全 文 ：热带亚热带植物学报　2015， 23(1)： 51 ~ 58
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2014–04–16　　　　接受日期： 2014–09–11
基金项目： 国家自然科学基金项目(31101578, 31201652)； 海南省重大科技项目(ZDZX2013012)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项
(1630032012017)资助
作者简介： 杨澜(1990~ )，女，硕士，主要从事园林植物与观赏植物研究。E-mail: 281806994@qq.com
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: yinjunmei2004@163.com
红掌佛焰苞基因qRT-PCR分析中内参基因的筛选
杨澜1,2, 杨光穗1, 李崇晖1, 牛俊海1, 尹俊梅1*
(1. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南 儋州 571737； 2. 贵州省园艺研究
所，贵阳 550006)
摘要： 为筛选红掌(Anthurium andraeanum Linden)中稳定表达、可用于佛焰苞中实时荧光定量 PCR 分析(qRT-PCR)的内参基因，
对 5 个组成型表达基因 EF1-a、UBQ7、ACTB、GADPH、His3 进行表达稳定性分析，并利用所筛选的内参基因研究红掌的二
氢黄酮醇还原酶基因(dfr)的表达水平。结果表明，5 种内参基因在不同品种间的表达稳定性不同。据内参基因标准化因子的
配对差异分析(Vn/n+1)，判定内参基因的最适数目为 2，ACTB 和 UBQ7 在红掌不同品种及佛焰苞发育不同阶段中表达均稳定，
是理想的内参基因。dfr 在不同品种的佛焰苞及佛焰苞发育过程中均有表达，且 dfr 表达水平的变化趋势一致，因此，所选内参
基因是合适的。
关键词： 红掌； 佛焰苞； 实时荧光定量 PCR； 内参基因
doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.01.008
Screening of Reference Genes in Anthurium andraeanum Spathes for
qRT-PCR Analysis
YANG Lan1,2, YANG Guang-sui1, LI Chong-hui1, NIU Jun-hai1, YIN Jun-mei1*
(1. Institute of Tropical Crops Genetic Resources , Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Key Laboratory of Crop Gene Resources
and Germplasm Enhancement in Southern China, Ministry of Agriculture, Danzhou 571737, China; 2. Horticultural Research Institute of Guizhou
Province, Guiyang 550006, China)
Abstract: In order to screening stable reference genes that can be used to real-time quantitative PCR (qRT-PCR)
analysis in Anthurium andraeanum spathes, five constitutively expressed genes, including EF1-a, UBQ7, ACTB,
GADPH and His3, were analyzed expression stability by using qRT-PCR, and the expression of dihydroflavonol
4-reductase gene (dfr) was analyzed by using screened reference gene. The results showed that the expression
stabilities of five reference genes were different among different cultivars. On the basis of the normalization factor
Vn/n+1, the optimum number of reference gene was two. The expression of ACTB and UBQ7 were the most stable
in different cultivars and different development stages of A. andraeanum spathes, so that they were ideal reference
genes. When ACTB and UBQ7 were used as reference genes, the gene dfr expressed in different cultivars and
different development stages of A. andraeanum spathes, and the change trend of dfr expression were consistent.
Thus, both ACTB and UBQ7 were suitable as reference genes for A. andraeanum spathes.
Key words: Anthunium andraenum; Spathe; qRT-PCR; Reference gene
52 第23卷热带亚热带植物学报
实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)是一种准确、快
速的新型核酸定量分析技术，主要是根据荧光共振
能量转移原理，在 PCR 反应体系中加入特定的荧
光标记基团，通过实时监测 PCR 过程积累的荧光
信号分析目标基因的表达量，具有特异性强、灵敏
度高、重复性好、全封闭反应等优点[1–3]。为了消除
不同样品内部及样品间在核糖核酸(RNA)产量、质
量以及反转录效率上可能存在的差异，通常采用内
参基因进行数据校正和标准化[4]。理想的内参基因
在各种实验环境和影响因子下，在各类组织或细胞
中均能相对稳定表达[5]。没有绝对稳定表达的理想
基因，只有在特定试验环境或因素下，在一定类型
的细胞或组织中“有范围”的恒定[4,6–7]。因此，根据
不同试验材料及条件，筛选相对合适的内参基因进
行数据校正和标准化，才能对目的基因表达进行准
确可靠的定量[8–9]。经典的内参基因有肌动蛋白基
因(ACT)、α 微管蛋白基因和 β 微管蛋白基因(TUA,
TUB)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、转录
延伸因子基因(EF1-a)和多聚泛素酶基因(UBQ)等，
其中 ACT、TUA、TUB 是生物体维持生命活动所
必需的细胞器骨架的基本组分，GAPDH、EF1-a、
UBQ 则参与生物体的基本生化代谢过程。ACT
基因在真核细胞进化过程中高度保守，而 TUA 和
TUB 基因则具有良好的保守性。
红掌(Anthurium andraeanum Linden)为天南星
科(Araceae)安祖花属多年生草本植物，其主要观赏
部位佛焰苞形状独特、花期长且苞片颜色基调以红
色为主，少部分有白色、橙色、紫色、绿色和粉色等。
培育新奇花色是红掌育种的重要课题，日渐成熟的
分子育种技术有望缩短这一进程。这就需要阐明
红掌佛焰苞中花色素的生物合成途径。首先应了
解类黄酮代谢途径相关基因(如二氢黄酮醇还原酶
基因 dfr、花青素合酶基因 ANS 等)在红掌佛焰苞
中的表达模式，有研究指出红掌佛焰苞的花色苷生
物合成的控制点不同于其他植物的花器官，且认为
dfr 是关键调控点[10]。因此 dfr 是红掌佛焰苞花色
苷合成并决定佛焰苞颜色的最关键基因之一。
虽然 Gopaulchan 等[11]研究了 18S 核糖体 RNA
(18S)、ACT、TUB 等 8 个内参基因在白色、红色
和橙色佛焰苞的红掌、发育不同阶段及材料不同采
摘时间段的表达稳定性，认为细胞色素 P450 酶基
因 CYP 和多聚泛素酶基因 UBQ5 可作为红掌内参
基因。但是由于被试品种和内参基因不同且本研
究选择的佛焰苞颜色变异更加丰富，为缩小目的基
因在不同植物样本中表达的差异，本研究利用实时
荧光定量 PCR 方法评价 EF1-a、UBQ7、β-肌动蛋
白基因 ACTB、GADPH、组蛋白 His3 等 5 种内参
基因在不同品种红掌佛焰苞(‘Tropical’、‘Cheers’、
‘Coffee’、‘Acropolis’、‘Rapido’和‘Midor’)和佛焰
苞发育过程中的表达水平，用 geNorm、NormFinder
分析其表达稳定性，并利用筛选到的内参基因研究
二羟基黄酮醇还原酶基因 dfr 在红掌不同品种的佛
焰苞及佛焰苞发育不同阶段的表达水平，旨在选择
合适的内参基因以研究花色基因在红掌中的表达
模式，为进一步探究红掌佛焰苞颜色变异的原因和
阐明红掌花色形成的分子机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
选取红掌(Anthurium andraeanum Linden) ‘Tro-
pical’(红色)、‘Cheers’(浅粉红色)、‘Coffee’(咖啡色)、
‘Acropolis’(白色)、‘Rapido’(紫红色)和‘Midor’(绿
色)共 6 个品种定植 2 年正常开花的健康植株，均
为购自安祖公司的组培苗。依据 Collett 等[11]的方
法将佛焰苞发育过程划分为 4 个阶段：佛焰苞初
现、花梗全长为成熟时的 2/3、花梗不再伸长且佛
焰苞卷曲松弛待展开和佛焰苞刚展开并完全伸展。
于晴天早晨 9:00–10:00 分别采集 6 个品种 4 个发
育阶段的佛焰苞，液氮冷冻，–80℃冰箱保存。重
复 3 次。
1.2 总RNA提取及cDNA第一链合成
总 RNA 提取使用通用植物总 RNA 提取试剂
盒(Bioteke 公 司)，经 DNAase (购 自 Thermo 公 司)
处理，紫外分光光度计和 1% 琼脂糖凝胶电泳检测
总 RNA 浓度和质量。使用 RevertAid First Strand
cDNA Synthesis Kit 试剂盒(购自 Thermo 公司)合成
cDNA 第一条链后置 –20℃冰箱保存。
1.3 内参基因的筛选及其表达稳定性检测
从本实验室自建的红掌 cDNA 文库中选择
EF1-a、UBQ7、ACTB、GADPH、His3 等 5 种
内参基因及 dfr 的转录组测序结果(表 1)。利用
Primer Premier 5.0 软件各设计引物 2 对，由上海
Sangon 公司合成。采用引物跨内含子设计方法，对
第1期 53
以上基因在‘Tropical’佛焰苞 cDNA 及 DNA 中进
行常规 PCR 扩增，扩增程序为 94℃预变性 4 min；
94℃变性 30 s，63℃退火 30 s (每个循环降 1℃)，
72℃延伸 2.5 min，5 个循环；94℃变性 30 s，60℃
退火 30 s，72℃延伸 2.5 min，28 个循环；72℃延
伸 10 min。回收、纯化清晰可用的目的片段，经
pMD18-T 载体克隆后送华大基因测序。根据测
序结果设计基因的 qRT-PCR 引物，利用常规 PCR
在模板 cDNA 及 DNA 中定性检测内参引物的扩
增情况及特异性。利用 Eppendorf (Realplex4 型)
RealTime-PCR 仪，以 cDNA 第一链为模板依次稀
释 6 个梯度，每个梯度稀释 5 倍，每个反应 2 次重
复。反应程序按照 SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ试剂
盒(购自 TaKaRa 公司)说明书要求进行。扩增完毕
后温度从 58℃缓慢递增到 95℃，进行熔解曲线分
析以确定扩增产物的特异性。通过荧光定量 PCR
仪自带软件 Realplex4 自动获得引物扩增效率、解
链温度等系列参数。引物扩增效率(E)计算公式为：
E=10–(1/slope)。利用筛选到的内参基因，采用相同的
定量 PCR 反应体系和程序，进行二羟基黄酮醇还
原酶基因(dfr)的表达水平分析。
表 1 实时荧光定量 PCR 的引物序列
Table 1 qRT-PCR primer sequences
引物 Primer 序列 Sequence (5′~3′)
EF1-a F: GCCGGTATTTCTAAGGATGGTCAG
R: GGAACAAATGGAATCTTGTCAGGG
UBQ7 F: GAAAACCCTAACGGGGAAGACGA
R: CCTCCCCTAAGCCTCAAAACCAG
ACTB F: ACATTGTTCTGAGCGGTGGATCT
R: CCGACTCATCGTATTCTGCCTTT
GADPH F: TTTGGGTGACAGCAGGTCGAG
R: AAGCCACCACTGCCAACCG
His3 F: CGTGAGATTGCCCAGGACTTC
R: TCCACAGCACCCCATCAGC
dfr F: CTCGCCCTCATCACAAGGAA
R: ACGTCGAACTCAGGGTAGCG
1.4 数据分析
以佛焰苞的 cDNA 稀释液作为模板，根据 2–△Cq
计算内参基因的相对表达量。采用 geNorm 软件计
算内参基因的平均表达稳定值(M)并进行排序(M
值越小，表达就越稳定)，同时计算内参基因的标准
化因子配对差异度(Vn/n+1)以判定内参基因最适数
目。运用 NormFinder 软件计算不同试验条件下各
内参基因表达稳定值(S)，用 SAS 9.0 进行数据间的
统计分析，Origin 8 作图。
2 结果和分析
2.1 荧光定量PCR的效率
由表 2 可知，5 种内参基因的标准曲线回归
系数为 0.989~0.999，说明 cDNA 初始模板量与相
应的 Ct 值线性关系良好，而各基因的扩增效率为
92%~101%，表明荧光定量 PCR 反应的有效性，且
5 个内参基因的扩增效率差异不显著(P>0.05)。模
板与 Ct 值的较好线性关系和反应的有效性确保了
荧光定量结果的准确性和可靠性。
2.2 内参基因的筛选
2.2.1 内参基因的表达稳定性
geNorm 软件是基于标准差，与默认的平均表
达稳定值 M=0.5 进行比较，若内参基因的 M<0.5，可
考虑作为内参基因，且 M 值越小说明基因稳定性越
好。从图 1: B 可看出，5 种内参基因的平均表达稳
定值 M 为 GADPH=His3与用 NormFinder 软件分析的结果(GADPHACTBV 值为 0.15，若 Vn/n+1<0.15，则不必引入新的内参基
因。本研究中，V2/3=0.141，因此本试验最适内参基
因数目为 2 个。
2.2.2 不同发育阶段内参基因表达的稳定性
在‘Tropical’佛焰苞发育的不同阶段，5 种内
参基因的相对表达量差异极显著(P<0.01)。geNorm
软件分析不同内参基因的表达稳定值 M 均小于
0.5，以 His3 和 EF1-a 的最小，说明其表达最稳定，
其次是 ACTB、UBQ7 和 GADPH (图 2: B)。标准
因子配对变异度显示 V2/3=0.131。NormFinder 软件
的分析结果 ACTB 5 种内参基因在‘Rapido’佛焰苞发育第 2 阶段
的表达量均最高(图 3: A)。geNorm 软件分析各内参
基因的 M 值为 GADPH=ACTB标准因子配对变异度显示 V2/3=0.055。NormFinder
软件分析的 5 种内参基因的 S 值为 ACTB = GADPH<
UBQ7杨澜等：红掌佛焰苞基因qRT-PCR分析中内参基因的筛选
54 第23卷热带亚热带植物学报
表 2 Real-time RT-PCR 检测定量引物的扩增效率
Table 2 Amplification efficiency of qRT-PCR primers used in real-time RT-PCR analysis
引物 Primer 标准曲线方程 Standard curve equation 回归系数 Regression coefficient (R2) 扩增效率 Amplification efficiency (%)
EF1-a y = –3.302x + 35.05 0.989 101
UBQ7 y = –3.302x + 37.25 0.994 101
ACTB y = –3.517x + 38.16 0.998 92
GADPH y = –3.520x + 36.35 0.991 92
His3 y = –3.334x + 34.77 0.999 100
表 3 5 种内参基因在佛焰苞发育第 3 阶段中表达稳定度的排序
Table 3 Rank of five reference genes in the 3th development stages of spathe by stability values
内参基因 Reference gene M 排序 Rank S 排序 Rank 标准差 Standard deviation 变异系数 Coefficient of variation
GADPH 0.306 1 0.166 1 0.33 91.59
UBQ7 0.402 2 0.201 2 0.33 91.56
ACTB 0.461 3 0.262 3 0.33 104.47
His3 0.306 1 0.308 4 0.35 84.28
EF1-a 0.587 4 0.384 5 0.34 116.51
图 2 内参基因在‘Tropical’佛焰苞发育不同阶段的相对表达量(A)和平均表达稳定值 M (B)
Fig. 2 Relative expression (A) and average expression stability M (B) of reference gene at four development stages of ‘Tropical’ spathe
图 1 内参基因在佛焰苞第 3 发育阶段中的相对表达量(A)及平均表达稳定值 M (B)
Fig. 1 Relative expression of reference genes (A) and expression stability value M (B) in the 3th developmental stage of spathe
第1期 55
‘Acropolis’佛焰苞发育过程中，5 种内参基
因的表达量同样是在第 2 阶段达到最高(图 4: A)。
运用 geNorm 计算各基因平均表达稳定值 M，结
果表明只有 ACTB、UBQ7 和 EF1-a 的 M 值小于
0.5。图 4: B 所示最稳定表达的内参基因为 UBQ7
和 ACTB。标准因子配对变异度显示 V2/3=0.130。
NormFinder 软 件 分 析 的 结 果 是 EF1-aUBQ7综合分析，5 种内参基因在不同品种红掌和不
同发育阶段的佛焰苞 mRNA 中的表达稳定性差异
极显著，从表 3、4 可以看出 GADPH 在‘Acropolis’
佛焰苞中表达稳定值大于 0.5，His3 在‘Acropolis’
佛焰苞中表达稳定值同样大于 0.5，EF1-a 在不
同品种红掌佛焰苞中表达稳定值也大于 0.5，而
ACTB 和 UBQ7 不论是在不同品种红掌还是佛焰
苞发育不同阶段，其表达稳定性均稳定，适合作为
红掌佛焰苞中基因实时定量 PCR 分析中的内参
基因。
图 3 内参基因在‘Rapido’佛焰苞发育不同阶段的相对表达量(A)及平均表达稳定值 M (B)
Fig. 3 Relative expression (A) and average expression stability M (B) of reference genes in four development stages of ‘Rapido’ spathe
图 4 内参基因在‘Acropolis’佛焰苞发育不同阶段相对表达量(A)及平均表达稳定值 M (B)
Fig. 4 Relative expression (A) and average expression stability M (B) of reference genes in four development stages of ‘Acropolis’ spathe
2.4 dfr的表达
取红掌 6 个品种第 3 发育阶段的佛焰苞，以
ACTB 和 UBQ7 为内参基因，采用相同的定量 PCR
反应体系，进行 dfr 表达水平的分析。从图 5 可见，
2 种内参基因的定量结果变化趋势一致。因此，
不同品种红掌佛焰苞的定量分析中可取 ACTB 和
UBQ7 校正基因表达量的平均值。
同 样 以 ACTB 和 UBQ7 为 内 参 基 因，验 证
‘Tropical’、‘Rapido’和‘Acropolis’佛焰苞 4 个发育
阶段中 dfr 的表达水平。如图 6 所示，在 3 个品种
佛焰苞的发育过程中，dfr 的表达水平变化趋势一
致，说明所选内参基因合适。
杨澜等：红掌佛焰苞基因qRT-PCR分析中内参基因的筛选
56 第23卷热带亚热带植物学报
图 6 佛焰苞发育过程中 dfr 的表达
Fig. 6 Expression of dfr in spathe development stages
表 4 内参基因在红掌佛焰苞中表达稳定度的排序
Table 4 Rank of reference genes in anthurium spathe by stability values
材料
Material
内参基因
Reference gene
M
排序
Rank
S
排序
Rank
标准差
Standard deviation
变异系数
Coefficient of variation
‘Tropical’ His3 0.252 1 0.147 2 0.35 71.96
ACTB 0.355 2 0.110 1 0.31 59.02
EF1-a 0.252 1 0.204 3 0.30 75.23
UBQ7 0.394 3 0.220 4 0.24 55.74
GADPH 0.451 4 0.277 5 0.34 64.99
‘Rapido’ GADPH 0.116 1 0.142 2 0.28 46.85
ACTB 0.116 1 0.122 1 0.22 53.25
EF1-a 0.154 2 0.156 4 0.29 49.02
UBQ7 0.275 3 0.146 3 0.28 39.34
His3 0.330 4 0.227 5 0.27 46.46
‘Acropolis’ EF1-a 0.411 2 0.187 1 0.34 88.39
ACTB 0.320 1 0.268 2 0.36 88.26
UBQ7 0.320 1 0.303 3 0.24 67.87
His3 0.553 3 0.351 4 0.35 98.65
GADPH 0.649 4 0.418 5 0.39 67.07
图 5 佛焰苞中 dfr 的表达
Fig. 5 Expression of dfr in spathe
第1期 57
4 讨论
红掌作为极具观赏价值的盆花和切花越来越
受到人们的追捧，市场十分畅销，然而在品种选育
上还存在很大差距，具有自主知识产权的新花色红
掌品种仍然不多[13]。创造新奇花色成为红掌育种
的重要课题，因此需要了解红掌花色素合成和调
控的分子机制。为研究红掌佛焰苞中花色基因表
达模式，本研究利用实时荧光定量 PCR 方法评价
5 种 内 参 基 因(EF1-a、UBQ7、 ACTB、GADPH 和
His3)的平均表达稳定性，以筛选出定量分析红掌不
同品种和不同发育阶段佛焰苞中花色基因表达水
平的最适内参基因。
合适的内参基因是用于荧光定量 PCR 中识
别目的基因准确表达模式的关键因素[14]。理想的
内参基因应具备在所有组织及细胞类型中均有表
达，在细胞组成及基本功能的维持中起着重要作
用；在不同环境和试验因素下稳定表达，不受任何
外内源因素的影响；表达稳定且与目标基因表达水
平相似[15–16]。但任何一个内参基因的稳定表达都
是相对的。因此，应根据具体试验体系筛选合适数
目的内参基因。本研究挑选 6 个品种红掌的佛焰
苞，分别探究 5 种内参基因在不同品种的佛焰苞
及 3 个 品 种(红 色‘Tropical’、紫 色‘Rapido’、白 色
‘Acropolis’)佛焰苞发育过程中的表达稳定性。运
用 geNorm、NormFinder 和统计软件评价各内参
基因的表达稳定性。通过 geNorm 软件内参基因
标准化因子的配对差异分析(Vn/n+1)，可选择最适数
目的内参基因进行 qPCR 结果的校正。本研究中
最优内参基因数目均为 2 个。5 种内参基因在不
同品种的红掌佛焰苞及佛焰苞发育过程中的表达
稳定性差异极显著(P<0.01)。不同品种的佛焰苞
中，GADPH 和 His3 为表达最稳定的内参基因，
但 GADPH 在‘Tropical’和‘Acropolis’佛焰苞的发
育不同阶段中表达稳定性最差。许多研究也曾指
出 GADPH 是表达稳定性较差的内参基因[11,17–19]。
而在红掌‘Tropical’佛焰苞发育过程中，EF1-a 和
His3 为表达最稳定的内参基因。His3 也是棉花
(Gossypium hirsutum)不同发育阶段中表达水平最
稳定的内参基因之一[20]，但 His3 在‘Rapido’佛焰
苞发育过程中的表达稳定性最差。也有研究表明
EF1-a 在 杨 树(Populus tremulas)[21]、黄 瓜(Cucumis
hystrix / C. sativus)[14]及 水 稻(Oryza sativa)[17]不 同
组织中均是最稳定的内参基因。‘Rapido’佛焰苞发
育过程中表达稳定性最好的内参基因为 ACTB 和
GADPH。‘Acropolis’佛焰苞发育过程中，ACTB 和
UBQ7 为表达稳定性最好的内参基因。有研究表明
在瓜叶菊(Pericallis hybrida)发育不同阶段表达稳定
性最好的内参基因为 ACTB[22]；周兰等[23]的研究认
为 UBQ 是苹果不同基因型和发育不同阶段表达最
稳定的内参基因，而 UBQ7 是棉花不同组织中表达
稳定性最好的内参基因之一[20]。综合分析，ACTB
和 UBQ7 为红掌不同品种佛焰苞及佛焰苞发育过
程中进行基因定量表达分析最理想的内参基因。
dfr 是花色苷生物合成中的“后期结构基因”，
且能催化无色的二氢山奈酚(DHK)、二氢槲皮素
(DHQ)和二氢杨梅黄素(DHM)还原成不稳定的无
色花色素。本实验利用已筛选出的 ACTB 和 UBQ7
作为内参基因，分析 dfr 在 6 个品种红掌佛焰苞同
一发育阶段及‘Tropical’、‘Rapido’、‘Acropolis’佛
焰苞发育 4 个阶段的表达水平，结果表明，该基因
的表达变化趋势基本一致，说明 ACTB 和 UBQ7 适
合校正不同品种红掌佛焰苞和佛焰苞不同发育阶
段中花色基因的表达量。
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