全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 9期，2009年 9月 899
收稿 2009-03-11 修定 　2009-08-12
资助 国家自然科学基金(3 0671 273 )和 “97 3” 前期研究项目
(20 08CB1 1700 6)。
* 通讯作者(E-mail: zenghl@mail.hzau.edu.cn; Tel: 027-
8 7 2 8 0 6 8 5 )。
植物蛋白质磷酸化的研究技术
魏鑫, 李海霞, 陈卫卫, 陈镇, 曾汉来 *
华中农业大学农业部华中作物生理生态与栽培重点开放实验室, 武汉 430070
Technique for Research of Protein Phosphorylation in Plant
WEI Xin, LI Hai-Xia, CHEN Wei-Wei, CHEN Zhen, ZENG Han-Lai*
Key Laboratory of Huazhong Crop Physiology, Ecology and Production, Ministry of Agriculture, Huazhong Agricultural University,
Wuhan 430070, China
提要: 本文介绍植物蛋白质磷酸化研究的技术及其应用情况, 并对这些技术的应用前景作了展望。
关键词: 蛋白质磷酸化; 磷酸化蛋白质富集; 磷酸化检测
蛋白质磷酸化是生物体内普遍存在的一种蛋
白质翻译后修饰过程, 在细胞信号传导、酶活性调
节中起分子开关的作用, 是原核和真核生物代谢调
控的关键环节(De la Fuente van Bentem和 Hirt
2007)。蛋白质磷酸化与去磷酸化的可逆调控机制
几乎参与生命活动的所有过程, 包括细胞的增殖、
发育和分化等。有研究表明, 在哺乳动物细胞活动
的任何时期都至少有1/ 3以上的蛋白质是经过磷酸
化修饰的(Zolnierowicz和 Bollen 2000)。
蛋白质的磷酸化过程是通过蛋白质磷酸化激
酶将ATP的磷酸基转移到蛋白质的特定位点如苏
氨酸、丝氨酸、酪氨酸等残基上实现的, 在原核
生物中还发现组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸残基可
以被磷酸化。在拟南芥中现已发现了1 003种激酶,
占其所有蛋白质比例的 4%, 大致是哺乳动物激酶
数量的 2倍(Manning等 2002)。Sugiyama等(2008)
报导在拟南芥中, 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基
发生磷酸化的比例约是 85:10.7:4.4, 和人的蛋白质
磷酸化特征非常接近(Molina等 2007)。
植物在地球上的分布范围比动物更广, 能适应
动物所不能适应的各种环境。植物对各种环境信
号刺激, 如光照、辐射、温度、水分、营养缺
失、病虫害的反应等, 都伴随着蛋白质磷酸化的发
生(Krsten等 2006), 因此在植物发育过程中, 蛋白
质的磷酸化是最重要的调节方式(De la Fuente van
Bentem等 2008)。大量实验表明, 改变植物的生长
环境, 可诱导细胞内蛋白质磷酸化现象大量发生, 从
而导致细胞内蛋白质的组成和特性发生变化, 最终
导致植物的生理状态发生改变。弄清关键蛋白的
磷酸化水平变化规律, 可从分子水平上揭示植物重
要性状的代谢途径和调节机制、鉴定重要基因功
能。
功能蛋白质的磷酸化调节是一种精细的代谢
调节过程, 其发生的时空关系复杂, 同一蛋白可由
不同的激酶对其进行多个位点的磷酸化和去磷酸
化, 从而改变其结构和功能(Temporini等 2008)。
在任意时刻同一个细胞中的各种蛋白质磷酸化水平
都不尽相同, 其细微差异可导致代谢上的较大差异,
由于磷酸化蛋白含量较低, 存在分离、检测和分析
上的困难, 蛋白质磷酸化研究是生物学研究中的热
点同时也是难点。因此, 在较长一段时间内蛋白质
磷酸化研究取得的成果并不是很多(Reinders和
Sickmann 2005)。第 1篇关于植物蛋白质磷酸化
的文献发表于20年前(Michel等1988), 到现在也只
找到为数不多的蛋白质磷酸化位点。
随着物理、化学和生物技术的发展、融合与
更新, 近年来蛋白质磷酸化的研究中发展了很多收
集和富集磷酸化蛋白质的新方法, 大幅度提高了磷
酸化蛋白质的富集丰度, 为蛋白质磷酸化的高通量
研究打下了基础。由于双向电泳、质谱和蛋白质
芯片技术的精度提高, 蛋白质的磷酸化和对应的激
酶进行准确分析成为可能(Benschop等 2007)。本
文介绍近年来植物蛋白质磷酸化研究领域中应用较
多的分离、富集和检测蛋白质磷酸化的技术与方法,
以及这些方法在植物蛋白质磷酸化领域中的应用。
植物生理学通讯 第 45卷 第 9期，2009年 9月900
1 磷酸化蛋白质的富集技术
在蛋白质组中, 蛋白质发生磷酸化的程度较低,
磷酸化多肽在蛋白质水解产物中也表现为很低的丰
度, 在检测中容易受高丰度的非磷酸化蛋白质和多
肽干扰。所以, 蛋白质磷酸化水平研究中非常重要
的内容就是采用高效的富集策略, 对磷酸化蛋白或
者磷酸化多肽进行富集, 提高磷酸化蛋白质和多肽
的相对含量。近年来, 随着磷酸化蛋白质和磷酸化
多肽的富集技术的重点研究, 发展出了很多极具应
用价值的富集技术, 如固相金属离子亲和色谱、强
阳离子交换色谱和二氧化钛柱层析等技术。
1.1 固相金属离子亲和色谱富集磷酸化肽段 固相
金属离子亲和色谱(immobilized metal ion affinity
chromatography, IMAC)技术最初只用于组氨酸标
记蛋白的亲和纯化, 现已发展为应用最广泛的磷酸
化蛋白和多肽的富集技术(Laugesen等 2004)。其
原理是磷酸化蛋白和多肽与固相化的金属离子通过
静电相互作用, 可被选择性地吸附在 IMAC的硅脂
柱上, 键合在螯合底物上的金属离子(通常是 Fe或
Ga)选择性地与磷酸化肽段中的磷酸部分相结合, 并
且在高pH或磷酸缓冲液中磷酸化肽段可以释放出
来。在处理样品时, 非磷酸化的杂质会先被洗脱下
来, 而目标蛋白和多肽则被特定洗脱液洗脱, 可以
达到较好的富集和分离目的(Feuerstein等 2005)。
此方法的优点在于每一个可溶磷酸化肽段, 不管其
长度如何都能被富集, 而且 IMAC柱洗脱下来的样
品可直接用于质谱分析。这种方法的局限性在于
一些富含酸性氨基酸的蛋白和多肽可能会与柱材料
相结合从而引入杂质, 另外一些含多个磷酸化位点
的蛋白和多肽因结合较紧密则难于被洗脱, 会造成
部分磷酸化蛋白和多肽的丢失( S t e n s b a l l e 等
2001)。
通过与各种质谱检测技术联用, IMAC的方法
已通过较大改进用来富集磷酸化多肽。Barnouin
等(2005)使用1,1,1,3,3,3-六氟代异丙醇作为固定和
冲洗缓冲液在提高富集的效率的同时, 也能提高基
质辅助激光解析电离质谱(matrix assisted laser des-
orption ionization-mass spectrometry, MALDI-MS)
的检测效率。Kokubu等(2005)发展出了一种更有
效利用 IMAC的方法,可以减少非特异性的蛋白和
多肽的引入。他们将 IMAC的珠子包裹在C18的材
料中, 再放置于 200 μL的枪头中, 这样 IMAC就可
以和其它富集方法如强阳离子交换(strong cation
exchange, SCX)和强阴离子交换(strong anion
exchange, SAX)联用(Nuhse等 2003, 2004)。Nuhse
等(2004)采用SCX和 IMAC联用, 再用液相色谱质
谱(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-
MS)检测, 成功的在拟南芥(Arabidopsis thaliana)膜
蛋白中发现了 300多个蛋白质磷酸化位点。采用
这些改进的IMAC可以高效系统的分析蛋白质的磷
酸化水平。
1.2 二氧化钛柱层析富集磷酸化肽段 近年来, 为了
解决非特异性磷酸化多肽对IMAC材料的结合的问
题, 二氧化钛(TiO2)柱层析已用于富集磷酸化多肽
样品(Pinkse等 2004)。其原理与 IMAC相似, 在此
方法中, 键合在螯合底物上的Ti离子选择性地与磷
酸化多肽中的磷酸部分相结合, 并且在高 pH或磷
酸缓冲液中磷酸化多肽可以释放出来。采用该方
法, 各种磷酸化多肽都可以被成功的富集, 但是, 也
仍然有含多个酸性氨基酸残基的酸性多肽被引入洗
脱产物中。Larsen等(2005)用 2,5-二羟基苯甲酸
(2-hydroxy-5-methoxybenzoic acid, DHB)来固定多
肽, 可以大大减少非特异性磷酸化多肽的结合, 同
时保持磷酸化多肽的高效结合, 有效地对TiO2柱层
析进行改进。同时,这种方法可以更快捷、更容
易地与MALDI-MS/LC-MS/MS联用。
Jensen和 Larsen (2007)以 12种标准蛋白质为
材料, 利用胰蛋白酶酶解为大小不一的肽段。分别
用IMAC和改进TiO2柱层析富集磷酸化肽段, 经质
谱检测发现TiO2柱层析比IMAC富集的磷酸化肽段
多 1/3以上。Prak等(2008)研究拟南芥细胞膜蛋白
的磷酸化的结果显示, 与IMAC相比, 用改进的TiO2
柱层析法富集磷酸化蛋白质, 经质谱检测分析, 可
以多找到 6个未报导过的蛋白质磷酸化位点。采
用这种改进的TiO2柱层析的方法, 可以显著提高富
集的效率, 有利于蛋白质磷酸化的检测。TiO2柱层
析有可能逐步取代 IMAC。
1.3 强阳离子交换色谱分离磷酸化肽段 强阳离子
交换( S C X )色谱可以应用于磷酸化多肽的富集
(Ballif等2004)。在通常的强阳离子交换条件下(pH
2.7), 经胰蛋白酶作用产生的多肽大多带 2个正电
荷, 而由于磷酸基团带 1个负电荷, 酶切肽段在酸
性溶液中所带电荷会依所带磷酸基团的多少减至
+1、0或更低。所以, 在 SCX色谱中, 单电荷的
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肽段比多电荷的肽段流出时间早, 因此磷酸化肽段
便能从多电荷复杂的非磷酸化肽段中得到分离富
集。分离富集得到的肽段一般采用反向 LC-MS/
MS 进行检测。
采用这种方法, Beausoleil等(2004)从海拉细胞
(Hela cell)核中发现了967种蛋白的2 002个磷酸化
位点。另外, 在小鼠脑细胞中同样也发现了 500种
蛋白质发生磷酸化(Ballif等 2004)。若将 SCX和
IMAC联用, 最终找到的磷酸化位点数量可达到单
独使用其中一种方法的 3倍, 这说明SCX和 IMAC
之间是互补的, 可以在蛋白质磷酸化样品制备中联
用(Trinidad等 2006)。
1.4 磷酸钙沉淀法富集磷酸化肽段 磷酸钙[Ca3(PO4)2]
沉淀法是一种新型的从复杂样品的酶解液中富集磷
酸化肽段的方法, 该方法与前述的方法结合可以高
效的富集磷酸化肽段。一般采用Ca3(PO4)2对酶解
液的磷酸化肽段沉淀之后再用 IMAC或者TiO2法,
富集效率可以达到 90%。碱性条件下, 磷酸化肽
段的磷酸基团可以与磷酸钙螯合沉淀, 而在酸性条
件下, 磷酸化肽段可被释放。该方法的优点是迅速
快捷, 成本低廉, 可以对复杂样品进行初步的筛选,
降低样品的复杂度。
Zhang等(2007)采用磷酸钙沉淀的方法对水稻
胚细胞中的磷酸化蛋白质进行初步富集, 再分别与
IMAC联用, 再以 LC-ESI-MS检测磷酸化位点, 共
检测到125种蛋白质的242个发生磷酸化位点。还
用MALDI-TOF-MS来分别检测了磷酸钙沉淀和上
清液中的磷酸化肽段, 证明沉淀部分可以富集大部
分的磷酸化肽段。说明, 在处理复杂样品时用磷酸
钙沉淀的方法对磷酸化肽段进行初步的富集, 可以
降低样品的复杂度, 从而让低丰度的磷酸化蛋白更
容易检测到, 可以应用于研究发生频率较低的蛋白
质磷酸化研究。
1.5 金属氧化物亲和层析 金属氧化物亲和层析
(metal oxide affinity chromatography, MOAC)是最
近建立的一种以Al(OH)3为基础的富集磷酸化蛋白
质和多肽的方法。其原理是利用Al(OH) 3中Al3 +与
磷酸基团的亲和作用实现磷酸化蛋白质及多肽的富
集。这种富集方法适应于生物体内的蛋白质磷酸
化的大规模检测, 也比现有的一些商业性的磷酸化
蛋白质富集试剂盒的效率更高而且更经济。与
IMAC方法相比, 它很大程度上减少了非磷酸化酸
性多肽的结合。
Wolschin和Weckwerth (2005)采用MOAC富
集拟南芥种子中的磷酸化蛋白质。他们将拟南芥
种子的裂解液与Al(OH)3 浆液充分混合, 离心后去
上清液, 得到富集的样品基质。用洗脱液洗涤基
质,得到磷酸化多肽溶液。再用LC-MS检测蛋白质
的磷酸化, 共发现9个蛋白质的16个位点发生了磷
酸化。该方法的成功应用为植物体内的蛋白质磷
酸化的检测提供了一种新的选择。
2 蛋白质磷酸化检测技术
蛋白质磷酸化的检测主要包括: 鉴定蛋白质或
者多肽是否发生磷酸化、测定磷酸化的形式和位
点、检测磷酸化的程度以及探索磷酸化发生的途
径和作用的激酶。相应的检测技术包括凝胶电
泳、质谱和蛋白质微阵列等。
2.1 凝胶电泳检测蛋白质磷酸化 凝胶电泳是应用
最早的一种蛋白质的磷酸化检测技术。富集的磷
酸化蛋白或肽段, 采用二维凝胶电泳进行分离, 可
检测丰度较高的磷酸化蛋白。根据蛋白质磷酸化
形式不同造成磷酸化蛋白在凝胶中迁移速率的不同
可用来鉴定蛋白质磷酸化修饰形式的不同。将切
出磷酸化蛋白或肽段的斑点做进一步MALD I-
TOF-MS鉴定, 或者与 LC-MS/MS联用, 可直接鉴
定磷酸化蛋白或肽段的种类, 并准确定位蛋白质发
生磷酸化的位点。
近几年开发出了一种独特的荧光染料 Pro-Q
Diamond Phosphoprotein Stain (Pro-Q DPS), 用来
检测聚丙烯酰胺凝胶中的磷酸化蛋白质。这种染
料能直接、特异、高效地结合磷酸化蛋白质中被
磷酸化的氨基酸残基。并且这种染色方法还可以
和其它蛋白质染料如考马斯亮蓝、银染等一起使
用, 也适合在染色之后进行质谱检测。该染料也能
用来定量分析双向电泳凝胶中的蛋白质磷酸化。
Agrawal和 Thelen (2005)发展了一种改进的 Pro-Q
DPS染色方法, 可提高检测单向和双向电泳凝胶中
的蛋白质磷酸化分辨效果。与传统方法相比, 该方
法的实验操作简化, 成本降低1/4, 实验的可重复性
提高。同时这种改进的方法可以提高信噪比, 提高
对低丰度磷酸化蛋白的识别。另外, Pro-Q DPS与
差异性的双向电泳联用, 还可以充分发挥2种方法
的优势, 以实现蛋白质磷酸化的高度特异、灵敏、
精确的定量(Stasyk等 2005)。
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Agrawal和Thelen (2006)采用高分辨率的双向
电泳, 并用特异性强的 Pro-Q DPS染色, 在不同发
育时期的油菜籽粒中共发现了300多个发生磷酸化
的蛋白质。用 LC-MS/MS检测技术。鉴定出 70
个蛋白质在油菜籽发育的不同时期都发生了磷酸
化, 其功能包括参与信号传导、蛋白质合成、抗
病、能量代谢、细胞生长分化等。这是第一次
成功对植物中蛋白质磷酸化进行大规模高通量的检
测。Pro-Q DPS染色法有望在高通量的蛋白质磷
酸化研究中得到更广泛的应用。
2.2 质谱技术鉴定蛋白质磷酸化 质谱技术广泛应
用于低丰度的蛋白质磷酸化的检测, 可准确鉴定磷
酸化蛋白质的种类, 并预测发生磷酸化的位点和形
式, 其快速发展为蛋白质磷酸化的鉴定提供了强有
力的工具。质谱是带电原子、分子或分子碎片按
质荷比(或质量)的大小顺序排列的图谱。通过质
谱分析, 可以获得磷酸化蛋白或多肽的分子量、分
子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的
信息(Reinders和 Sickmann 2005)。迄今, 在蛋白
质磷酸化研究中应用较多的是MALDI-TOF-MS和
LC-MS/MS。近年来, 通过一些关键技术环节的改
进, 质谱技术得到了较大提高。
2.2.1 电喷雾质谱技术 电喷雾质谱技术(electrospray
ionization mass spectrometry, ESI-MS)是在毛细管
的出口处施加高电压, 所产生的高电场使从毛细管
流出的液体雾化成细小的带电液滴, 随着溶剂蒸发,
液滴表面的电荷强度逐渐增大, 最后液滴崩解为大
量带一个或多个电荷的离子, 致使分析物以单电荷
或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的
特点是产生高电荷离子而不是碎片离子, 致使质量
电荷比(m/z)降低到多数质量分析仪器都可以检测
的范围, 因而大大扩展了分子量的分析范围, 离子
的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。
这技术在应用于磷酸化多肽分析及磷酸化位
点鉴定时, 主要采用前体离子扫描和中性丢失扫描
进行检测。其中前体离子扫描是通过检测磷酸化
肽段经碰撞诱导解离(collision induced dissociation,
CID)后产生的磷酸基团特异性片段来报告磷酸化
肽段的存在, 其优点是可以直接对磷酸化肽段进行
序列和磷酸化位点分析, 甚至不必预先知道蛋白质
的序列。而中性丢失扫描则是用MS/MS检测经
CID后发生中性丢失H3 PO4的肽段, 其优点是以正
离子模式进行扫描分析, 找到磷酸化肽段后可以直
接通过诱导解离分析磷酸肽的序列及磷酸化位点。
缺点是有时会产生假阳性信号而且目前还没有用来
检测未知样品。
电喷雾质谱在磷酸化肽段的检测中, 一般要求
ESI离子源质谱与高效液相色谱(high performance
liquid chromatography, HPLC)系统作为分离工具配
合进行, 这样可以分析较为复杂的样品。质谱技术
与毛细管高效液相色谱法技术结合, 大幅度提高了
技术的灵敏度和应用范围(Wind等 2001)。同时,
由于离子源与色谱技术的良好兼容性, 多种现代色
谱技术与质谱联用, 大大推动了质谱本身的发展。
可以说, 以电喷雾技术为离子源的质谱是蛋白质组
学研究的主力, 同时也是蛋白质磷酸化研究的重要
技术工具。
Whiteman等(2008)研究水稻细胞膜蛋白的磷
酸化时, 用凝胶电泳法共发现了 94种膜蛋白, 包括
一级、二级信号传导分子、离子通道蛋白、质
子泵蛋白家族、Ca2+泵蛋白家族等。而用LC-ESI-
MS的检测方法他们不但找到已经预测的AMT1;1
和PIP2;6这些蛋白质磷酸化位点, 还在一些蛋白中
找到了一些新的磷酸化位点, 如质子泵蛋白。ESI-
MS与HPLC联用可准确找到发生磷酸化的蛋白质,
并预测磷酸化的位点, 是目前应用最广泛的蛋白质
磷酸化检测技术。
2.2.2 基质辅助激光解吸附质谱技术 基质辅助激
光解吸附质谱技术(MALDI)是由德国的Karas和
Hillenkamp (1988)发展起来的。其流程是将微量蛋
白质与过量的小分子基体的混合液体点到样品靶
上, 经加热或风吹烘干形成共结晶, 放入离子源内。
当激光照射到靶点上时, 基体吸收了激光的能量跃
迁到激发态的蛋白质即电离和汽化, 电离的结果通
常是基体的质子转移到蛋白质上。然后由高电压
将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内, 再
经离子检测器和数据处理得到质谱图。MALDI 所
产生的质谱图多为单电荷离子, 因而质谱图中的离
子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。
MALDI 产生的离子常用飞 行 时 间(time-of-flight,
TOF)检测器来检测。TOF质量分析器被认为是与
MALDI的最佳搭配, 因为二者都是脉冲工作方式,
在质量分析过程中离子损失很少, 灵敏度很高。所
以, MALDI-TOF质谱已普遍用于蛋白质、多肽、
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核酸和多糖等生物大分子的研究(Szpunar 2005)。
MALDI-TOF-MS的常用检测模式为正离子模
式, 而磷酸化肽段带负电荷, 直接采用MALDI-TOF-
MS检测磷酸化修饰位点比较困难。通常是采用
MALDI-TOF-MS与碱性磷酸酶的去磷酸化作用相
结合的方法来鉴定磷酸化肽段。通过检测所得到
的肽谱与理论肽谱中是否发生 79.983的相对分子
质量迁移(即多肽上一个磷酸基团丢失)就能鉴定磷
酸化肽段及磷酸化位点的数目。离子飞行时间的
缩短和质荷比的降低导致MS谱图发生改变, 还可
以检测出磷酸化的位点。通常, 丝氨酸和苏氨酸磷
酸化肽段会丢失磷酸(分子质量数减少98), 而酪氨
酸磷酸化肽段会丢失磷酸基团(分子质量数减少
80)。MALDI-TOF-MS优势是可对混合样品进行
直接分析, 还可直接与双向凝胶电泳联用, 从而有
利于蛋白质磷酸化的快速和大规模检测。其局限
性是仅适合固体样品的分析, 重复性差, 不适用于
定量分析。
Khan等(2005)采用双向电泳和MALDI-TOF-
MS 研究了水稻细胞中的蛋白质在激素、低温、
高盐等胁迫条件下的磷酸化。将水稻组织细胞裂
解后, 从中提取蛋白质。再把总蛋白酶解成肽段后
进行富集, 之后用双向电泳初步分离检测磷酸化蛋
白质。最后用MALDI-TOF-MS检测验证发生磷
酸化的蛋白质种类。结果表明: 不同胁迫条件下,
发生磷酸化的蛋白质种类差异很大; 相同胁迫条件
下, 不同组织中可能有相同的蛋白质如细胞质中苹
果酸脱氢酶发生磷酸化; 水稻的级联反应系统、糖
酵解途径、Ca2+介导的信号途径在应对激素作用
和胁迫条件时, 蛋白质的磷酸化是重要的目标。这
一实验是采用双向电泳与MALDI-TOF-MS联用在
植物蛋白质磷酸化检测中一个成功应用的实例。
2.3 蛋白质微阵列检测蛋白质磷酸化 蛋白质微阵
列技术是沟通基因组学和蛋白质组学的工具和桥
梁, 具有并行、快速、灵敏、高通量和自动化分
析等特点(Loyet等 2005)。因为蛋白质微阵列的体
积小, 样品用量很少, 对分析和检测频率较低的蛋
白质磷酸化很有帮助(Kreutzberger 2006)。蛋白质
微阵列技术的原理是通过微加工、微电子技术等
对载玻片表面进行特殊处理, 将大量的蛋白质或配
基按照预先设计的序列高密度地固定在载玻片上,
形成探针蛋白质点阵。根据检测目的不同, 选择不
同的蛋白激酶作为探针。实验时, 将带有特殊标记
(如荧光染料标记)的激酶作为探针与该微阵列进行
孵育反应, 探针可以捕获样品中的待测蛋白质并与
之结合, 然后用激光共聚焦显微镜获取数组图像或
者采用质谱技术将靶蛋白离子化, 最后用专门的计
算机软件对结果进行准确、快速的分析, 从而实现
对蛋白质分子的测量与筛选。
Kersten等(2003)制作的第一个拟南芥的蛋白
质微阵列是最早将该技术应用于植物领域的。蛋
白质微阵列最初应用于磷酸蛋白质组学时, 其效果
并不理想, 只能低通量地检测蛋白质的磷酸化
(MacBeath和 Schreiber 2000)。现在, 采用蛋白质
微阵列已经可以高通量地检测拟南芥的磷酸激酶及
其作用机制。
Feilner等(2005)采用蛋白质微阵列技术分析了
促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein
kinase, MAPK)在植物中进行信号传导的机制。他
们将取自拟南芥分生组织的 cDNA文库表达成蛋
白, 取其中的 1 690个非重复的蛋白质制作成为蛋
白质微阵列。将该阵列和MAPK家族中的MPK3
和MPK6以及放射性标记的ATP一起孵化, 结果共
找到 48种蛋白质能与MPK3相互作用, 39种能与
MPK6相互作用, 其中有26种蛋白质是相同的。他
们进一步研究发现, 这些蛋白质包括信号传导因
子、调节因子、剪接因子、受体和组蛋白等, 另
外还有一些是不参与信号传导过程的蛋白质。该
实验向人们提供了一种最快捷的体外寻找能和特异
性蛋白激酶作用的蛋白质底物的方法。
De la Fuente van Bentem等(2008)采用多肽阵列
技术结合分析特异性的蛋白质磷酸化及其对应的激
酶时, 先取培养 5 d的拟南芥根系细胞用 4 mmol·L-1
的H2O2处理5 min, 提取膜内蛋白(包括核蛋白和细
胞质蛋白), 再以酶切成肽段后, 制成肽段阵列。与
富含丝氨酸、精氨酸的蛋白质特异性激酶 4
(serine/arginine-rich protein-specific kinase 4, SRPK4)
以及MPK3一起孵化后, 发现 SRPK4可以将一种
mRNA的剪接因子SLC30的肽段磷酸化。 在不作
H2O2处理的 2种激酶都可以将 SCL30的肽段磷酸
化。为了验证 SRPK4是否在体内对 SLC3进行磷
酸化, 他们将含SRPK4基因的质粒导入拟南芥根细
胞系中培养, 再用H2O2处理细胞, 仍然可以得到相
同的结果。这说明H2O2能诱导MPK3对SLC30的
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磷酸化, 而 SRPK4则不受H2O2影响。这个实验为
实时动态研究激酶对底物蛋白质的磷酸化提供了新
的可行方法。
3 蛋白质磷酸化的生物信息学分析
蛋白质磷酸化研究离不开生物信息学的分析
方法, 甚至可以说没有生物信息学的支持就无法开
展蛋白质磷酸化研究。质谱鉴定得到的蛋白质信
息都需要利用生物信息学的手段进一步查找相关的
信息, 如蛋白质的种类、磷酸化位点、所属物种
和对应的激酶等。拟南芥是一种模式生物, 也是植
物磷酸蛋白质组学研究得最多的材料。最近, 有人
建立了一个拟南芥的磷酸化位点测定和预测的数据
库网站(http://phosphat.mpimp-golm.mpg.de/), 它所
包含的拟南芥磷酸化蛋白质数据是所有关于植物磷
酸化蛋白质组学网站中最多最全的(Heazlewood等
2008)。另外, 在 http://promex.mpimp-golm.mpg.de/
home.html上还可以看到很多拟南芥磷酸化蛋白质
的原始质谱分析图(Hummel等 2007), 在 http://
plantsp.genomics. purdue.edu上已找到 1 000多种
拟南芥蛋白激酶和磷酸酶的DNA序列(Gribskov等
2001)。随着蛋白质磷酸化研究的发展, 这样的数
据库(网站)会越来越多, 植物蛋白质磷酸化的分析
也会更容易。
尽管植物蛋白质磷酸化研究的技术已经取得
了长足的进步, 但是通过各种方法富集检测得到的
蛋白质磷酸化仍然都有各自的倾向性(Bodenmiller
等 2007)。网站 http://phosphat.mpimp-golm.mpg.
de/曾提供了预测拟南芥蛋白质磷酸化的方法。这
是一种无倾向性的、可信度高的方法。例如, 它
根据拟南芥基因组信息预测在拟南芥中有 31 921
个蛋白质磷酸化位点是丝氨酸。其中有 17 035个
蛋白质已经实验证明是高度可信的(Heazlewood等
2008)。但是这个预测方法的局限性是其只能用于
拟南芥, 不能用于其他植物, 还有待进一步改进。
磷酸化和去磷酸化普遍存在于细胞中, 是最重
要的信号传导方式, 磷酸化激酶和其催化的磷酸化
蛋白质形成了很多网络。在植物中, 已经有一些磷
酸化网络被研究得比较透彻, 例如拟南芥的MAPK
信号通路。只有构建完整的磷酸化网络, 才能利用
计算机的预测磷酸化位点和其所对应的激酶。根
据激酶与底物蛋白质作用的结构域的不同, 可以将
激酶与其作用的底物蛋白质种类对应起来。这样,
单纯依靠序列信息就可以推断出磷酸化位点和催化
它的蛋白激酶(Blom等 2004)。如果在通过结构域
配对的原则基础上, 再把其它一些如蛋白质相互作
用、细胞内的共定位和共表达等信息考虑进去, 可
以增加预测结果的准确性(Linding等 2007)。在网
站 http://networkin.info/上已经可以找到很多磷酸
化网络的信息, 且这些信息还在不断完善。相信随
着这些信息的增加, 在不久的将来, 人们可以准确
地利用计算机预测蛋白质磷酸化的位点和形式。
4 结语
最近几年, 植物蛋白质磷酸化研究技术有了快
速的发展, 已经从简单的双向电泳和质谱检测, 发
展到现在的多种高效磷酸化蛋白质富集技术联用,
如 Pro-DPS染色的高分辨率双向电泳、高灵敏度
质谱、蛋白质微阵列、生物信息学分析等等。在
这些新技术的支持下, 植物蛋白质磷酸化的研究内
容从小规模检测鉴定磷酸化蛋白质已发展成为高通
量大规模测定磷酸化蛋白质和磷酸化位点, 构建蛋
白质磷酸化图谱, 利用生物信息学预测磷酸化位点
以及运用蛋白质微阵列寻找特异性蛋白激酶和信号
传导途径等诸多方面。
但蛋白质磷酸化的研究也存在着先天性的困
难, 如细胞中磷酸化蛋白质的拷贝数相当低和蛋白
质磷酸化的位点有可变性。随着技术的进步, 这些
困难会逐渐得到克服, 事实上, 现在已经取得了一
系列显著了成果。越来越多的植物磷酸化蛋白质
和其磷酸化的位点被鉴定出来, 蛋白质磷酸化的过
程也正在被揭示。
植物蛋白质磷酸化研究的方法还有待改进和
发展。如双向电泳和质谱技术的分辨率尚需进一
步提高, 也只有这样, 丰度更低的蛋白质磷酸化才
能得到和鉴定。生物信息学的发展可以帮助我们
构建出更加完善的磷酸化蛋白质数据库和磷酸化蛋
白质功能网络。采用生物信息学手段将蛋白质磷
酸化修饰与其他类型的翻译后修饰联系起来研究,
可以更全面掌握蛋白质的成熟过程, 了解细胞对外
界环境变化的响应。此外, 应用于蛋白质磷酸化研
究的技术还有反向蛋白微阵列, 这一技术的问题是
如何获得高特异性的抗磷酸化蛋白质抗体, 尤其是
大量获得抗丝氨酸磷酸化和苏氨酸磷酸化的抗体。
总之, 随着植物蛋白质磷酸化研究技术的进步,
人们将可以逐步了解到越来越多的信号通路的信
植物生理学通讯 第 45卷 第 9期，2009年 9月 905
息, 掌握蛋白质的瞬时磷酸化状态, 并构建出蛋白
质磷酸化的网络。最终, 每一个磷酸化位点在生物
学功能中的作用以及许多植物的代谢过程都会得到
揭示, 并加以利用。
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