全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (4): 488~500　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2013.0451488
收稿 2013-12-09　　修定 2014-02-25
资助 国家烟草专卖局项目(Ts-03-20110024)、中国烟草总公司
重大科技专项(110200902034)和中国烟草总公司云南省公
司科技项目(2009YN02和2011YN03)。
* 通讯作者 (E-mail: mao2010zichao@126.com; Tel: 0871-
65227732)。
烟草叶片衰老期过程中的蛋白质组学分析
张柳1, 王铮1, 张亚婕1, 林春1, 陈严平1, 李军营2, 毛自朝1,*
1云南农业大学农学与生物技术学院, 昆明650201; 2云南省烟草农业科学研究院, 昆明650000
摘要: 大田烟叶生产过程中因打顶打叉的处理, 改变了烟叶正常的衰老模式。为研究这一特殊的衰老机制, 我们自旺长期
开始, 对‘云烟87’不同发育阶段烟株的中部叶片, 进行形态观测、生理生化分析及蛋白质组学检测。结果显示: 随着烟叶的
逐渐成熟和衰老, 烟草的叶色逐渐变黄, 叶片逐渐变短、变窄, 厚度减少; 解剖结构清晰看到栅栏组织和海绵组织从最初的
整齐排列到逐渐排列紊乱, 组织细胞间轮廓不明显, 细胞间隙明显增大; 亚显微观测表明, 淀粉粒在叶绿体中逐渐积累, 类
囊体片层结构被挤散, 叶绿体膜被撑破。生理与生化分析表明衰老过程伴随着光合作用速率下降, 光合色素降解加速, 呼
吸代谢的增加, 这可能与衰老叶片中叶绿体逐渐崩塌和细胞膜透性增加相一致。iTRAQ标记方法共检测到不同发育阶段
432个差异表达蛋白质, 其中注释到308个与多种生命过程相关。蛋白差异富集分析表明, 烟草叶片衰老过程中与光合作用
等合成代谢相关蛋白多下调表达, 而逆境反应及呼吸作用等分解代谢相关蛋白多上调表达。
关键词: 蛋白质组学; iTRAQ; 叶片衰老
Proteomic Analysis of Senescing Leaf of Tobacco
ZHANG Liu1, WANG Zheng1, ZHANG Ya-Jie1, LIN Chun1, CHEN Yan-Ping1, LI Jun-Ying2, MAO Zi-Chao1,*
1College of Agriculture and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2Yunnan Academy of
Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650000, China
Abstract: During period of tobacco field cultivation, the topping procedure changes normal aging mode of to-
bacco leaf into special senescing process. For the research of this particular aging mechanism of tobacco leaf,
the middle part leaves of ‘Yunyan87’ from prosperous phase to post matured stage were used to analyze the
changes of morphology, metabolism and proteome. The results showed that leaves gradually turn yellow with
slightly reducing size in length, width and thickness during the maturing; anatomical structures of both palisade
and spongy tissue of leaves changed from the neatly arranged to progressively disorganized with significantly
increased cell gap; electric microscopically observation showed that the gradual accumulation of starch grains
in chloroplast, crowded the thylakoid lead to bursting of membrane of chloroplast. The rate of photosynthesis
was reduced with the aging process, companying with the degradation of photosynthetic pigments due to chlo-
roplasts collapse, while rate of respiration is increased due to permeability increasing of cell membrane. The
total 432 differentially expressed proteins form different developmental stages leaves were detected with iTRAQ
labeling, among which 308 were annotated to associate with a various metabolic pathways. Analysis of differential
expressed proteins shown that proteins related to anabolic process, such as photosynthesis are down regulated;
while the ones related to stress response and catabolism such as respiratory metabolism, are up regulated.
Key words: proteomics; iTRAQ; leaf senescence
衰老是植物发育过程中导致细胞、组织、器
官和个体死亡的过程(Gregersen等2013)。叶片衰
老是植物衰老的常见方式。在衰老的叶片细胞中,
经高度有序的去组装和降解过程, 代谢产物如营
养物质又会重新运输到幼叶、幼芽或生殖器官中
被利用, 因此叶片衰老是植物生存所必需、受遗
传调控并伴随着很多生理与代谢变化的复杂过程
(马林2007)。该过程有利于提高植物个体的环境
适应能力和种群的整体生存能力。衰老叶片中的
典型反应是光合色素和光合相关蛋白的降解以及
张柳等: 烟草叶片衰老期过程中的蛋白质组学分析 489
光合能力的衰退; ABA和乙烯合成增加并加速衰
老进程(Wingler等1998); 叶片多糖水解酶活性增
强, 可溶性糖的含量增加; 因衰老叶片中叶绿素的
降解速度快于叶黄素和类胡萝卜素而引起叶色泛
黄, 有的衰老叶片有花青素的合成使叶色变红; 叶
片衰老中蛋白质和核酸在总体降解的同时, 会出
现衰老相关蛋白的合成与积累等较为复杂的变化
(Smart等1991)。
烟草(Nicotiana tabacum)是重要的经济作物,
也作为模式植物在植物遗传及转基因等研究方面
具有重要的作用。在烟叶生产中由于有打顶打叉
的环节, 阻断同化物质向生殖器官或新生幼茎的
转移, 使光合产物积累于烟叶细胞中, 有利烟叶干
物质聚积, 但改变了烟叶的正常衰老模式(林中麟
等2009)。所以烟叶生产过程中的烟叶衰老被看作
是一种特殊的衰老过程。有关烟叶衰老进程已有
很多研究。Gan和Amasino (1995)将农杆菌ipt基因
在衰老相关启动因子(SAG12)的驱动下, 在烟草中
表达后延缓了植物衰老的进程。Yang等(2001)确
定烟草中两种碱性亮氨酸拉链(b-ZIP)家族的转录
因子的表达促进衰老进程, 其中TBZF在衰老的叶
片和花中积累, 而另一种蛋白TBZ17只在老叶中积
累。张波等(2007)研究高光照促进烟草叶片的衰
老, 发现高光照加速叶片衰老的机制与其中过氧
化氢积累相关, 并受活性氧(ROS)清除代谢酶类如
CAT、POX和SOD活性的共同调控。在烟草叶绿
体中ndhF基因的突变, 导致体内活性氧水平的降
低, 与野生型烟草相比, 开花40 d左右叶片才会表现
出叶片衰老且衰老进程延迟30 d (Zapata等2005)。
研究发现叶片中糖类过量积累或糖饥饿均能诱导
叶衰老(Van Doorn 2008; Wingler等1998)。上述研
究增强了人们对烟草叶片衰老机制的了解, 但距
阐明烟草叶片衰老的复杂机制还有较大的距离,
尚需新的方法和手段来探寻烟叶特殊衰老模式下
的衰老机制。
蛋白质组学的建立与发展(Wilkins等1996)以
来, 通过高通量和高分辨率的蛋白分离与鉴定技
术进行全景式研究叶片衰老进程的蛋白质组变化,
将为叶片衰老机制的阐明提供有效的研究手段。
Zhu等(2010)使用iTRAQ技术对芸苔属植物保卫细
胞中的蛋白组进行分析, 并用相对定量的方法在
经脱落酸处理样品和对照组中共鉴定出431种蛋
白质, 在含量上调的66种蛋白质中, 与应激和防御
反应有关的蛋白占大多数; 而38种下调蛋白中, 许
多都与新陈代谢和蛋白合成有关, 该研究不仅建
立了一个完整的脱落酸敏感蛋白库, 而且鉴定出
几种新的蛋白, 为后续研究ABA在植物保卫细胞
中的功能奠定了基础。崔红等(2008)应用蛋白质
双向电泳联用质谱技术对河南平顶山和福建龙岩
的烟草叶片蛋白质组成进行了比较研究, 51个蛋
白质在两个生态区发生了差异表达, 对51个蛋白
质进行肽质量指纹图谱分析, 共鉴定出25种蛋白
质, 其中参与叶绿体发育、色素代谢、光合作用
相关的蛋白在福建烟区高表达, 与糖酵解途径相
关的蛋白质在河南烟区中高表达。Shan等(2011)
采用DIGE在拟南芥中鉴定出35个COI1-依赖茉莉
酸调控蛋白, 发现其中Rubisco活化酶(Rubisco
activase, RCA)是一种COI1-依赖茉莉酸调控蛋白,
进一步发现RCA的缺失会导致典型衰老相关特
征。Hebeler等(2008)用蛋白质组学分析早期衰老
叶片的蛋白丰度变化, 在基于DIGE和MS分析的9
个生物学重复检测中, 21个蛋白质点显示了不同
的丰度, 鉴定出13个差异显著的蛋白, 构建其拟南
芥突变体, 显示了这些蛋白具有重要调控叶片衰
老的作用。为研究花瓣衰老后基因表达变化与调
控, Bai等(2010)采用蛋白质组学方法研究矮牵牛
花冠衰老过程中的蛋白质变化, 发现许多衰老上
调蛋白质参与了防御和应激反应或者大分子的分
解代谢。
本研究通过栽培烤烟品种 ‘云烟87’ , 采用
LI6400光合系统测定不同衰老进程叶片的光合和
呼吸速率; 采集旺长、成熟和成熟后期的烟叶样
品进行细胞及细胞器的显微及亚显微结构观测及
利用iTRAQ (Gan等2007)技术进行衰老过程中蛋
白质组变化分析, 来尝试阐明烟草叶片的特殊衰
老机制。
材料与方法
1 植物材料
2011年在云南省玉溪妍和基地 (24°35′N,
102°52′E), 采用云南省主要烤烟(Nicotiana tabacum
L.)品种‘云烟87’, 按株距120 cm, 行距55 cm, 8行9
植物生理学报490
列东西方向排列小区栽培72株烤烟, 单株留叶22
片, 每公顷施纯氮90~120 kg, N:P:K为1:2:3, 试验共
设置3个小区, 四周栽种保护行, 烟株田间生长到旺
长期(P) (移栽后60 d)、成熟期(M) (移栽后74 d)、
成熟后期1 (M1) (移栽后81 d)、成熟后期2 (M2)
(移栽后88 d)和成熟后期3 (M3) (移栽后95 d), 每个
时期随机选9株健康烟株采取由下至上第10片叶
(以下称作中部叶片)迅速置于液氮中保存以备提
取烟草叶片蛋白质, 并用iTRAQ蛋白质组分析技术
进行叶片衰老进程中蛋白质差异变化分析。
2 叶片光合与呼吸速率、活体SPAD值及光合色
素含量的测定
2.1 净光合速率和呼吸速率的测定
随机选取5株不同阶段衰老的烟草, 利用LI-
6400光合仪, 测量其中部叶片的净光合速率(Pn),
每个叶片测定上、中、下3个部位, 每个部位测定
3次, 计算平均值。测定时, 用仪器内置光源设置
光照强度为1 200 μmol∙m-2∙s-1, 用配套CO2钢瓶, 设
置CO2浓度为380 μmol∙mol
-1, 呼吸测定与光合测定
除将光照设置为0外其余条件完全相同。
2.2 活体叶绿素SPAD值测定
随机选取5株烟草不同衰老时期的烟株, 利用
SPAD-502叶绿素测定仪, 分别活体测量其中部叶
片的SPAD值, 每个叶片测定上(叶尖)、中(叶中
部)和下(叶基)3个部位, 每个部位测定3次, 计算平
均值。
2.3 光合色素含量的测定
采用分光光度法, 参考叶尚红等(2002)方法,
提取中部烟叶光合色素后分别于665、649、470
nm下比色测定光合色素的含量。
3 烟叶农艺性状的测定
随机选取5株不同衰老进程烟株, 分别测量中
部叶片的叶长、叶宽和叶厚等农艺性状。
4 显微与亚显微结构观测
4.1 显微结构观测
选取不同衰老时期中部叶片的中脉右侧相同
位置剪取约0.5 cm×0.5 cm的小块若干, 置于FAA固
定液中固定1周后, 经脱水、包埋、切片等步骤获
得半薄切片, 该切片经矾-苏木精染色, 树胶封片,
参考邱立友等(2009)方法。通过Olympus显微镜观
察, 并用Motic DMBI-223显微系统拍照记录。
4.2 亚显微结构观测
将中部叶片材料的中脉右侧相同位置剪取约
2 mm×2 mm的小块若干, 放入2.5%戊二醛固定液
中, 抽气到叶片全部下沉为止。用pH 7.2的磷酸缓
冲液反复洗涤, 然后用1%锇酸固定, 环氧树脂包
埋, LKB-V型超薄切片机切片, 醋酸双氧铀和柠檬
酸铅双重染色, 用Hitachi H-600投射电子显微镜观
察并拍照, 观察细胞超微结构。
5 烟草叶片蛋白组分析
参照蔡永占等(2013)方法分别对旺长期(P)、
成熟期(M)、成熟后期(M1、M2、M3)的中部烟叶
进行全蛋白提取。对提取的蛋白样品进行还原烷
基化处理, 打开二硫键以便于变性并进行蛋白酶
水解。用Amersham Bioseienees公司(美国)的蛋白
质定量试剂盒进行蛋白质浓度测定, 以1:30比例的
胰蛋白酶37 ℃下进行提取蛋白的过夜酶解; 用
iTRAQ试剂标记酶解肽段, 其中113标记P期蛋白
样品, 114标记M期蛋白样品, 115标记M1期蛋白样
品, 116标记M2期蛋白样品, 117标记M3期蛋白样
品。将标记后的肽段进行等量混合后, 使用强阳
离子交换色谱(SCX)进行预分离; 所获标记肽混合
物进行液相串联质谱分析, 获得差异表达肽段及
其序列; 并通过二级质谱中不同iTRAQ的丰度及
面积来计算不同样品间差异蛋白的相对含量变
化。最后将差异肽段序列分别在NCBI nr数据库
和我们建立的烟草转录组数据库(NCBI SRA登录
号SRA096861, 数据将于2014年5月1日释放)中进
行肽段匹配和蛋白质预测与注释分析。
6 数据分析
采用Excel 2010进行数据处理, BioEdit 7.0和
UltraEdit 15.0进行功能注释, 用Photoshop CS3进行
图片整理。
实验结果
1 烟草叶片衰老过程中的外形与显微结构变化
随着烟草叶片的成熟与衰老, 叶色转变为浅
黄或有黄色斑块(青黄各半), 茸毛脱落, 主脉变白,
叶基、叶耳、叶尖和靠近叶尖边缘变黄, 叶尖下
勾, 叶边下塌, 茎叶角度加大, 自然弯曲成弓形等
(图1-A); 叶片的长、宽和厚度, 随衰老的进程逐渐
降低(图2)。中部叶片在P期和M期的栅栏组织和
张柳等: 烟草叶片衰老期过程中的蛋白质组学分析 491
图1 烟草叶片衰老过程中的形态变化
Fig.1 The morphological changes of senescing leaves of tobacco
A: ‘云烟87’ 5个不同时期中部叶片的较典型外观形态变化; B: 5个不同时期中部叶片显微观察; C: 通过透射电镜观测5个不同时期叶
片叶绿体结构的变化。
图2 不同衰老期烟草中部叶片农艺性状的变化
Fig.2 The changes of agronomic trait of tobacco middle part
leaves during different senescing stages
海绵组织细胞都较M1、M2和M3时期结构完整、
排列整齐, 栅栏组织细胞呈长柱形排列, 组织细胞
间轮廓明显, 界限分明, 细胞间隙适中; 而后, 在成
熟期发育进程中, 栅栏组织细胞柱状变短, 组织细
胞间轮廓不明显, 细胞间隙明显增大, M1开始烟叶
组织细胞已出现部分解体, M3时期的细胞间隙最
大, 排列也较紊乱, 表现出大部分细胞解体的现象
(图1-B)。进一步进行叶肉细胞的亚显微结构分析
发现, 从M期开始叶绿体中形成了大量的淀粉粒,
淀粉粒体积逐渐膨胀, 把类囊体片层结构挤散, 使
叶绿体被膜被撑破, 导致叶绿体解体, 该现象应与
烟叶打顶打叉后叶片糖类的输出受阻相关。在成
熟期发育进程中, M1期可见淀粉粒的数量与体积
仍在继续积累, 部分淀粉粒因叶绿体膜的被撑裂,
从叶绿体中释放到细胞质中并逐渐顺着细胞壁周
围分布。M2期, 淀粉粒体积没有再继续积累, 相
反, 淀粉有少量的降解, 使淀粉粒体积变小, 但数
量减少不明显, 此时仍能观测到极少数内外膜完
植物生理学报492
期247个, M2期227个, M3期167个(表1)。预示在烟
草叶片衰老过程中蛋白质的组成与含量均发生了
较大变化。
图3 不同衰老期中部叶片净光合速率和呼吸速率的变化
Fig.3 The changes of net photosynthesis and respiration of
middle part leaves during different senescing stages
表1 与旺长期相比烟草衰老叶片差异表达蛋白质数目
Table 1 The differential expressed protein in the senescing
leaves of tobacco by comparision with prosperous phase
衰老发育 上调蛋白质 下调蛋白质 总差异蛋白质
时期 数量 数量 数量
M 111 155 266
M1 129 118 247
M2 117 110 227
M3 99 68 167

整的叶绿体, 但其基质片层几乎全部解体, 其中淀
粉粒体积也开始变小。M3时期, 淀粉大量降解, 淀
粉粒数量减少, 且几乎看不到膜结构完整的叶绿
体(图1-C)。
2 叶片衰老过程中光合色素含量、光合和呼吸速
率的变化
在叶片的衰老过程中, 叶片的光合速率逐渐
降低, 而呼吸速率逐步加强(图3)。光合速率的降
低与光合膜在衰老过程中破坏相关; 呼吸速率的
增加则源于呼吸所用单糖类底物因淀粉等多糖类
物质的降解而增加和在衰老过程中细胞膜透性增
加, 促进了细胞CO2与O2的交换(图1、3)。在衰老
的叶片中叶绿素a和叶绿素b含量及活体叶绿素指
标SPAD值均随衰老的进程下降, 这与叶片的显微
结构观测叶绿体堆积淀粉颗粒并撑破光合膜及叶
绿体膜, 导致叶绿体的解体及光合色素的降解相
一致(图1、4)。
图4 不同衰老期中部叶片中叶绿素a、叶绿素b以及
SPAD值的变化
Fig.4 The changes of chlorophyll a, b contents and SPAD
value of middle part leaves during different senescing stages
3 蛋白质定量分析结果
通过对烟草旺长期(P)、成熟期(M)及不同成
熟后期M1、M2和M3进行iTRAQ蛋白质组分析,
以P期蛋白质为对照, 比较成熟期M和不同成熟后
期M1、M2和M3的差异表达蛋白质, 分别将差异
倍数大于1.5和小于0.66且FDR值小于0.001的蛋白,
称为上调和下调差异表达蛋白。结果显示各发育
进程中烟草叶片衰老时期检测总差异表达蛋白质
907个, 包括成熟期烟草叶片差异蛋白质266个, M1
所有差异表达蛋白质经BlastP对NCBI nr数据
库(www.ncbi.nlm.nih.gov)注释分析后, 有432个蛋
白质被注释, 在2倍差异范围内共有308个差异表
达蛋白质被成功注释, 其中与光合作用相关的蛋
白质74个, 与呼吸作用相关的蛋白质61个, 与氨基
酸等含氮化合物相关的蛋白质20个, 与逆境反应
相关的蛋白质47个, 与蛋白合成代谢相关的蛋白
质40个, 与脂类转运相关的蛋白质鉴定出7个, 其
他功能蛋白质59个(烟草叶片每个时期在主要代谢
中的差异蛋白质数量见表2)。根据蛋白质表达量
的变化趋势, 可将烟草叶片衰老过程中差异表达
的蛋白质按趋势分5种: 第I类, 表达量随着叶片衰
老进程持续减少; 第II类, 表达量持续增加; 第III
张柳等: 烟草叶片衰老期过程中的蛋白质组学分析 493
类, 表达量呈现先增后降, 总体降低的趋势; 第IV
类, 表达量呈现先降后增, 总体增加的趋势; 第V
类, 表达量无明显差异。
4 衰老叶片中与光合作用相关的蛋白表达变化
与光合相关的蛋白质, 在衰老过程中总体呈
现降低表达趋势, 且无论是光反应中用于ATP及
NADPH合成的蛋白(如PSI和PSII反应中心蛋白),
还是暗反应中用于CO2的同化及有机物的合成过
程相关蛋白(如碳酸酐酶, Rubisco及其活化酶)均呈
下降趋势。但部分蛋白进入成熟期和成熟后期呈
现上升的趋势, 其中包括光反应中与光能吸收相
关的叶绿体蛋白CP12 (chloroplast protein 12)、Psb
domain-containing protein 1、放氧增强蛋白1前体
(oxygen evolving enhancer protein 1 precursor; 图
5)、光系统I反应中心IV A亚基(photosystem I reac-
tion center subunit IV A)、氧释放相关33和23 kDa
亚基、类囊体基质19和17 kDa蛋白、叶绿体光照
后叶绿素荧光增加蛋白质(chloroplast post-illumi-
nation chlorophyll fluorescence increase protein)、
叶绿体铁氧还蛋白(chloroplast ferredoxin I)、叶绿
体质体蓝素前体(chloroplast plastocyanin precur-
sor)、质体硫氧还蛋白F和M (plastid thioredoxin F
表2 差异表达蛋白质的功能分类
Table 2 Fuctional annotation of differential expressed protein
衰老发育时期 光合作用 呼吸作用 蛋白质代谢 氨基酸代谢 脂类代谢 逆境反应 其他代谢 假定未知功能蛋白
M 69 57 34 19 6 42 39 14
M1 72 54 37 18 7 46 39 14
M2 65 52 28 18 7 41 36 13
M3 61 46 31 17 7 41 31 13

图5 光合作用电子传递和卡尔文循环差异蛋白表达
Fig.5 The differences proteins in photosynthetic electron transportation and calvin cycle
利用颜色差异来显示差异倍数变化, 随着颜色的依次加深, 差异表达倍数上升, 颜色逐渐变浅, 差异倍数下降; 图6同。
植物生理学报494
and M)、细胞色素b6f铁硫蛋白亚基(cytochrome b6f
complex iron-sulfur subunit 2)等。这些与光反应相
关的蛋白质含量高, 预示这些蛋白质相对稳定, 在
衰老初期维持部分光合反应, 且将吸收光能转化
为荧光释放以降低衰老叶片中活性氧的水平。在
暗反应中叶绿体转酮醇酶(chloroplastic transketo-
lase)和丙糖磷酸异构酶(triose phosphate ispmerase)
的积累, 可能与衰老过程中RuBP的再生及将光合
过程中糖类的转化与运输相关。值得注意的是叶
绿体中脂质载体蛋白(chloroplast lipocalin)在衰老
叶片中的上升表达, 可能与叶绿体脂类在衰老中
的转运与再利用相关。
叶片衰老的明显标志是叶色的失绿, 同时失
绿也是衰老的开始(Thomas等2003)。光合速率的
降低是叶片衰老的早期事件, 并伴有蛋白、光合
色素和脂质的降解。光系统I (PSI)、光系统II
(PSII)、捕光叶绿素蛋白复合物(LHC)、细胞色素
b/f复合物(cytb/f)和ATP合成酶复合物(Shinozaki等
1986), 是高等植物类囊体膜上的主要光反应元
件。PSI介导光驱动电子从质体蓝素到Fd的传递
过程, 并与NADPH的合成相关; PSII主要是使水裂
解释放氧气, 把水中的电子传递给质体醌, 并经细
胞色素b/f复合物与PSI相偶联; 捕光叶绿素蛋白复
合物主要将光能吸收并传递到PSI和PSII的光反应
中心来驱动电子传递, ATP合成酶复合物负责将光
合电子传递产生的质子动力势, 转化为活跃化学
能ATP。这些光合相关蛋白质的差异变化揭示了
衰老进程中十分复杂的光合变化过程。
5 多糖的降解与呼吸作用相关的蛋白变化
植物在衰老过程中多糖会被降解, 有利于维
持基本的细胞呼吸, 并利于衰老叶片中有机物的
回收利用。通过呼吸代谢将体内复杂的有机物分
解为简单的化合物, 同时把有机物中的能量释放
出来维持植物中间代谢物与能量的需求。在糖的
分解代谢中, 单糖通过不同的代谢途径(如EMP和
HMP)等产生丙酮酸, 后者转化为乙酰-CoA, 通过
三羧酸循环和电子传递/氧化磷酸化过程完成能量
的产生。在衰老过程中叶片细胞的呼吸往往会呈
现慢-快-慢的复杂变化过程。
蛋白质组分析表明与多糖降解相关蛋白如葡
聚糖/水双激酶(glucan/water dikinase)、α-葡聚糖
焦磷酸化酶(alpha-glucan phosphorylase)、α-葡糖
苷酶类(alpha-glucosidase-like)、β-1,3-葡聚糖糖降
解酶类及果胶甲酯酶均增强表达, 预示各类多糖
在衰老叶片中的降解增强, 这与聚半乳糖醛酸酶
抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting protein)和木
葡聚糖基转移酶(xyloglucan endotrans-glucosylase-
hydrolase XTH7)等抑制多糖降解与含支链木葡聚
合成的降低表达相一致。从糖类分解产生丙酮酸
的代谢过程中, 糖酵解相关的酶类(果糖1.6-二磷酸
醛缩酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶等)均随衰老进程下
调表达, 预示糖酵解代谢下降, 但6-磷酸葡萄糖酸
脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase)、
NADP依赖的3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸激酶
家族蛋白质(pyruvate kinase family protein)和烯醇
酶(enolase)在衰老过程中特别是成熟后期M2和M3
阶段相对于旺长期不变或略微上升表达(图6、表
3), 预示HMP途径可能是衰老过程中通过糖类的
分解来维系能量和还原力(NADPH)合成的主要代
谢途径(Nunes-Nesi等2005)。
在线粒体中进行的三羧酸循环(TCA)酶类在
衰老叶片中表达下降幅度不大, 甚至部分蛋白上
调表达, 如顺乌头酸酶(aconitase)和线粒体苹果酸
酶(malate dehydrogenas)在衰老M~M1时期上调表
达; 电子传递与氧化磷酸化过程中, NADH脱氢酶
(mitochondrial NADH dehydrogenase [ubiquinone]
iron-sulfur protein 1)、细胞色素c氧化酶家族蛋白
质(cytochrome c oxidase family protein)和ATP合成
酶(mitochondrial ATP synthase subunit delta)的表达
模式为先上升后下降(图6), 预示烟叶衰老过程中
呼吸作用与其他植物一致, 存在慢-快-慢的变化模
式。另外胞质中磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate
kinase, cytosolic)、葡萄糖-1-磷酸核苷酸转移酶
(glucose-1-phosphate uridylyltransferase)、葡萄糖
磷酸变位酶(phosphog lucomutase)等与糖类转化及
糖核苷酸合成相关的酶类上调表达, 预示衰老过
程中多糖水解后的单糖产物, 需要通过合成蔗糖
等运输糖类输出叶片或暂时储存在胞液中。这种
变化与胞液ATP酶(vacuolar ATPase subunit B)在衰
老叶片中持续上调表达的模式相一致(表3、图6)。
6 蛋白质与氨基酸代谢变化
蛋白质组分析表明在蛋白质代谢中, 无论是
张柳等: 烟草叶片衰老期过程中的蛋白质组学分析 495
图6 呼吸作用相关差异蛋白表达
Fig.6 The different expressed proteins related to metabolism of respiration
核编码的蛋白质合成还是细胞器(质体及线粒体)
的蛋白质合成均下调, 主要体现在60S、40S (核蛋
白合成)、30S和50S (质体及线粒体蛋白合成)核糖
核蛋白以及延伸因子(elongation factor 1 gamma)和
导肽酶类(chloroplastic/mitochondrial presequence
protease)在衰老过程中含量降低。然而与蛋白质
降解相关的蛋白酶类, 如半胱氨酸蛋白酶(cysteine
protease)、天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease 1)和
蛋白体(proteasome subunit alpha type-3)等的上调
表达显示了衰老中蛋白质分解代谢是主流, 这与
烟叶在衰老过程中蛋白质含量的下降相一致(表
3)。在氨基酸代谢中, 与氨基酸合成相关的酶类如
蛋氨酸合成酶(methionine synthase)、质体中半胱
氨酸合成酶(lastidic cysteine synthase; Sait等1994)
和琥珀半醛还原酶(succinic semialdehyde reductase
isofom2)含量下降, 分解相关的酶类如天冬氨酸转
氨酶(aspartate aminotransferase)、谷氨酸氨基转移
酶(glutamine midotransferase subunit pdxT)、一碳
单位转运相关辅酶(四氢叶酸连接酶(formate-tetra-
hydrofolate ligase)含量上升, 预示在氨基酸分解及
N元素的转运是主流的代谢活动。
7 逆境反应
植物叶片的衰老过程中, 因细胞器特别是光
合膜的损伤等导致大量活性氧的产生, 同时光合
能力的下降引发碳水化合物饥饿, 衰老过程中吸
水、吸肥能力的下降导致的植物营养与水分的变
化等, 均导致衰老的叶片处于逆境中。烟草衰老
时期热激蛋白和分子伴侣总体上调表达 , 其中
Hsp70s (Shi和Theg 2010), Hsp90, 小热激蛋白如
Hsp26、Hsp3A等上调表达, 预示蛋白因衰老而变
性, 需要分子伴侣的帮助进行复性的趋势增强, 这
与在衰老过程中FKBP-peptidyl-prolyl顺反异构酶2
和3 (FKBP-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
2 and 3)和二硫化物异构酶蛋白(protein disulfide
isomerase-like 2-3)等蛋白折叠与复性相关酶类的
上调表达相一致(表3)。
与活性氧产生清除的酶类, 抗坏血酸过氧化
物酶(ascorbate peroxidase)、过氧化氢酶同工酶
(catalase isozyme 1)、过氧化物氧化还原酶(perox-
iredoxin)、含铁超氧化物歧化酶[superoxide dis-
mutase (Fe)]和含铜锌超氧化物歧化酶(superoxide
dismutase [Cu-Zn])及硫氧还蛋白过氧化物酶(thi-
植物生理学报496
表3 主要差异表达蛋白质的注释
Table 3 The annotation of the major differentially expressed proteins
代谢途径 编号 注释 NCBI编号 匹配肽段数 P M M1 M2 M3
光合作用 1 核酮糖-2-磷酸羧化酶/加氧酶 GI:571504067 1 1 0.598 0.335 0.014 0.216
2 核酮糖-2-磷酸羧化酶/加氧酶 GI:19990 17 1 1.013 0.577 0.481 0.478
3 3-磷酸甘油酸激酶 GI:1161600 15 1 0.451 0.993 0.823 0.667
4 5-磷酸核酮糖激酶 GI:571478631; 8 1 0.407 0.491 0.669 0.398
GI:571433576
5 放氧增强蛋白 GI:61697114 9 1 2.804 1.885 0.500 0.836
6 放氧增强蛋白 GI:30013656 13 1 2.770 1.137 2.150 0.892
7 放氧增强蛋白 GI:19156 12 1 2.332 1.080 0.690 0.716
8 碳酸酐酶 GI:22550385 9 1 0.653 0.438 0.511 0.359
9 放氧增强蛋白1前体 GI:9229956 1 1 2.019 0.522 0.213 0.5~2
10 叶绿体蛋白CP12 GI:25990286 1 1 2.614 0.837 1.800 2.164
11 光系统I反应中心IV A亚基 GI:632722 1 1 2.177 1.102 0.546 0.561
12 类囊体基质19 kDa蛋白 GI:355488172 4 1 2.149 1.579 1.353 1.027
13 类囊体基质17 kDa蛋白 GI:565367741 5 1 1.543 0.914 0.815 0.524
14 氧释放相关23 kDa亚基 GI:61697112 11 1 2.294 1.236 0.925 0.762
15 氧释放相关33 kDa亚基 GI:30013656 12 1 2.332 1.080 0.690 0.716
16 叶绿体光照后叶绿素荧光增加蛋白质 GI:114149949 2 1 1.451 1.221 0.993 2.087
17 叶绿体铁氧还蛋白 GI:45357073 2 1 4.611 3.038 1.889 1.440
18 叶绿体质体蓝素前体 GI:256860444 3 1 1.894 0.773 1.756 0.912
19 质体硫氧还蛋白F GI:312231979 2 1 1.766 1.135 0.931 1.159
20 质体硫氧还蛋白M GI:312231977 4 1 1.835 1.022 0.701 0.667
21 细胞色素b6f铁硫蛋白亚基 GI:460412223 5 1 3.427 1.671 0.880 1.779
22 Psb domain-containing protein 1 GI:571446865 3 1 1.945 1.732 2.141 1.761
23 叶绿体脂质载体蛋白 GI:77744912 2 1 2.357 1.582 0.5~2 0.5~2
呼吸作用 1 烯醇酶 GI:238814973 9 1 0.913 1.510 1.167 1.025
2 磷酸丙糖异构酶 GI:77745457 4 1 0.417 0.524 0.556 0.258
3 磷酸甘油酸激酶 GI:571521784 2 1 1.240 0.5~2 3.828 0.5~2
4 磷酸甘油酸激酶 GI:1161600 3 1 0.601 0.567 0.627 0.659
5 丙酮酸脱氢酶 GI:3850999 3 1 0.342 1.121 0.400 1.150
6 顺乌头酸酶 GI:30407705; 7 1 0.979 2.290 2.030 2.339
GI:29027431
7 苹果酸脱氢酶 GI:5123835 5 1 0.789 0.875 0.576 1.508
8 苹果酸脱氢酶 GI:56562183 3 1 0.330 0.476 0.508 0.548
9 苹果酸脱氢酶 GI:10798651 9 1 2.188 0.709 0.497 0.532
10 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 GI:571469537; 3 1 1.104 1.150 1.225 1.595
GI:571456983
11 转酮醇酶 GI:194396260 12 1 0.339 0.477 0.756 0.491
12 转酮醇酶 GI:1658322 5 1 1.862 1.521 1.023 1.270
13 葡聚糖/水双激酶 GI:568215277 2 1 0.943 2.218 0.5~2 0.5~2
14 α-葡聚糖磷酸化酶 GI:169473 4 1 0.637 1.786 1.480 1.426
15 α-葡糖苷酶 GI:571518306 2 1 0.876 1.325 1.494 1.538
16 β-1,3-葡聚糖糖降解酶 GI:37223499 3 1 0.665 1.024 0.5~2 1.472
17 果胶甲酯酶 GI:29602796 2 1 3.061 2.821 4.243 5.180
18 聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 GI:237770128 3 1 1.669 1.282 0.5~2 0.5~2
19 木葡聚糖基转移酶 GI:42795466 1 1 0.704 0.5~2 0.025 0.5~2
20 果糖1,6-二磷酸醛缩酶 GI:14484931 3 1 0.5~2 0.5~2 0.044 0.5~2
21 3-磷酸甘油醛脱氢酶 GI:157042762 6　 1 0.541 0.622 0.787 0.630
22 3-磷酸甘油醛脱氢酶 GI:327198778 11 1 0.495 0.552 0.729 0.585
23 NADP依赖的3-磷酸甘油醛脱氢酶 GI:255548761; 8 1 0.666 1.613 1.709 1.648
GI:357480128
张柳等: 烟草叶片衰老期过程中的蛋白质组学分析 497
24 丙酮酸激酶家族蛋白质 GI:77548686 2 1 1.833 0.940 0.087 0.5~2
25 NADH脱氢酶 GI:568215261 3 1 1.072 1.954 1.247 0.5~2
26 细胞色素c氧化酶家族蛋白质 GI:82623398 3 1 2.055 1.216 0.564 0.862
27 ATP合成酶 GI:217938 4 1 1.741 0.957 0.224 1.279
28 葡萄糖-1-磷酸核苷酸转移酶 GI:218001; 3 1 0.830 0.852 0.5~2 1.873
GI:28863911
29 葡萄糖磷酸变位酶 GI:8250624 6 1 0.916 1.843 1.004 1.490
30 胞液ATP酶 GI:26986105 8 1 0.900 2.435 2.794 2.164
蛋白质与 1 60S核糖体蛋白L2 GI:9230280 1 1 0.310 1.468 1.543 1.628
氨基酸 2 60S核糖体蛋白l23 GI:332640556 2 1 1.141 0.5~2 0.461 0.5~2
代谢 3 60S核糖体蛋白L35a-3 GI:297842177; 2 1 0.736 0.001 1.251 1.243
GI:75169629
4 60S核糖体类似蛋白 GI:565400530 1 1 0.391 0.603 0.5~2 0.453
5 40S核糖体蛋白S16 GI:6984221 1 1 0.5~2 0 0.5~2 0.5~2
6 40S核糖体蛋白S19 GI:568215655 2 1 0.496 0.570 0.5~2 0.720
7 30S核糖体蛋白S5 GI:571467057 3 1 0.5~2 0.244 0.5~2 0.5~2
8 30S核糖体蛋白2 GI:571471553; 3 1 1.194 0.643 0.542 0.293
GI:571471551;
GI:571522008
9 30S核糖体蛋白S31 GI:75275034 3 1 0.489 1.003 1.467 1.003
10 50S核糖体蛋白L1 GI:571478873; 2 1 0.442 0.631 0.5~2 0.289
GI:571491593
11 50S核糖体蛋白L3 GI:189096128; 2 1 0.5~2 0.020 0.5~2 0.5~2
GI:3298437
12 50S核糖体蛋白L4 GI:3298439 2 1 0.326 0.687 0.483 0.573
13 延伸因子 GI:175363750 2 1 0.5~2 0.019 0.5~2 0.5~2
14 导肽酶 GI:571436913 11 1 0.490 0.990 1.091 0.979
15 半胱氨酸蛋白酶 GI:158524603 3 1 3.128 2.885 3.789 2.929
16 半胱氨酸蛋白酶 GI:13491749; 4 1 1.163 3.620 1.336 1.665
GI:56961685
17 半胱氨酸蛋白酶 GI:565376727 2 1 1.466 1.905 1.403 0.945
18 天冬氨酸蛋白酶 GI:294440429 3 1 2.016 3.140 2.036 1.511
19 蛋白体 GI:403044022 2 1 0.371 0.850 1.700 0.997
20 蛋氨酸合成酶 GI:115361538 4 1 0.265 0.554 0.5~2 0.558
21 质体中半胱氨酸合成酶 GI:3290021; 9 1 0.376 0.768 0.536 0.559
GI:568215645
22 琥珀半醛还原酶 GI:171854591 3 1 0.733 1.130 0.026 1.014
23 天冬氨酸转氨酶 GI:568215484 3 1 0.895 2.165 1.724 1.700
24 谷氨酸盐氨基转移酶 GI:355505710 2 1 0.994 1.924 0.5~2 2.227
25 四氢叶酸连接酶 GI:68052257 2 1 45.221 0.5~2 80.290 0.5~2
逆境反应　 1 Hsp70s GI:7330642 3　 1　 0.614 2.049 0.5~2 1.327
2 Hsp90 GI:46093889 3 1 0.578 0.001 0.500 0.550
3 小热激蛋白Hsp26 GI:3256371 6 1 0.616 6.190 2.182 2.842
4 小热激蛋白Hsp3A GI:300827453 5 1 2.048 4.798 2.923 2.879
5 FKBP-peptidyl-prolyl顺反异构酶3 GI:21542069 4 1 2.655 1.374 0.951 0.620
6 FKBP-peptidyl-prolyl顺反异构酶2 GI:571488390; 4 1 1.955 1.320 0.528 0.648
GI:571492103
7 二硫化物异构酶蛋白 GI:571441873 1 1 0.5~2 2.005 0.5~2 0.5~2
8 抗坏血酸过氧化物酶 GI:17066704 1 1 0.5~2 0.014 0.5~2 0.5~2
9 抗坏血酸过氧化物酶 GI:341865449 3 1 1.452 0.901 0.002 0.5~2
10 过氧化氢同工酶 GI:464009 7 1 0.510 0.635 1.284 1.393
表3 (续1)
代谢途径 编号 注释 NCBI编号 匹配肽段数 P M M1 M2 M3
植物生理学报498
11 过氧化物氧化还原酶 GI:222833498 2 1 2.439 1.519 0.890 1.259
12 过氧化物氧化还原酶 GI:37783266 2 1 2.249 1.319 0.398 0.877
13 含铁超氧化物歧化酶 GI:573885914 3 1 0.627 0.811 2.515 2.818
14 含铜锌超氧化物歧化酶 GI:19713 5 1 1.591 1.755 2.596 1.975
15 硫氧还蛋白过氧化物酶 GI:21912926; 5 1 0.389 1.075 1.737 1.015
GI:407907614
16 早期结瘤蛋白 GI:355508733 2 1 2.081 1.123 1.965 1.407
17 富含亮氨酸重复序列蛋白家族蛋白 GI:337733637 1 1 1.281 2.216 0.5~2 2.493
18 凝集素 GI:295407898 2 1 0.870 1.547 1.985 2.671
19 激发子诱导蛋白 GI:40287495 4 1 1.783 1.933 1.521 5.216
20 几丁质酶 GI:505268 4 1 1.929 8.354 2.998 5.216
21 SGT1 GI:315307973 1 1 0.5~2 0.5~2 0.017 0.5~2
脂类代谢 1 β酮脂酰基CoA硫解酶 GI:257815408 3 1 0.589 1.042 0.939 1.362
2 甘油脂水解酶类 GI:77551166; 2 1 0.5~2 0.616 1.670 3.264
GI:255680130
3 磷脂类水解酶 GI:83281190 3 1 0.698 1.518 3.080 1.616
4 脂类转运蛋白 GI:218291 2 1 2.818 1.887 1.914 3.095
5 脂蛋白水解脱脂相关的酶 GI:297322388 2 1 1.267 1.709 2.991 5.641
6 脂类转移蛋白前体 GI:48526016 5 1 2.48 4.025 1.009 1.771
7 硫脂酶 GI:82469975 2 1 1.307 1.963 2.335 2.867
其他种类 1 成熟调控因子 GI:78191405 3 1 1.375 2.147 0.5~2 0.5~2
蛋白 2 转运蛋白复合物 GI:571538575 1 1 0.5~2 0.5~2 105.300 69.190
3 质子梯度调控 GI:164449273 1 1 0.5~2 0.031 0.5~2 1.437
4 液泡反转酶 GI:29893063 4 1 1.890 1.928 2.227 1.734
5 激动蛋白结合蛋白 GI:568215227; 3 1 1.692 1.848 1.320 1.500
GI:77416978
6 电门控通道点蛋白 GI:161788875 4 1 1.732 1.110 0.653 0.849
　　0.5~2为一个区间范围, 表明差异表达量在此范围内但没有检测到。
表3 (续2)
代谢途径 编号 注释 NCBI编号 匹配肽段数 P M M1 M2 M3
oredoxin peroxidase)的上调表达, 预示衰老过程中
因光合光反应的障碍而导致大量活性氧的积累,
需要诱导大量活性氧的清除酶来降低其对细胞进
一步的损伤和毁坏。这些增强的酶类积累的高峰
一般在M~M1的转化期, 进入M3时期表达开始减
弱, 符合衰老特征。非常有趣的是在衰老过程中
与生物逆境及植物病原物抗性相关的酶类也在衰
老过程中增强表达, 包括病程相关蛋白4A, 1B等,
早期结瘤蛋白(early nodulin-like protein), 富含亮氨
酸重复序列蛋白家族蛋白(leucine-rich repeat fami-
ly protein), 凝集素(mannose-binding lectin), 激发子
诱导蛋白(elicitor-inducible protein EIG-J7)和不同
种类的几丁质酶(chitinase)及β-1,3葡聚糖的酶类。
这些植物抗性蛋白的变化一方面与衰老中产生大
量的活性氧(如H2O2)诱导相关, 另一方面也与在衰
老中细胞的膜透性丧失, 部分营养物质外泄, 导致
病原或腐生菌浸染并增殖相关。同时在衰老过程
中植物脱水素, 干旱诱导蛋白随衰老的过程上升
表达预示烟草叶片衰老是一个水分逐渐降低的过
程。SGT1最早是在酵母中发现的, 是与发育相关
的重要基因(Austin等2002), SGT1的沉默或突变会
导致一些R基因介导抗性反应的丧失, 而SGT1的
超表达会增强植株的抗病能力 (王凯和张增艳
2008), 同时SGT1在植物中还通过R蛋白具有调节
植物的抗病性和对激素的信号传导的作用(Azeve-
do等2006), 本研究中SGT1蛋白在烟草衰老过程中
下调表达, 说明烟叶在衰老过程中的抗病性减弱,
对外界的刺激反应减弱。
8 脂类代谢
在烟草衰老叶片中还检测到7个与脂类代谢
相关的酶类 (表3) , 其中β酮脂酰基CoA硫解酶
(3-ketoacyl CoA thiolase 2)表达下降, 但甘油脂水
解酶类(GDSL-like lipase/acylhydrolase family pro-
tein)和磷脂类水解酶类(glycerol posphodiesterase)
张柳等: 烟草叶片衰老期过程中的蛋白质组学分析 499
活性上升, 说明磷脂类或甘油脂类水解产生的脂
肪酸可能通过转运的方式运输出衰老叶片而非通
过β氧化来进行分解, 这与检测到能可逆地结合和
转运多种脂质分子的脂类转运蛋白(lipid transfer
protein) (田爱梅和曹家树2008)在叶片衰老过程中
持续上调表达相一致。另外在脂类代谢中, 与脂
蛋白水解脱脂相关的酶类(palmitoyl protein thioes-
terase family protein)活性上升, 预示在衰老过程中
作为膜结构组分的脂修饰蛋白, 在成熟过程中, 在
相应的酶促水解下, 降解为相应的脱脂蛋白及脂
类后才进行进一步的分解反应或物质转运。
9 其他种类蛋白
除碳水化合物代谢(光合作用、呼吸作用)、
蛋白和氨基酸合成、脂类代谢和逆境反应等4个
主要方面的差异表达蛋白质外, 本研究还鉴定出
59个其他功能分类的蛋白质(表3)。其中成熟调控
因子(ripening regulated protein)在旺长期P到M1期
间增强表达; 物质转运的蛋白, 如转运蛋白复合物
(trafficking protein particle complex)、质子梯度调
控蛋白(proton gradient regulation)、液泡反转酶
(vacuolar invertase)、肌动蛋白结合蛋白(profilin-
like protein)、电门控通道蛋白(voltage-dependent
anion channel)在衰老进程中上升表达, 说明在打
顶后的烟叶衰老过程中仍持续进行着高效的物质
转运。
讨　　论
烟草在生产中因打顶打叉这一处理, 叶片衰
老是特殊的过程。我们观测到从旺长期、成熟
期、成熟后期的变化过程中, 烟叶颜色逐渐变黄,
叶片逐渐变短、变窄, 厚度减少, 这可能与叶片衰
老过程中细胞失水收缩和细胞膜、细胞器破裂导
致叶片体积的逐渐收缩相关。通过解剖结构观察
中部叶片旺长期和成熟期的栅栏组织和海绵组织
较其他几个时期排列整齐, 栅栏组织细胞呈长柱
形整齐排列, 海绵组织细胞轮廓明显, 而M1、M2
和M3三个时期, 栅栏组织细胞柱状变短, 组织细胞
间轮廓不明显, 细胞间隙大, 排列较紊乱。由于打
顶这种特殊的衰老过程, 有机物特别是糖类不易
向外输出, 导致淀粉在叶绿体中积累和淀粉粒的
形成, 显微结构观测发现衰老的叶片中淀粉粒在
叶绿体中体积数量增加, 挤散类囊体片层结构, 撑
破叶绿体膜, 叶绿体逐渐崩塌导致光合色素的降
解。该过程与糖浓度积累导致叶片衰老的结论相
一致(Van Doorn 2008)。
通过LI-6400系统进行光合速率测定表明, 光
合速率随着衰老的进行持续下降, 但即使是M3期
仍具有一定的净光合速率。据我们所知, 在烟株打
顶后, 烟叶的特殊衰老过程中尚没有系统地进行蛋
白质组学的研究, 我们通过采集旺长期、成熟期、
成熟后期等连续变化的样品进行蛋白质差异蛋白
表达分析表明, 光合作用中光系统I和II相关蛋白,
光合ATP合酶在各个时期均呈现差异表达量下降
的趋势, 但出乎意料的是部分光合相关蛋白质随着
叶片的衰老, 部分蛋白质(如叶绿素结合蛋白、叶
绿体移位酶、叶绿体后-叶绿素荧光增加蛋白质
等)表达会呈现持续上升的趋势。说明光合代谢的
改变是复杂的, 且这些上调蛋白可能在功能上是维
系衰老后期光合能力的主要动力(图2、5)。
慢-快-慢的呼吸速率改变模式是许多衰老植
物组织和(或)器官中呈现的普遍现象, 我们测定不
同时期的呼吸速率表明, 呼吸速率持续上升, 可能
在衰老烟叶中M3期以后呼吸才会下降。蛋白质组
分析证实了6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphoglu-
conate dehydrogenase)和NADP依赖的3-磷酸甘油
醛脱氢酶在相对旺长期的衰老叶片中不变或上调
表达(表3、图6), 说明NADPH在衰老叶片中可能
发挥重要作用, 这与衰老模式下HMP途径的增加
相一致。
在烟叶的衰老过程中, 蛋白质降解、氨基酸
的分解代谢增强, 相应的合成代谢减弱, 体现在编
码蛋白酶和蛋白体蛋白及氨基酸转氨酶的上调表
达(表3)和氨基酸合成酶及核糖核蛋白的下调表
达。在衰老烟叶中我们观测到大量天冬氨酸蛋白
酶和半胱氨酸蛋白酶的上调表达, 预示在衰老过
程中蛋白水解主要是这些蛋白酶的作用。
通过蛋白质组分析, 我们观测到许多物质转
运蛋白质和逆境相关蛋白质的上调表达, 说明在
烟叶的特殊衰老过程中, 虽然有机物的输出整体
受阻, 但是仍存在有机物的转输过程; 另外逆境蛋
白质的上调表达说明衰老似乎被植物当做逆境反
应来处理, 同时在这些逆境相关蛋白质中观测到
植物生理学报500
病程相关蛋白质的上调表达, 预示叶片即使在衰
老的进程中也有控制微生物浸染和增殖的机制。
在我们所获得的蛋白质数据中, 与植物信号转
导、激素合成相关的数据欠缺, 同时, 由于iTRAQ
技术的局限性, 使一些差异表达量低但可能发挥
重要的生理功能的蛋白质(如转录因子)未在本研
究中被检测到, 尚需通过更灵敏的手段如RNA-seq
等来加以阐明。
参考文献
蔡永占, 周普雄, 李佛琳, 赵昶灵, 林春, 杨焕文, 毛自朝(2013). 不同
气候环境中团棵期烟草叶片蛋白质组学分析. 中国农业科学,
46 (4): 859~870
崔红, 冀浩, 张华, 邵惠芳, 李东宵, 陈亮(2008). 不同生态区烟草叶
片蛋白质组学的比较. 生态学报, 28 (10): 4873~4880
林中麟, 石健林, 周益(2009). 烟草打顶研究进展. 江西农业学报, 21
(6): 32~36
马林(2007). 植物衰老期间生理生化变化的研究进展. 生物学杂志,
24 (3): 12~15
邱立友, 李富欣, 祖朝龙, 马称心, 杨超, 冯云, 刘国顺, 赵会杰
(2009). 皖南不同类型土壤植烟成熟期烟叶的基因差异表达
和显微结构的比较. 作物学报, 35 (4): 749~754
田爱梅, 曹家树(2008). 植物脂质转移蛋白. 细胞生物学杂志, 30
(4): 483~488
王凯, 张增艳(2008). SGT1在植物抗病反应中的功能研究进展. 植
物遗传资源学报, 9 (1): 115~118
张波, 肖曼, 李红玉(2007). 高光照引起烟草叶片衰老过程中过氧化
氢的代谢与相关酶活性变化规律. 安徽农业大学学报, 34 (4):
477~480
Austin MJ, Muskett P, Kalm K, Feys BJ, Jones JDG, Parker JE (2002).
Regulatory role of SGT1 in early R gene-mediated plant defenses.
Science, 295 (5562): 2077~2080
Azevedo C, Betsuyaku S, Peart J, Takahashi A, Noë L, Sadanandom
A, Casais C, Parker J, Shirasu K (2006). Role of SGT1 in resis-
tance protein accumulation in plant immunity. EMBO J, 25 (9):
2007~2016
Bai S, Willard B, Chapin LJ, Kinter MT, Francis DM, Stead AD,
Jones ML (2010). Proteomic analysis of pollination-induced co-
rolla senescence in petunia. J Exp Bot, 61 (4): 1089~1109
Gan CS, Chong PK, Pham TK, Wright PC (2007). Technical, experi-
mental, and biological variations in isobaric tags for relative and
absolute quantitation (iTRAQ). J Proteome Res, 6 (2): 821~827
Gan S, Amasino RM (1995). Inhibition of leaf senescence by autoreg-
ulated production of cytokinin. Science, 270 (5244): 1986~1988
Gregersen PL, Culetic A, Boschian L, Krupinska K (2013). Plant se-
nescence and crop productivity. Plant Mol Biol, 82 (6): 603~622
Hebeler R, Oeljeklaus S, Reidegeld KA, Eisenacher M, Stephan C, Si-
tek B, Stühler K, Meyer HE, Sturre MJG, Dijkwel PP et al (2008).
Study of early leaf senescence in Arabidopsis thaliana by quan-
titative proteomics using reciprocal 14N/15N labeling and differ-
ence gel electrophoresis. Mol Cell Proteomics, 7 (1): 108~120
Nunes-Nesi A, Carrari F, Lytovchenko A, Smith AMO, Loureiro
ME, Ratcliffe RG, Sweetlove LJ, Fernie AR (2005). Enhanced
photosynthetic performance and growth as a consequence of
decreasing mitochondrial malate dehydrogenase activity in
transgenic tomato plants. Plant Physiol, 137 (2): 611~622
Shan X, Wang J, Chua L, Jiang D, Peng W, Xie D (2011). The role
of Arabidopsis Rubisco activase in jasmonate-induced leaf
senescence. Plant Physiol, 155 (2): 751~764
Shi LX, Theg SM (2010). A stromal heat shock protein 70 system
functions in protein import into chloroplasts in the moss
Physcomitrella patens. Plant Cell, 22 (1): 205~220
Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T, Hayashida N,
Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-
Shinozaki K et al (1986). The complete nucleotide sequence
of the tobacco chloroplast genome: its gene organization and
expression. EMBO J, 5 (9): 2043~2049
Smart CM, Scofield SR, Bevan MW, Dyer TA (1991). Delayed leaf
senescence in tobacco plants transformed with tmr, a gene
for cytokinin production in Agrobacterium. Plant Cell, 3 (7):
647~656
Thomas H, Ougham HJ, Wagstaff C, Stead AD (2003). Defining
senescence and death. J Exp Bot, 54 (385): 1127~1132
Van Doorn WG (2008). Is the onset of senescence in leaf cells of
intact plants due to low or high sugar levels? J Exp Bot, 59 (8):
1963~1972
Wilkins MR, Pasquali C, Appel RD, Ou K, Golaz O, Sanchez JC,
Yan JX, Gooley AA, Hughes G, Humphery-Smith I et al (1996).
From proteins to proteomes: large scale protein identification by
two-dimensional electrophoresis and amino acid analysis. Nat
Biotechnol, 14 (1): 61~65
Wingler A, Von Schaewen A, Leegood RC, Lea PJ, Paul Quick W
(1998). Regulation of leaf senescence by cytokinin, sugars, and
light. Plant Physiol, 116 (1): 329~335
Yang SH, Berberich T, Sano H, Kusano T (2001). Specific association
of transcripts of tbzF and tbz17, tobacco genes encoding basic
region leucine zipper-type transcriptional activators, with guard
cells of senescing leaves and/or flowers. Plant Physiol, 127 (1):
23~32
Zapata JM, Guéra A, Esteban-Carrasco A, Martín M, Sabater B (2005).
Chloroplasts regulate leaf senescence: delayed senescence
in transgenic ndhF-defective tobacco. Cell Death Differ, 12:
1277~1284
Zhu M, Simons B, Zhu N, Oppenheimer DG, Chen S (2010). Analysis
of abscisic acid responsive proteins in Brassica napus guard cells
by multiplexed isobaric tagging. J Proteomics, 73 (4): 790~805