全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
文章编号 :100028551 (2009) 052816204
137 Csγ射线辐照对铁皮石斛种胚原球茎的诱变研究
詹忠根1 　徐　程2 　席　芳 3
(11 浙江经贸职业技术学院 ,浙江 杭州　310018 ; 21 浙江大学生命科学学院 ,浙江 杭州　310012 ;
31 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 ,浙江 杭州　310028)
摘 　要 :研究了不同剂量的137 Csγ射线辐照对铁皮石斛种胚原球茎生长和分化效应的影响。结果表明 :
辐照处理对种胚原球茎的生长和分化有抑制作用 ,尤其是对根的抑制更为明显 ;由于种胚原球茎的完整
性好 ,耐受性强 ,其辐照半致死剂量 (LD50 )为 67123 Gy ;流式细胞分析表明 ,大多数外部形态发生改变的
植株其细胞内 DNA 的倍性发生了改变 ,出现相当多的非整倍体 ;此外 ,辐照产生的变异苗出现茎分叉、
叶片缺绿或白绿相间等现象 ,可能是由于某些基因的表达与关闭引起的。
关键词 :铁皮石斛 ;种胚原球茎 ;辐照诱变
STUDY MUTAGESIS OF Dendrobium officinale PROTOCORM
FROM EMBRYO IRRADIATED BY 137 Csγ2RAYS
ZHAN Zhong2gen1 　XU Cheng2 　XI Yu2fang 3
(1. Zhejiang Economic&Trade Polytechnic , Hangzhou , zhejiang 　310018 ; 2. College of Life Science , Zhejiang University ,
Hangzhou , zhejiang 　310012 ; 3. College of Agriculture & Biotechnology , Zhejiang University , Hangzhou , zhejiang 　310028)
Abstract :Study on the growth and differentiation of D . officinale protocorm treated by different doses of 137Csγ2ray was
carried out . The results indicated that the treatment of irradiation restrained the growth and differentiation of protocorm ,
especially to roots. The LD50 is 67. 23 Gy , because the protocorm is a integrate embryoids and higher tolerance was found.
Ploidy analysis showed that most of aberrant seedlings go with DNA change , and they were not euploid. When the plants
treated by irradiation , some of aberrant seedlings appeared stem forfication , and leaves appeared chlorophyll2deficient or green2
white ,probably due to some genes’expression or closing.
Key words : Dendrobium officinale ;protocorm ;irradiation mutation
收稿日期 :2009203209 　接受日期 :2009207203
基金项目 :浙江省教育厅 ( Y200804108)资助项目
作者简介 :詹忠根 (19712) ,男 ,浙江杭州 ,硕士研究生 ,从事药用植物生理生化研究。Tel :0571286929748 ; E2mail :zhzg9321 @163. com
通讯作者 :徐　程 (19702) ,男 ,浙江杭州 ,博士研究生 ,从事药用植物生理生化研究。Tel : 0571286929794 ; E2mail :xuc123 @zju. edu. cn　　铁皮石斛 ( Dendrobium officinale) 是兰科石斛属植物 ,也是名贵的中药材。近年来 ,因铁皮石斛野生资源的匮乏 ,人们开始通过组织培养获得种源 ,并开展大规模人工栽培。但铁皮石斛的生长相对缓慢 ,无法适应现实生产需求 ,故迫切需要培育生长迅速、药用成分含量高的新品种。目前 ,对农作物 ,花卉等通过物理诱变培育新品种的报道较多[1～2 ] ,特别是对菊花进行辐射 育种已取得不少成果[3～6 ] ,兰科植物的辐照育种也有少量报道 ,如林芬等[7 ] 利用紫外光诱变春兰 ;傅雪琳等[8 ]通过60 Coγ射线辐照对墨兰根状茎生长和分化研究。为了解辐照对铁皮石斛变异的影响 ,本实验选取抗寒性较强 ,药用品质较好 ,产自浙江雁荡山的铁皮石斛为材料 ,探讨了经137 Csγ射线辐照后的种胚原球茎的生长和分化效应。
618　 核 农 学 报　2009 ,23 (5) :816～819Journal of Nuclear Agricultural Sciences
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1 　材料与方法
111 　材料
将浙江雁荡山 2 年生组培栽培苗所结蒴果用洗洁
精浸泡 30 min ,冲洗干净后置于 75 %酒精中消毒
1 min ,弃去酒精后再用 011 %氯化汞浸泡灭菌 15 min ,
最后用无菌水漂洗 3～5 次。将灭菌后的蒴果在无菌
培养皿内剪开 ,用接种工具取出种胚 ,由于种胚非常细
小 ,为方便接种将种胚分散在少量无菌水中 ,然后用吸
管吸取含种胚的无菌水 ,接种到 B5 + NAA 012 mgΠL 培
养基上 ,25 ℃暗培养 2 周后 ,转为光照培养 10 周 ,使种
胚萌发为绿色种胚原球茎。
112 　辐照处理 　
将绿色种胚原球茎用接种铲装入直径为 1 cm 的
无菌玻璃指管内 , 置于 Gammacell 3000 Elan ( MDS
Nordion 公司) 辐照室内 (2134 L 内腔) ,设 25 ,50 ,75 和
100 Gy 4 个剂量进行辐照 ,剂量率为 5 GyΠmin ,以未辐
照的材料为对照 ,3 次重复。处理完毕后 ,将球茎接种
于B5 + NAA 012 mgΠL 的培养基中 ,接种量为 100 粒Π
瓶。
113 　辐照对种胚生存率和生长分化的影响
培养 6 周后 ,对种胚原球茎进行观察计数 ,方法
是 :褐化判定死亡 ,有真叶出现判定为已分化 ,其他判
定为未分化。半致死剂量 (LD50 ) 按 Karber 氏法计算。
将分化及未分化的种胚原球茎用相同成分的新培养基
再继代培养 4 周后统计增殖率、株高、叶片数、发根数、
根长和变异率。增殖率以培养 4 周后植株数与接种数
的比值表示 ;变异率以培养 4 周后出现变异叶、茎异常
增粗等形态指标的植株数与总植株数的比值表示。
114 　流式细胞仪分析
11411 　样品制备 　为确定 DNA 倍性是否发生变化 ,
取形态变异的试管苗 (花叶苗 :叶片有缺绿现象或出现
白绿相间的植株)及正常形态试管苗幼嫩叶 0105 g 置
于 2 cm 培养皿中 ,加入 1 ml 的 OttoI缓冲液 ,用手术剪
将材料剪成小于 012 mm2 的细条 ,以上操作均须在冰
浴下进行。然后用 115 ml 的离心管收集细小碎片 ,320
目铜网过滤 ,滤液经 2000 rΠmin 离心 8 min ,弃上清后加
入 100μl 新鲜 Otto Ⅰ缓冲液 ,轻轻摇晃 ,使沉淀物重新
悬浮。最后再加入 1 ml 的 Otto Ⅱ缓冲液 (含 PI 和
RNase) ,孵化 50 min ,间断摇晃。其后 4 ℃下染色 30
min ,染色剂 :Propidium iodide 50μgΠml ,RNase 50μgΠml ,
染色后 1h 内上样检测。
11412 　流式细胞仪检测参数与数据计算　采用美国
BD 公司 FACScan 流式细胞仪 ,氩激光波长为 488 nm。
每个样本至少计数 10000 个细胞 ,重复 3 次。利用
Modfit LT 软件分析 DNA 直方图。以玉米 CE - 777 为
外标 (2C = 5143) 。
2C DNA Amount (pg) = 样品 G1 峰平均值 ×标准品
2C值Π标准品 G1 峰平均值。以 1pg DNA = 978 Mbp [9 ]
计算各品种相对基因组大小。
DNA index(DI) :DI指样本 G0ΠG1 峰的平均道数与
正常二倍体 G0ΠG1 峰的平均道数之间的比值。DI = 1
表示样本 G0ΠG1 峰的平均道数与正常二倍体 G0ΠG1 峰
的平均道数相等 ,即样本是二倍体 ,因此 ,DI 为 119～
211 的细胞即表示四倍体 ,而二倍体和四倍体区域外
的统称异倍体。
2 　结果与分析
211 　不同剂量辐照对铁皮石斛种胚原球茎存活率和
生长分化的影响
从表 1 可以看出 ,辐照处理 6 周后 ,可观察到不同
剂量处理组之间种胚原球茎存活率差异较大。从 0 Gy
组 (对照组) 至 100 Gy 组 ,存活率呈阶梯状下降。其
中 ,75 Gy 辐照处理成活率为 48 % ,根据 Karber 氏公式
可计算出辐照半致死剂量 LD50 = 67123 Gy。从外观上
看 ,75 和 100 Gy 辐照处理后的种胚原球茎相当一部分
已死亡或存在一定程度的褐化 ,发育缓慢。而 25 和 50
Gy 辐照处理后的种胚原球茎除存活率及株高受影响
外 ,其他方面与对照组相比差异不大。
继代培养 4 周后 ,大部分未分化及一定程度褐化
的种胚原球茎死亡 ,而已分化的种胚原球茎则陆续发
育成完整的植株 ,但在增殖率、叶片数、发根数、根长和
变异率方面均出现差异 ,其中植株增殖率从 50 Gy 到
100 Gy 呈显著下降趋势 ,而 25 Gy 增殖率稍高于对照 ,
变异率则随着辐照剂量的增加而增加。通过对增殖
率、株高、叶片数、发根数、根长等形态指标在 01001 水
平上统计分析发现 :辐照处理后的植株在增殖率 (除
25 Gy 辐照处理外) 、株高、发根数、根长等与对照组有
极显著差异 ,尤其是对根的抑制更加明显 ,而对叶片数
的影响差异不显著。
212 　辐照对植株形态的影响
经不同剂量137 Csγ射线辐照后的植株形态表现各
异 ,除在株高、叶片数、发根数和根长出现差异外 ,经
50 Gy 以上剂量辐照处理的部分原球茎虽在培养 6 周
时仍然存活 ,但继代 4 周后 ,仍未能发育成苗 ,部分变
褐死亡 ,即使成活 ,也大多呈巨型状。同时 ,辐照处理
718　5 期 137Csγ射线辐照对铁皮石斛种胚原球茎的诱变研究
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后出现较多的变异苗 (图 1) ,如一部分植株未发育完
整即出现分叉现象 ,而这种现象在正常情况下通常是
移栽苗第三年老化时才出现 ,可见辐照使部分植株提
前老化。也有一些叶片发育不良的植株 ,叶片有缺绿
现象或出现白绿相间的植株 (花叶苗) 。此外 ,试验中
还观察到花变异的现象 ,和正常苗相比 ,变异苗的花缺
失 2 片花瓣 ,而中萼片和侧萼片与正常花无异 ,只是花
形较小。
表 1 　137 Csγ射线辐照对铁皮石斛种胚原球茎存活率和生长分化的影响
Table 1 　Effect of irradiation on survival rate , growth and differentiation of D. officinale protocorm
剂量
dose ( Gy)
存活率
survival
rate ( %)
株高
height (cm)
增殖率
multiplication
叶片数
leaf number
发根数
root number
根长
root length
(cm)
变异率
rate of differentiation( %)
0 99 1176 ±0. 15 312 512 ±0. 8 714 ±2. 1 3102 ±0. 25 0
25 84 1106 ±0. 11 3 318 514 ±0. 5 310 ±0. 7 3 1142 ±0. 36 3 35 3
50 62 0162 ±0. 05 3 018 3 416 ±0. 5 112 ±0. 4 3 0128 ±0. 13 3 44 3
75 48 0156 ±0. 06 3 016 3 416 ±0. 9 016 ±0. 9 3 0118 ±0. 21 3 56 3
100 18 0136 ±0. 06 3 013 3 412 ±0. 4 — — 70
注 :数值后的“3 ”表示在 01001 水平上差异显著。
Note : The data followed by“3 ”indicated significant at 01001 level .
图 1 　辐照后出现的变异植株和变异花
Fig. 1 　Variant seedlings and flower after irradiation
1 :植株未发育完整即出现分叉 ;2 : 叶片有缺绿或白绿相间植株 ;3 :变异花
1 : seedling appeared stem forfication but the seedling wasn’t full2grown ;2 : leaves appeared chlorophyll2deficient or green2white ;3 : Variant flower
213 　对变异苗的流式分析
对植株细胞流式分析表明 (图 2) ,发生变异的植株
(以花叶苗为例)出现不正常的非整倍现象。正常苗 G0Π
G1 细胞占 67156 % ,G2 细胞占 32144 %。变异苗 (花苗)
的二倍体细胞占 22105 % ,四倍体占 24159 % ,八倍体占 53137 %。变异苗 (花叶苗) 中 ,白色条斑叶片和绿色条斑叶片的细胞流式图与不具白色或绿色条斑的变异苗表现的细胞流式图基本一致 ,只是绿色条斑变异苗 (花苗)的 2 倍体峰 CV 值较小一些 ,从整体上看 ,它们的DNA 倍性是相近的。
图 2 　正常苗 (左)和变异苗 (右)流式图
Fig. 2 　Histogram graphic of normal (left) and abnormal (right) seedling(Left :normal ;Right :abnormal)
818 核　农　学　报 23 卷
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图 3 　变异苗 (花叶苗)叶片条斑部分 (左 ,白色 ;右 ,绿色)流式图
Fig. 3 　Histogram graphic of abnormal seedling(left :white ; right :green)
3 　结语
从试验结果看 ,随着辐照剂量的增强 ,植株高度下
降。在低剂量 (25 Gy)下 ,虽然株高较对照有所下降 ,但
继代后增殖率和相比对照有所升高 ,这和墨兰以及春兰
的研究结果较为相似[7 ,8 ] 。由于铁皮石斛种胚原球茎 ,
从个体的完整性上要好于墨兰的根状茎、高羊茅的愈伤
组织和菊花的外植体叶片 ,因此 ,其半致死剂量 LD50相
对较高 ,达到 67123 Gy。
从种胚原球茎辐照后继代的表现来看 ,叶的分化受
辐照的影响小 ,而根的分化受辐照影响较大。其原因可
能是种胚萌发成种胚原球茎时 ,其叶的生长锥已形成 ,
辐照只能影响到叶片的大小及展开的时间。而根由于
尚未发育 ,因此受辐照的影响较大。
γ射线是一种高能射线 ,可以引起染色体结构的变
化 ,使基因发生缺失、重复、倒位、易位等[4 ] 。变异植株
的流式细胞检测结果表明 ,大多数外部形态发生改变的
植株其细胞内 DNA 倍性也发生改变 ,出现相当多的非
整倍体。而变异苗 (花苗)白色条斑或绿色条斑叶片的
出现 ,可能不是发生了染色体大段缺失 ,而是某些基因
的表达或关闭所引起的。
本试验通过辐照所获得的如花瓣缺失、叶片失绿、
花斑叶等一些非常规生物学性状的植株 ,其中某些性状
不能保持 ,如叶片失绿植株 ,继代后逐步发黄死亡 ,但也
有一些性状能保持下来 ,如白色条斑或绿色条斑性状
等。目前该变异苗已移栽 ,至于是否为药用性状较好的
变异品种及是否为纯合体还需进一步研究。
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