全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032442205
卡特兰 ACO 基因克隆与反义表达载体的构建
郑宝强1 王 雁1 彭镇华1 李晓华2
(11 国家林业局林木培育重点实验室Π中国林业科学研究院林业研究所 ,北京 100091 ;
21 国家林业局竹藤科学与技术重点实验室Π国际竹藤网络中心 ,北京 100102)
摘 要 : 以卡特兰 ( Cattleya ) 花瓣为试材 , 提取其总 RNA , 并根据其他兰花的 ACC 氧化酶 ( 12
aminocyclopropane212carboxylic acid oxidase , ACO) 基因保守序列设计了一对特异性引物 ,通过 RT2PCR 法
克隆得到 1 条 967bp 的卡特兰 ACO cDNA 片断 ,共编码 321 个氨基酸残基。序列分析结果显示该克隆片
断与已发表的其他兰花的 ACO 基因序列同源性很高 ,均在 85 %以上 ,尤其与原生种和其近亲属的同源
性在 95 %以上。将克隆的卡特兰 ACO 片段反向连接到植物表达载体 pBI121 中 CaMV35S 启动子的下
游 ,构建了卡特兰 ACO 基因的反义表达载体 pBI121ACC ,为进一步应用反义技术培养长花期卡特兰新
品种奠定了基础 ,也首次为应用生物技术延长卡特兰花期做出了尝试。
关键词 :卡特兰 ;ACC氧化酶 ;反义表达载体
CLONING OF ACC OXIDASE GENE FROM Cattleya FLOWER AND
CONSTRUCTION OF ITS PLANT ANTISENSE EXPRESSION VECTOR
ZHENG Bao2qiang1 WANG Yan1 PENG Zhen2hua1 LI Xiao2hua2
(11State Forestry Administration ( S FA) , Key Laboratory of Tree Breeding and CultivationΠResearch Institute of Forestry ,
Chinese Academy of Forestry , Beijing 100091 ;
21 International Center for Bamboo and RattanΠS FA Key Laboratory of Bamboo and Rattan Science and Technology , Beijing 100102)
Abstract :Total RNA was extracted from flower of cattleya , according to the conserved acid sequence for ACC oxidase in other
orchid , we designed a pair of oligo nucleotide primers. Using RT2PCR method , a cDNA fragment about 967 base pair , which
encoded 321 predicted amino acid residues , was amplified. The results of BLAST showed the sequence presented a very high
match with the ACO genes from other orchid , the homologue was higher than 85 % , and was higher than 95 % with the
original species and relatives. An antisense expression vector of the cattleya2ACO gene , which named pBI121ACC , was
constructed ,and the antisense sequence was controlled by the CaMV 35S promoter. The work laid the foundations of future
transgenic research for prolonging the flowering period of the transgenic Cattleya via antisense technology.
Key words : Cattleya ; ACC oxidase ; antisense expression vector
收稿日期 :2008209210 接受日期 :2008211221
基金项目 :国家林业局 948 项目 (2006242C07 ,200524237)部分研究内容
作者简介 :郑宝强 (19812) ,男 ,山东淄博人 ,博士 ,主要从事园林植物与观赏园艺研究。Tel :010262888722 ; E2mail :newpeasant @yahoo. com. cn
通讯作者 :王 雁 (19692) ,女 ,黑龙江哈尔滨人 ,研究员 ,主要从事园林植物与观赏园艺研究。Tel :010262888963 卡特兰属 ( Cattleya)是兰科附生兰类 ,原产于美洲热带和亚热带[1 ] 。其花型硕大多姿、气息芬芳可人 ,颜色丰富多彩 ,有“热带兰之王”之称 ,哥伦比亚、巴西、哥斯达黎加等国都以卡特兰为国花[2 ] 。但现有卡特兰品种与其他热带兰相比 ,花期短 ,一般只有 2～3 周 ,严重 降低了其商用价值 ,是热带兰市场上占有份额小的主要原因。研究表明 ,大多数兰科植物花朵的衰老过程是典型的呼吸跃变型 ,乙烯是主要的调控因子[3 ] ,卡特兰花朵的衰老同样受乙烯的调控[4 ] ,因此抑制卡特兰体内乙烯的生物合成 ,是延缓其衰老、延长花期的重要
244 核 农 学 报 2009 ,23 (3) :442～446Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
手段。乙烯的直接前体 ACC(12氨基环丙烷212羧酸) 的
氧化受到 ACC氧化酶 ( ACO)的调控 ,改变 ACO 在植物
体内的含量将会直接影响到乙烯的体内合成[5 ] 。应用
ACO 基因的反义 RNA 技术 ,可在一定程度上抑制其内
源 ACO 基因的表达 ,抑制乙烯的生物合成 ,从而延长
花朵的寿命。本研究以 RT2PCR 方法扩增并克隆了卡
特兰的 ACO 基因 ,构建了该基因的反义表达载体 ,为
采用基因工程手段培育花期长的卡特兰新品种打下了
基础。
1 材料与方法
111 试验材料
卡特兰品种为 Blc . Sung Ya Green‘Green World’,
采自中国林业科学研究院科研温室。参考高子媛等
人[6 ]的方法 ,以人工授粉 48h 后的卡特兰花瓣为试材 ,
采集后用冰盒带回实验室 ,4 ℃低温保存。
质粒载体 pUCm2T Vector、质粒小量抽提试剂盒和
DNA 胶回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有
限公司产品 ;Oligo (dT) 15 、RTase M2MLV、Taq 酶、dNTP、
限制性内切酶和 DNA Marker 均购自 TAKARA 公司 ;其
他常规化学试剂均为国产分析纯。大肠杆菌菌株
DH5α为本实验室保存 ,质粒载体 pBI121 由河北农业
大学齐靖博士惠赠。
112 RNA提取及 cDNA第一链的合成
卡特兰总 RNA 提取和纯化改良参照改良 CTAB
法[7 ]进行 ,1 %琼脂糖电泳检测 RNA 完整性。纯化后
的 RNA 在 RTase M2MLV 的作用下 ,以 Oligo (dT) 15为引
物进行反转录 ,合成 cDNA 第一链。
113 PCR扩增
根据 GeneBank 上公布的 ACO 基因保守序列 ,利
用 Oligo610 软件设计一对 PCR 扩增引物 ,引物由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物为
AACTGGGGATTCTTCGAGCTACTGAACC , 下 游 引 物 为
ATTGTTCAAATCAAACCACTAGACCCTA。以 获 得 的
cDNA 第一链为模板 ,进行特异合成引物的 PCR 扩增 ,
反应总体系为 25μl , 其中包含模板 50ng、10 ×PCR
Buffer 215μl、Taq 酶 115 U 以及上下游引物各 30ng ,
Mg2 + 浓度为 210mmolΠL , dNTP 浓度为 0125mmolΠL。
PCR反应在德国 Biometra 公司生产的 T Gradient PCR
仪中进行 ,扩增程序为 : 94 ℃预变性 7min , 94 ℃变性
50s ,52 ℃退火 1min ,72 ℃延伸 1min ,共 35 个循环 ;72 ℃
完全延伸 5min。
114 目的片段的克隆与 cDNA序列的测定
将 PCR 产物纯化后与 pUCm2T Vector 连接 ,并借助
热击法转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,在 X2GalΠ
IPTG培养基上挑取白色菌落 ,用碱法小批量抽提质
粒 ,经 Xba ⅠΠSac Ⅰ双酶切后进行电泳鉴定 ,将菌液送
上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。对阳
性克隆进行核苷酸序列分析 ,阳性克隆质粒命名为
pUCm2ACC。搜索其他植物 ACO 基因 ,利用 NCBI2Blast
软件及 DNAman 软件进行序列同源性分析和氨基酸的
系统树分析。
115 植物表达载体的构建和鉴定
质粒 pUCm2ACC经限制性内切酶 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ
消化后 ,从胶中回收小片段 ,与经 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ消化
的质粒载体 pBI121 回收的大片段经 T4 连接酶连接。
连接产物转化大肠杆菌 E. coli DH5α感受态细胞 ,在
含卡那霉素 ( Kmr) 100mgΠL 的 LB 平板上筛选阳性菌
落 ,碱法提取质粒 ,重组质粒命名为 pBI121ACC ,构建
过程如图 1 所示 ;重组质粒 pBI121ACC 用反复冻融法
转化根癌农杆菌LBA4404 (Rifr) 感受态细胞 ,在含有利
福平 (50mgΠL)和卡那霉素 (50mgΠL)的 YEB 平板上筛选
阳性克隆并进行碱法提取质粒及酶切鉴定。
图 1 卡特兰 ACO 基因反义表达
载体的构建示意图
Fig. 1 Constructing diagram of plant expression
vector for antisense Cattleya ACO
2 结果与分析
211 ACO 基因的 RT2PCR扩增及 PCR产物的克隆
以卡特兰花瓣总 RNA 合成的 cDNA 第一链为模
板 ,用设计的特异性引物进行 PCR 扩增 ,得到清晰、稳
定的单一片段 (图 2) ,该片段长度约为 1000bp ,与预期
344 3 期 卡特兰 ACO 基因克隆与反义表达载体的构建
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
目的片段大小相一致。将此片断回收纯化后与 pUCm2
T Vector 连接 ,然后转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 ,
经蓝白斑筛选后 ,挑取 4 个阳性菌落分别扩繁 ,并用小
量抽提试剂盒回收重组质粒 ,经 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ双酶
切后电泳 ,结果如图 3 所示。4 个重组质粒均酶切出
两条片段 ,除 2 800bp 左右的 pUCm2T Vector 自身片段
外 ,还有一条 1000bp 左右的插入片段 ,与目标片段长
度相符 ,证实目标片段已成功插入重组质粒中。
图 2 RT2PCR 电泳结果
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis result of RT2PCR
M:DL2000 Marker ;1 ,2 :PCR 产物
1 ,2 :PCR produce
图 3 重组质粒经 Xba I和 Sac I双酶切后电泳图谱
Fig. 3 Electrophoresis pattern of recombinant plasmid
doubledigest by Xba Ⅰand Sac Ⅰ
M:1kb DNA Ladder ; 泳道 1～4 :重组质粒经 Xba I 和 Sac I 双酶切
M:1kb DNA Ladder ; Lane 1～4 :Recombinant plasmid
doubledigest by Xba Ⅰand Sac Ⅰ
212 克隆片段的测序和序列分析
对经酶切鉴定后的重组质粒进行测序 ,结果表明 ,
该片段长度为 967bp ,共编码 321 个氨基酸 (图 4) 。将
此片断在 NCBI 主页上进行 Blast 分析后发现 ,本研究
所得到的片段与已知 11 个兰科植物 ACO 基因的同源
性都在 85 %以上 (表 1) ,尤其与卡特兰原生种和近亲
属的同源性达到了 95 %以上 ,因而可以确定此片段为
卡特兰 ACO 的基因片段。该片段已成功上传
GenBank ,登录号为 EU363763。
表 1 试验所得序列与其他兰科植物 ACO
基因的碱基序列同源性
Table 1 Nucleotide sequence of cloning similarity
to other orchid ACO gene
基因登录号
accession
number
物种
species
碱基同源性
homologue
( %)
EU363762 杂种卡特兰 Slc. Love Castle‘Kurenai’ 100
AY598793 二色卡特兰 Cattleya bicolor 97
AY598794 中型卡特兰 Cattleya intermedia 96
AY598795 蕾丽兰 Laelia anceps 95
EF061081 “索尼纳”石斛兰 Dendrobium hybrid‘Sonia’ 88
EF487342
“庞普杜”石斛兰 Dendrobium hybrid
‘pompadour’ 88
EF487343
“卡 伦 ”石 斛 兰 Dendrobium hybrid
‘Karen’ 88
EU151724 “少女”石斛兰 Dendrobium hybrid‘Miss
Teen’ 88
AF038840 鸽石斛兰 Dendrobium crumenatum 86
AB257311
“红金星”大花蕙兰 Cymbidium hybrid
‘Ruby Eyes Golden Star’ 86
AF004662 “贵妇人”蝴蝶兰 Phalaenopsis hybrid‘True Lady’ 85
L37103 朵丽蝶兰 Doritaenopsis sp . 85
对 GenBank 同源性搜索获得的其他植物 ACO 基
因氨基酸序列进行系统进化分析 ,由图 5 可以发现 ,本
试验材料 Blc . Sung Ya Green‘Green World’最先与卡特
兰的原生种 (二色卡特兰 AAT02192 , 中型卡特兰
AAT02193)及其近亲属 (蕾丽兰 AAT02194) 聚类合并 ,
其次与其他兰科植物 (蝴蝶兰 AAR00506 ,朵丽蝶兰
AAA21611 ,石斛兰 AAD02104、ABK32881) 聚类 ,然后与
同是单子叶植物的禾本科植物 (毛竹 BAB32502 ,甘蔗
ABM74187)聚类 ,最后与双子叶植物 (橙 AAG49361 ,棉
花 AAZ83342 ,欧洲白桦 CAA71738 ,沙梨 BAD61004 ,郁
金香 BAE20195 ,山茶 ABT33224 ,牵牛 ABL67954 等) 聚
类。聚类分析结果表明 ,本研究克隆的 ACO 基因与兰
科植物亲缘关系最近 ,其次与单子叶植物 ,与双子叶植
物亲缘关系远一些。
213 ACO 基因反义表达载体的构建及鉴定
以重组质粒为模板 ,利用 Sac Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切
后回收片断 ,与同样用 Sac Ⅰ和 Xba Ⅰ双酶切后去除
gus 基因的 PBI121 载体片断连接 ,构建成该基因的反
义表达载体。连接产物转化大肠杆菌 E. coli DH5α感
444 核 农 学 报 23 卷
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
图 4 克隆所得碱基序列和所推导的氨基酸序列
Fig. 4 Base sequence of cloning and the putative amino acids sequence
图 5 不同来源的 ACO 基因推导的氨基酸序列聚类分析
Fig. 5 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of ACO from Blc . Sung Ya Green
‘Green World’and other plants in GenBank database
544 3 期 卡特兰 ACO 基因克隆与反义表达载体的构建
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
受态细胞 ,经筛选转化子 ,用滞后质粒作 XbaⅠ+ SacⅠ双
酶切鉴定 ,所切下大小约为 1000bp 的片段 ,与预期结果
相符 ,说明构建正确 ,该重组质粒被命名为 pBI121ACC
(图 6) 。将重组质粒 pBI121ACC用反复冻融法转化根癌
农杆菌感受态细胞 ,经 PCR 鉴定已经获得了含有表达
载体的农杆菌 ,可用于卡特兰的遗传转化。
图 6 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ酶切鉴定反义表达载体 pBI121ACC
Fig. 6 Detection of the antisense expression vector
pBI121ACC by Xba Ⅰand Sac Ⅰ
M:1kb DNA Ladder ,
泳道 1～2 :反义表达载体经 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ双酶切
M:1kb DNA Ladder ; Lane 1～2 :Antisense expression
vector doubledigest by Xba Ⅰand Sac Ⅰ
3 讨论
利用反义基因技术抑制乙烯的生物合成最早在番
茄上获得成功 ,使番茄的储存期大大延长[8 ] 。近年来 ,
随着该技术的广泛应用 ,借助反义 ACO 基因调控乙烯
的生物合成来延缓切花衰老取得了较大进展 ,并在香
石竹[9 ,10 ]等花卉上获得成功 ,使切花的寿命明显延长。
卡特兰花期同样受到乙烯影响 ,导入反义 ACO 基因也
会延长其花期。但由于 ACO 由多基因家族编码 ,在不
同时期、不同组织间编码基因不同 ,因而构建到反义表
达载体中的片断选择非常关键。本研究选择从卡特兰
花瓣中克隆的 ACO 基因 ,与已知卡特兰原生种和近亲
属花瓣中 ACO 基因同源 ,可以确保所构建的反义表达
载体能特异性降低卡特兰花瓣中的 ACO 基因的表达 ,
从而起到延长花期的作用。
本研究将克隆得到的卡特兰 ACO 片段反向连接
到植物表达载体 pBI121 中 CaMV35S 启动子的下游 ,构
建了卡特兰 ACO 基因的反义表达载体 pBI121ACC ,经
PCR 鉴定已获得了含有表达载体的农杆菌 EHA105 ,为
进一步通过反义技术获得抗衰老转基因卡特兰奠定了
基础。
参考文献 :
[ 1 ] 胡松华. 热带兰花[M] . 北京 :中国林业出版社 ,2002 ,33
[ 2 ] Chadwick A A ,Arthur E C. The classic Cattleyas [ M] . Timber press ,
2006 ,1
[ 3 ] Reid M S , et al . Ethylene and flower senescence [J ] . Plant Growth
Regulation , 1992 , 11 :37～43
[ 4 ] Yamane K,Yamaki Y,Fujishige N. Effects of exogenous ethylene and 12
MCP on ACC oxidase activity , ethylene production and vase life in
Cattleya Alliances[J ] . Journal of the Japanese Society for Horticultural
Science ,2004 ,73 (2) :128～133
[ 5 ] Adams D O , Yang S F. Ethylene biosynthesis identification of 12
aminocyclopropane212carboxylic acid as an intermediate in the conversion
of methionine to ethylene [J ] . Proc Natl Acad Sci USA , 1979 , 76 :170
～174
[ 6 ] 高子媛. 嘉德丽亚兰花中 ACC 氧化酶基因之选殖与分析[ D] . 台
湾 :国立中山大学 ,2004
[ 7 ] 董 祯. 梨果实 ACC 氧化酶基因克隆的研究 [ D ] . 河北保定 :河
北农业大学 ,2007
[ 8 ] Hamilton A J , Lycett G W , Grierson D. Antisense gene that inhibits
synthesis of the hormone ethylene in transgenic plant [J ] . Nature , 1990 ,
346 :284～287
[ 9 ] 刘会超 ,李永春 ,巨关生 ,孙振元 ,柴德勇. 香石竹 ACC 氧化酶基
因克隆及其反义表达载体构建[J ] . 核农学报 ,2005 ,19 (6) :461～
464
[10 ] 余义勋 ,包满珠. 反义 ACO 基因导入获得瓶插奉命长的香石竹植
株[J ] . 园艺学报 ,2004 ,31 (5) :633～636
644 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (3) :442～446
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net