　农　学　报 23 卷
图 1 　NAA 浓度为 510mgΠL 时根状茎的生长状况
Fig. 1 　The growth of rhizomes on the
medium with 510mgΠL NAA
出单芽 (图 22A) ,而 BA 浓度过高 (210mgΠL) 时 ,根状茎
分化形成细弱的小芽 (图 22C) 。
214 　不同有机添加物对根状茎生长和增殖的影响
5 种有机添加物处理中 ,除香蕉泥外 ,其他 4 种有
表 3 　不同浓度的 BA 对春兰根状茎生长和增殖的影响
Table 3 　Effect of BA on the growth of the rhizomes
and proliferation of the shoots
BA 浓度
concentration (mgΠL) 鲜重增长率growth rate of
fresh weight ( %)
新芽增殖率
proliferation rate
of shoots( %)
0 2134 ±0112 c 4183 ±0124 b
011 3112 ±0116 a 6149 ±0132 a
015 2178 ±0114 b 2141 ±0112 cd
110 1181 ±0109 d 3105 ±0115 c
210 1148 ±0107 e 2125 ±0111 d
机添加物对鲜重的增长和根状茎的增殖均表现出不同
程度的促进作用 (图 3 ,图 4) 。其中酵母提取物和蛋白
胨对根状茎增殖的促进作用最明显 ;蛋白胨对鲜重增
长的效果最佳 (图 42F) 。蛋白胨、马铃薯和番茄处理
中 ,根状茎嫩芽生长健壮 ,色泽深绿 ;其他各处理中 ,根
状茎嫩芽生长偏弱 ,色泽黄绿 ,部分材料黄化。
图 2 　BA 对春兰根状茎生长与分化的影响
Fig. 2 　Effect of BA on the growth and differentiation of rhizomes in Cymbidium goeringii
A : 不添加 BA without BA ;B : BA 011mgΠL ;C: BA 210mgΠL
图 3 　不同有机添加物对春兰根状茎增殖和鲜重增长的影响
Fig. 3 　Effects of organic additives on proliferation
and growth of the rhizomes
1 :无添加物 ;2 :香蕉泥 ;3 :番茄匀浆 ;4 :马铃薯匀浆 ;
5 :酵母提取物 ;6 :蛋白胨
1 :no additive ;2 :banana homogenate ;3 :tomato
homogenate ;4 :potato homogenate ;5 :yeast extract ;6 :peptone
3 　讨论
国兰中 , 春兰的离体培养相对较难 , 报道较
少[8～10 ] ,目前普遍采用杂交果实无菌播种进行快
繁[11 ] 。春兰在试管中的生长速度也比较慢 ,选择合适
的生长调节剂配比及有机添加物 ,将有助于改善春兰
的快速繁殖技术体系。前人关于寒兰的研究表明 ,在
MS 培养基中添加 1mgΠL BA 和 011mgΠL NAA ,能明显促
进新芽形成[12 ] 。对线艺春兰的研究发现 , IBA 促进根
状茎生长的效果优于 NAA[13 ] 。本试验则研究了不同
BA 和 NAA 配比对春兰根状茎生长、增殖和分化的影
响。采用基本培养基添加 011mgΠL BA 和 015mgΠL
NAA ,可获得大量丛生芽 ;而基本培养基中添加 011mgΠ
L BA 和 510mgΠL NAA ,可获得健壮单芽 ;基本培养基中
仅添加 011mgΠL BA 则有利于维持根状茎的正常和健
康生长。
本试验还发现多种有机添加物 (图 3 ,图 4) 均对根
552　2 期 春兰离体根状茎生长和分化的研究
图 4 　有机添加物对根状茎增殖和生长的影响
Fig. 4 　Effects of organic additives on the proliferation and growth of the rhizomes
A :无添加物 ;B :香蕉泥 ;C :番茄匀浆 ;D :马铃薯匀浆 ; E :酵母提取物 ;F :蛋白胨
A : no additive ;B : banana homogenate ;C : tomato homogenate ; D : potato homogenate ; E: yeast extract ;F : peptone
状茎的增殖和生长有促进作用 ,而蛋白胨的效果最佳 ,
这与春石斛兰离体培养研究中获得的结果相似[14 ] 。
由于前人的研究表明春兰原球茎在添加椰乳的培养基
上增殖效果差[11 ] ,故本试验未采用。
通常 ,兰花种子萌发后形成原球茎 ,芽等无性器官
培养后形成类原球茎。对国兰而言 ,再从原球茎、类原
球茎逐渐形成根状茎 ,从根状茎上分化出芽。根状茎
为多细胞构成 ,作为外植体进行微粒子轰炸或农杆菌
介导的遗传转化时 ,再生的转基因芽呈嵌合体的可能
性非常大 ,影响转基因的遗传稳定性。因此 ,优化离体
培养条件 ,筛选出利于外植体产生更多新芽的培养基 ,
将增加转化细胞成芽的机会 ,大大提高兰花转基因的
效率。在蝴蝶兰类原球茎介导的转化中 ,常通过切割
和针刺类原球茎[16 ,17 ] 来增加与农杆菌接触的细胞数
量 ,并刺激转化细胞的生长。本试验发现 (表 1) ,长度
1cm左右、带 3 个原始嫩芽的春兰根状茎 ,在添加
011mgΠL BA 和 015mgΠL NAA 的基本培养基上 ,可获得
较多的丛生芽。我们用这种培养基进行了农杆菌介导
的遗传转化 ,已获得稳定转化的根状茎。有研究表明 ,
在预培养基上同时添加番茄和椰乳 ,能使野生蝴蝶兰
原球茎的转化效率比仅添加椰乳时提高近 10 倍[18 ] 。
由于有机添加物的成分复杂 ,理论上无法判断哪几种
成分起作用。但在实践中 ,可筛选出适宜的添加物种
类和用量。因此 ,优化植物生长调节剂、有机添加物等
培养条件不论是对兰花的离体繁殖还是对兰花的转基
因研究均具有重要的实践意义。
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(下转第 273 页)
652 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (2) :253～256
开展蔺草干种子的辐照敏感性试验是非常必要的 ,它
是开展蔺草辐射育种的基础。从本试验结果来看 ,经
不同剂量处理后的蔺草幼苗生长状况及生理生化特性
存在显著差异。随着辐照剂量的增加 ,4 个蔺草品种
幼苗的根系活力和叶绿素含量均出现下降的趋势。而
在 500～1000Gy 范围内 ,对草茎生长则有明显的促进
作用 ,但草茎明显变细。
不同的剂量辐照对生物体内的细胞通透性也有明
显的影响。王月华等[12 ] 认为辐照毒素和相应酶系的
活性可作为作物辐照敏感性的测定指标。过氧化物酶
(POD)和 PPO 是植物体内 2 种重要的膜保护酶 ,能对
细胞的伤害作出响应 ,同时消除自由基产生的伤害而
起修复作用。本试验结果表明 , 在辐照剂量达到
1000Gy 时 ,过氧化氢酶酶活性因不能被诱导而降低 ,
修复功能丧失 ,膜透性增大 ,有害物质增多。
从以上酶活性和生理指标测定结果来看 ,500Gy
左右的辐照剂量能有效诱导蔺草一些生理生化指标的
变化 ,又不会使种子受到过度损伤而影响萌发和幼苗
生长 (数据未发表) 。不同品种的成熟蔺草干种子 ,适
宜的辐照剂量可能有所变化 ,但不应低于 500 或高于
1000Gy。
致谢 :本试验所用的蔺草成熟干种子由宁波市高桥镇
蔺草种质资源圃提供 ,诱变处理得到浙江大学辐照中
心傅俊杰老师的帮助 ,在此一并致谢 !
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