全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，l4(3)：179—182
Journal ofTropical and Subtropical Botany
基因枪法将 GAI基因导入巴西橡胶的研究
王 颖． 陈雄庭 ， 张秀娟， 彭 明
(中国热带农业科学院热带生物技术研究所 热带作物生物技术国家重点实验室，海口571101)
摘要：为了探讨利用基因工程技术进行橡胶树品质改 良的可行性，用基因枪轰击巴西橡胶(Hevea brasiliensis)愈伤组
织，将 GAI矮化基因导入橡胶受体中，通过 50mgL-l。 那霉素筛选鉴定，优化了基因枪法转化橡胶的各种参数。结果
表明，DNA金弹与靶细胞的距离为 9 cm，每皿轰击一次时，胚状体诱导率可以达到 1．87％。经过 GUS组织染色和 PCR
扩增鉴定，初步确定 GAI基因已经整合到橡胶基因组中。
关键词：巴西橡胶；基因枪；GAI基因；遗传转化
中图分类号：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2006)03—0179-04
Transfer of GAl Gene into Hevea brasiliensis
by Particle Bombardment
WANG Ying， CHEN Xiong—t ing’， ZHANG Xiu—juan， PENG Ming
(State Key Laboratoryfor Tropical Crops Biotechnology,J，Is￡ ￡Ⅱe of Tropical Bioscience and Biotechnology,
Chinese Academy of Tropical Agricuhura!Sciences，Haikou 571 101，China)
Abstract： GA I gene was tr．ansferred to calli from anther culture ofHeyea brasiliensis by particle bombardment to
develop dwarf rubber flees． Plant material was bombarded with plasmid PBI121 containing kanamycin resistant，
G吣 and GA I genes．Kanamycin concentration at 50 mg L was used as selection pressure after concentration
gradient experiments．The experiments showed that each plate of Hevea calli，which was bombarded once by gold
particles coated with the plasmid and the distance between particles and target cells at 9 cm，had good results，the
embryoid induction rate reaching to 1．87％． It was confirmed that GAI gene had been inserted into Hevea genome
as detected by histochemical staining using X—gluc and PCR analysis．
Key words：Heyea brasiliensis；Particle bombardment；GA I gene；Genetic transform ation
全世界大约有 2 000多种植物可以合成天然橡
胶，巴西橡胶树 Hevea brasiliensis)因胶乳产量高、
质量好、易于获取而具有商业开发价值，成为世界
上天然橡胶的主要来源。由于巴西橡胶树是多年生
乔木，常规育种周期长，选育种受到很大的限制。不
断发展的基因工程技术解决了传统育种中不能突
破的问题，其优点在于可有 目的地改变植物的某一
性状而不影响其他性状，并缩短育种周期。随着转
基因技术的日臻完善，目前已经获得了许多转基因
植物，但是橡胶树的基因转化仍存在很大困难。
1994年Arokiaraj等利用基因枪法获得了第一株转
基因橡胶植株【”。1998年他们又尝试用农杆菌介导
法转化橡胶愈伤组织，但是转化效率很低【2]。2000
年Montoro等人研究了钙在橡胶的农杆菌转化中的
收稿日期：2005一ll一28 接受日期：2006—03—16
基金项目：国家自然科学基金 (30460114)：热带作物生物技术国家重点实验室开放资金项目(KL200401)；中国热带农业科学院重点科技
项目(Rykj0201)资助
致谢：彭世清、李维国、吴坤鑫、崔百明、徐碧玉等同志参加部分工作。
通讯作者Corresponding author
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热带亚热带植物学报 第 l4卷
作用，但并没有得到转基因植株[31。一些植物的矮化
突变体是由于体内赤霉素(GA)含量低，或对 GA不
敏感[41，从而引起植株矮化，因此，降低植物体内GA
的浓度和减少植物对 GA的敏感性都可能改变植
物的高度，获得矮化植株。GAI是一个在拟南芥
(，4 rabidopsis thaliana)中发现的GA应答的负调控因
子，过量表达会引起植株矮化[51。本研究以 GUS基因
为报告基因，NPT II(新霉素磷酸转移酶，Neomycin
phosphotransferase)基因为筛选标记基因，用基因枪
轰击橡胶愈伤组织进行转化实验，将 GA，矮化基因
导入巴西橡胶，对基因枪转化橡胶愈伤组织的方法
进行了初步探索，旨在建立巴西橡胶的基因枪转化
体系，为利用基因工程技术培育矮生橡胶品种奠定
基础 。
1材料和方法
植物材料 为巴西橡胶 (Hevea brasiliensis)
品种海垦 2，橡胶花采自中国热带农业科学院实验
农场 。
转化载体 转化 载体质粒 PBI121，由本
研 究所 彭世清博士提供 ，其 中含有 卡那 霉素
(kanamycin)抗性基因和 GUS报告基因，目的基因
为 GA，基 因[61。
质粒DNA提取 参照 《分子克隆实验指南》[71
大肠杆菌碱裂解抽提法制备质粒 DNA。
愈伤组织诱导 橡胶花选取发育阶段处于
单核晚期的雄花，用纱布包好，70％酒精表面消毒
30 S，0．2％HgC12消毒 10 min，再用无菌水冲洗 4—5
次，然后剥出花药，接种于愈伤组织诱导培养基
上[81，培养室保持白天 26—27"C，晚上 24—25"C，暗培
养 35—40 d后即可用于转化。
基因枪转化 微弹的制备程序参照 Becker
等[91的方法。将橡胶愈伤组织暗培养 35—40 d后，转
入培养皿中预培养 2 d， 将含有 GA，基因的质粒
DNA包裹于金粉表面，用基 因枪轰击转化 已经
预培养好的橡胶愈伤组织 ，轰击时氦气压力为
l 100 psi，射 程为 6 cm、9 cm，每枪 金粉用 量为
0．5 mg，轰击一次。轰击后愈伤组织暗培养 2—5 d后
转入加有 50 mg L- 卡那霉素的愈伤组织诱导培养
基中。15 d左右转入胚状体诱导培养基中，每 20d
继代一次。
卡那霉素选择压的确定 将培养了40 d的
橡胶 愈伤 组织置于含有 卡那霉素 浓度分 别为
0 mg L～、20 mg L-1,~50 mg L- 、100 mg L～、150 mg L。
的愈伤组织诱导培养基上，经过 15 d的暗培养后，
观察愈伤组织生长情况。
GUS基因的表达检测 基因枪轰击后，取经
过一段时间培养的橡胶愈伤组织和胚状体浸泡在
X—Gluc染色液中染色[81，于 37℃保温培养 20—24 h，
取出材料后，用 75％的乙醇漂洗，再先后用 20％乙
醇，50％乙醇各浸泡 20 min以上，分别用肉眼和显
微镜观察染色情况，染色材料在 80％乙醇的 FAA
固定液中保存。
PCR检测 橡胶 DNA提取参照 《植物基因
工程》[101的方法。根据 GAI基因序列设计引物：P1：
5’一ATGAAGAGAGATCATCATCATCAT一3’： P2：
5’一CTAATTGGTGGAGAGTTTCCAAGC一3’。 以橡
胶 DNA为模板，94"C预变性 3 min，反应条件：94℃
30 S，55℃ 30 S，72℃ 90 S，35个循环后在 72℃中继
续延伸 10min，于 40C保存。
2结果和分析
2．1微弹射程对基因转化的影响
取 282块生长 良好的橡胶愈伤组织预培养
2 d，然后进行基因枪转化。其中 107块愈伤组织用
9 cm的射程，75块愈伤组织用 6 cm 的射程，各轰
击 1次。恢复培养 2—5 d以后，转入加有 50 mg L
卡那霉素的胚诱导培养基中，20 d后，观察到在本
实验中9 cm射程的效果比较好，胚状体诱导率为
1．87％(图版 I：1)，而以6 cm的射程轰击几乎很难
诱导出胚状体(图版I：21。
2．2卡那霉素浓度对橡胶愈伤组织的筛选
为了确定转化植株的筛选浓度，本研究采用不
同的卡那霉素浓度梯度对正常的橡胶愈伤组织进
行了抑制实验，将橡胶愈伤组织分别置于含有卡那
霉 素 0 mg L～、20 mg L一、50 mg L- 、l00 mg L～、
150 mg L 的培养基上，15 d后观察愈伤组织的生
长情况，结果表明，经 50 mg L-，以上卡那霉素处理
后，愈伤组织不再生长，因此，选择 50 mg L-l作为转
化愈伤组织的选择压。
2．3 GUS基因的表达检测
基因枪轰击后，经过一段时问的恢复培养，取
生长 良好的橡胶愈伤组织，以未转基因愈伤组织作
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2．4胚状体成 熟和 PCR检测
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