全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (8): 1265~1272　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0064 1265
收稿 2015-01-29 　　修定 2015-06-20
资助 广东省科技攻关项目(2006A20201002和2011A020102004)
和广州市农业局项目(1210699和1310998)。
* 通讯作者(E-mail: zszhang@scau.edu.cn; Tel: 13711026839)。
环境胁迫对不同倍性大花蕙兰类原球茎增殖和分化的影响
周珊珊1, 谢利1, 王辰辉1, 周玉亮1, 曾瑞珍1, 郭和蓉1, 王木桂1, 张志胜1,2,*
1华南农业大学广东省植物分子育种重点实验室, 广州510642; 2国家植物航天育种工程技术研究中心, 广州510642
摘要: 本文研究了低温、高温、紫外线和暗培养对二倍体、三倍体和四倍体大花蕙兰类原球茎(PLBs)增殖和分化的影
响。结果表明, 10 ℃下培养, 四倍体PLBs增殖率最高; 35 ℃下培养20 d, 三倍体和四倍体PLBs死亡率显著低于二倍体, 表明
多倍体PLBs具有更强的抵御低温和高温能力。紫外灯下培养30 d, PLBs的增殖率大小依次是四倍体＞三倍体＞二倍体, 与
日光灯下相反, 说明多倍体PLBs对紫外线耐受力比二倍体强。暗培养30 d, 二倍体PLBs增殖率和芽分化率明显提高, 而三
倍体和四倍体增殖率没有明显变化, 其芽分化率明显降低。在黑暗条件下继代培养30 d, 二倍体PLBs增殖率降低, 但降幅
小于三倍体和四倍体, 芽分化率则进一步提高, 而三倍体和四倍体PLBs芽分化率进一步降低, 表明多倍体PLBs对黑暗的耐
受力变弱。多倍体PLBs中SOD、POD和CAT的活性均高于二倍体, MDA含量低于二倍体, 抗氧化酶系及MDA的变化是导
致多倍体PLBs抗性增强的重要原因。
关键词: 大花蕙兰; 多倍体; 类原球茎; 环境胁迫
Effects of Environmental Stress on Proliferation and Differentiation of Proto-
corm-Like Bodies of Different Ploidy Cymbidium hybridum
ZHOU Shan-Shan1, XIE Li1, WANG Chen-Hui1, ZHOU Yu-Liang1, ZENG Rui-Zhen1, GUO He-Rong1, WANG Mu-Gui1, ZHANG
Zhi-Sheng1,2,∗
1Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, South China Agriculture University, Guangzhou 510642,
China; 2National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, Guangzhou 510642, China
Abstract: The proliferation and bud differentiation rate were measured in protocorm-like bodies (PLBs) of dip-
loid, triploid and tetraploid Cymbidium hybridum with different conditions of low and high temperature, ultra-
violet radiation (UV) and dark. The results showed that the proliferation rate of tetraploid PLBs was the highest
at 10 ℃; and the death rates of triploid and tetraploid PLBs were significantly lower than that of diploid PLBs
at 35 ℃ for 20 d, suggesting that polyploidy PLBs had a stronger ability to resist low and high temperature.
Under UV light, the proliferation rates showed the following trend: tetraploid>triploid>diploid, but showed op-
posite trends under fluorescent lamp, indicating that polyploid PLBs were more resistant to UV light. After cul-
tured in dark for 30 d, the proliferation and bud differentiation rates of diploid were obviously increased, how-
ever, the bud differentiation rates of polyploids were decreased, and their proliferation rates were little changed.
Subcultured in dark for 30 d, the bud differentiation rate of diploid further increased, while those of polyploids
further decreased, although the proliferation rate of diploid was decreased, but the range of decrease was lower
than those of polyploids, demonstrating that polyploid PLBs were more sensitive to dark condition. The activi-
ties of SOD, POD and CAT in polyploid PLBs were higher than those in diploid, and MDA contents were lower
than that in diploid, which indicated the changes of antioxidant enzyme system and MDA were important rea-
sons for the enhancement of PLBs resistance.
Key words: Cymbidium hybridium; polyploid; PLBs; environmental stress
多倍体是体细胞中含有三个或三个以上染色
体组的个体(Chen和Ni 2006), 在植物界普遍存在,
是植物物种进化和多样性形成的重要方式, 并在
植物系统演化、抗逆中起着重要作用(Rieseberg等
2003), 同时, 多倍体育种是兰花育种的重要方法
(张志胜2010)。因此进行多倍体性状变化及其机
理研究, 对揭示植物多倍体进化机制、培育适应
性更好的植物新品种具有重要意义。
植物生理学报1266
大量研究表明, 植物染色体组加倍后, 抗逆性
明显增强(商宏莉等2003; 李培旺等2004; Comai
2005; 赵静2011)。多倍体抗逆性的增强是由于其
具有更强的细胞膜保护能力和渗透调节能力(朱恒
星2009; 王园园等2013)、更高的抗氧化酶活性(徐
伟钰2006; Deng等2012)、以及低的丙二醛含量(颜
志明等2007)等方面原因影响。另外, 基因组加倍
后, 基因表达模式的改变也是导致多倍体抗性的
变化的重要原因。张琴(2013)研究结果表明, 染色
体加倍会导致与抗寒性相关基因如PAL基因等表
达的改变, 从而改变了多倍体的耐胁迫能力。上
述研究都是在植株水平上进行的, 而在组织和细
胞水平上对多倍体的适应性和抗性研究报道较
少。此外, 与多倍体对光强和光质(如黑暗和紫外
线)胁迫的相关研究也少见报道。
大花蕙兰是具有重要观赏价值和经济价值的
高档花卉, 其商业化品种多数为多倍体(朱根发等
2006)。本研究以大花蕙兰二倍体及其同源三倍体
和四倍体的类原球茎为材料, 研究高温、低温和
光照对其增殖和分化的影响, 测定类原球茎中超
氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等生理
生化指标。旨在揭示不同倍性大花蕙兰在组织细
胞水平上的抗性差异及其生理生化机理, 为兰花
多倍体育种和进化的深入研究积累更多资料。
材料与方法
1 供试材料
试验材料为大花蕙兰‘楠山幻想曲’ (Cymbidium
hybridum ‘Kusuda Fantasy’) 二倍体(2n=2x=40), 三
倍体(2n=3x=60)和四倍体(2n=4x=80)的类原球茎
(protocorm-like bodies, PLBs), 材料由周珊珊创建
并保存于华南农业大学广东省植物分子育种重点
实验室。
2 方法
2.1 环境胁迫处理
将PLBs切成0.5 cm3大小, 接入MS+1.0 mg·L-1
6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+0.5 g·L-1活性炭+20 g·L-1糖+
7.5 g·L-1卡拉粉+10%椰子汁的培养基上, 每瓶接7
块, 重量在0.8~1.1 g之间, 每处理接16瓶。接种后
将材料分别放入5个光照恒温培养箱中培养。低
温处理的培养箱温度为10 ℃; 高温处理的培养箱
温度为35 ℃; 紫外线处理的培养箱只开紫外灯
(8 W), 培养瓶顶端距灯管10 cm; 暗培养处理不开
照明灯和紫外灯, 各处理的其他培养条件与对照
相同。对照的培养条件为25 ℃, 光照时间为14
h·d-1, 光照强度为15 µmol·m-2·s-1。培养30 d后, 将
在10 ℃、紫外灯或黑暗条件下培养的PLBs分别
接种到新配制的培养基上, 在原培养和对照条件
下继代培养30 d。
培养结束时, 记录每瓶分化出的芽和苗数, 称
取每瓶中类原球茎的重量, 35 ℃处理记录培养过程
中死亡的类原球茎数, 并计算增殖率、芽/苗分化率
和死亡率。增殖率(%)=(培养后类原球茎重量–接
种重量)/接种重量×100; 芽/苗分化率(%)=[分化出的
芽(苗)数/接种类原球茎块数]×100; 死亡率(%)=(死
亡的类原球茎块数/接种类原球茎块数)×100。
2.2 生理生化指标测定
取二倍体、三倍体和四倍体类PLBs各0.5 g,
先加入2 mL 0.05 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH 7.8), 研
磨匀浆后, 再加入3 mL磷酸缓冲液混匀, 4 ℃下
7 423×g离心15 min, 上清液即为粗酶液, 用于测
定。SOD和过氧化物酶(peroxidase, POD)活性测定
参考李合生等(2000)的方法。过氧化氢酶(catalase,
CAT)活性测定采用过氧化氢分解法测定(何宇炯
等1996)。丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量测
定采用硫代巴比妥酸法(李合生等2000)。
2.3 统计分析方法
以上试验结果均釆用SPSS 18.0统计软件进行
分析, 以邓肯氏新复极差法(Duncan’s)测验, 在P为
0.05水平上比较差异显著性。
实验结果
1 低温对不同倍性大花蕙兰PLBs的增殖和分化的
影响
1.1 低温对大花蕙兰PLBs增殖的影响
从图1-A和图4-D~F中看出, 在10 ℃培养条件
下, 二倍体、三倍体和四倍体大花蕙兰PLBs的增
殖率显著低于在25 ℃培养下的, 但不同倍性大花
蕙兰PLBs增殖率下降幅度不同, 四倍体最小, 二倍
体次之, 三倍体最大。这表明, 四倍体PLBs对低温
适应性变强, 三倍体对低温适应性变弱。将10 ℃下
培养30 d的PLBs分别转移到10和25 ℃下进行继代
培养, 结果(图1-B)发现, 10 ℃下培养的二倍体PLBs
增殖率的从33.42%降低到26.1%, 而三倍体和四倍
周珊珊等: 环境胁迫对不同倍性大花蕙兰类原球茎增殖和分化的影响 1267
体的增殖率基本未变; 而在25 ℃下, 四倍体PLBs增
殖率增幅最小, 三倍体次之, 二倍体最大。说明多
倍体对温度变化适应性强, 二倍体适应性弱。
1.2 低温对大花蕙兰PLBs分化的影响
从表1可以看出, 25 ℃培养条件下, 二倍体、
三倍体和四倍体的芽/苗分化率分别为37.14%、
3.57%和25.95%, 3种倍性间差异显著, 多倍化导致
PLBs的芽/苗分化率显著降低。在10 ℃培养条件
下, 芽/苗分化率为0, 说明10 ℃低温抑制了大花蕙
兰PLBs的芽分化。10 ℃培养后转25 ℃继代培养,
二倍体、三倍体和四倍体的芽/苗分化率分别为
71.4%、0和35.18%。这表明低温对不同倍性芽分
化能力影响不同, 低温对三倍体PLBs芽分化的抑
制作用更持久。
2 紫外线对不同倍性大花蕙兰PLBs的增殖和分化
的影响
2.1 紫外线对大花蕙兰PLBs增殖的影响
从图2-A中看到, 在紫外灯下培养, 二倍体、
三倍体和四倍体PLBs的增殖率大小依次是4x>3x>
2x, 与在日光灯下相反, 说明多倍体PLBs对紫外线
的耐受力变强。同时, 长时间在紫外线照射下, 新
生的类原球茎白化(图4-G~I), 恢复日光灯照射后,
白色类原球茎变绿。将紫外灯下培养的PLBs分别
转移到紫外灯和日光灯下继代培养(图2-B), 3种倍
性材料的增殖率均显著下降, 说明紫外灯下培养30
d对二倍体、三倍体和四倍体PLBs均已造成严重
伤害。
表1 在不同培养温度下不同倍性大花蕙兰PLBs的芽/苗分化率
Table 1 Bud/seedling differentiation rate of PLBs of different
ploidy C. hybridum at different temperatures
芽/苗分化率/%
倍性 初代培养 10 ℃继代培养
25 ℃ 10 ℃ 25 ℃ 10 ℃
二倍体 37.14±5.51a 0a 71.40±10.23a 0a
三倍体 3.57±0.28c 0a 0c 0a
四倍体 25.95±3.54b 0a 35.18±4.65b 0a
　　同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同此。
图1 在不同温度下二倍体、三倍体和四倍体大花蕙兰PLBs的增殖率
Fig.1 Proliferation rate of PLBs of diploid, triploid and tetraploid C. hybridum at different temperatures
A: 在不同温度下PLBs的初代培养; B: 10 ℃培养的PLBs继代培养。不同小写字母表示同一处理下不同倍性间差异显著(P<0.05), 下图同此。
图2 在不同光质下二倍体、三倍体和四倍体大花蕙兰PLBs的增殖率
Fig.2 Proliferation rate of PLBs of diploid, triploid and tetraploid C. hybridum under different light qualities
A: PLBs在日光灯和紫外灯下的初代培养; B: 紫外灯培养后的PLBs在日光灯和紫外灯继代培养。
植物生理学报1268
2.2 紫外线对大花蕙兰PLBs分化的影响
由表2可见, 紫外灯下培养, 二倍体和四倍体
的芽/苗分化率均比日光灯下培养的低, 但四倍体
下降幅度大于二倍体, 紫外灯下培养的三倍体芽/
苗分化率高于日光灯下培养的芽/苗分化率。说明
紫外线对不同倍性大花蕙兰PLBs分化影响不同。
将在紫外灯下培养的PLBs转移至紫外灯下培养,
二倍体和四倍体的芽/苗分化率继续下降, 三倍体
芽 /苗分化继续上升。而将在紫外灯下培养的
PLBs转移至日光灯下培养, 二倍体芽/苗分化率迅
速增高、三倍体和四倍体芽/苗分化率则恢复到无
紫外线处理的水平。表明紫外线促进三倍体的芽
分化、而二、四倍体的芽分化受紫外线抑制。
性PLBs分别转移到黑暗和光照下培养(图3-B), 二
倍体、三倍体和四倍体增殖率均明显下降, 但三
倍体和四倍体下降幅度明显高于二倍体。表明长
期的黑暗对不同倍性PLBs增殖均不利, 但多倍体
对暗培养耐受性比二倍体弱。
3.2 黑暗培养对大花蕙兰PLBs分化的影响
从表3可知, 黑暗培养下, 三倍体和四倍体芽/
苗分化率明显低于光培养下的芽/苗分化率, 而二
倍体的芽/苗分化率明显提高。表明黑暗培养有利
于二倍体的芽分化, 染色体加倍不仅导致大花蕙
兰多倍体PLBs芽分化能力显著降低, 而且导致对
黑暗培养适应性变弱。
4 高温对不同倍性大花蕙兰PLBs存活的影响
在35 ℃条件下, 二倍体、三倍体和四倍体
PLBs均从第6天开始PLBs由绿色变为黄色, 逐渐死
亡(图5)。在第10天时, 二倍体死亡率为50.9%, 三
倍体为24.1%, 四倍体为19.4%。第20天时, 二、三
和四倍体的死亡率分别是97.3%、82.1%和73.5%
(图6)。结果表明, 与二倍体相比, 四倍体和三倍体
具有更强的耐高温胁迫能力。
5 不同倍性大花蕙兰PLBs抗氧化酶活性和MDA
含量
从表4可以看出, 二倍体、三倍体和四倍体
PLBs中的SOD活性差异显著, 三倍体中的SOD活
性最高、四倍体次之、二倍体最低。不同倍性间
的POD活性没有显著差异。但CAT活性差异显著,
四倍体最高, 三倍体次之, 二倍体最低。不同倍性
间的丙二醛MDA含量差异也显著, 大小趋势是
2x>3x>4x, 说明在PLBs阶段, 四倍体和三倍体膜脂
过氧化作用小与二倍体, 当受逆境胁迫时, 伤害程
度较低, 因此抗性强。
表2 在不同光质下不同倍性大花蕙兰PLBs的芽/苗分化率
Table 2 Bud/seedling differentiation rate of PLBs of different
ploidy C. hybridum under different light qualities
芽/苗分化率/%
倍性 初代培养 紫外灯处理的继代培养
日光灯 紫外灯 紫外灯 日光灯
二倍体 37.14±5.51a 25.00±4.06a 22.62±4.29a 66.67±7.17a
三倍体 3.57±0.28c 4.28±0.71c 8.73±0.79b 2.38±2.38c
四倍体 25.95±3.54b 14.28±1.45b 6.81±0.34b 24.74±14.28b
3 黑暗培养对不同倍性大花蕙兰PLBs的增殖和分
化的影响
3.1 黑暗培养对大花蕙兰PLBs增殖的影响
从图3-A可以看出, 与光照条件相比, 暗培养
下二倍体的增殖率明显提高、三倍体和四倍体无
明显变化, 黑暗培养下类原球茎白化的程度强于
紫外线培养下的(图4-J~L)。将暗培养下的3种倍
图3 在不同光照下二倍体、三倍体和四倍体大花蕙兰PLBs的增殖率
Fig.3 Proliferation rate of PLBs of diploid, triploid and tetraploid C. hybridum under different light intensity
A: PLBs在光照和黑暗条件下的初代培养; B: 黑暗培养后的PLBs分别在光照和黑暗下继代培养。
周珊珊等: 环境胁迫对不同倍性大花蕙兰类原球茎增殖和分化的影响 1269
讨　　论
多倍体是植物进化的重要方式, 也是植物改
良的主要途径之一。本研究首次以二倍体大花蕙
兰及其同源三倍体和四倍体类原球茎为材料, 在
组织细胞水平上研究了不同倍性大花蕙兰类原球
茎对环境胁迫的抗性。结果表明, 多倍体类原球
茎对低温、高温和紫外线耐受性增强, 但对黑暗
的耐受性变弱。这为进一步开展多倍体进化机理
和育种研究积累了新资料。
表3 在不同光照下不同倍性大花蕙兰PLBs的芽/苗分化率
Table 3 Bud/seedling differentiation rate of PLBs of
different ploidy C. hybridum under
different light intensity
芽/苗分化率/%
倍性 初代培养 黑暗处理的继代培养
光照 黑暗 光照 黑暗
二倍体 37.14±5.51a 47.61±5.46a 42.28±8.24a 79.36±8.83a
三倍体 3.57±0.28c 1.19±1.19b 0c 0c
四倍体 25.95±3.54b 7.14±13.7b 9.43±2.12b 2.14±1.09b
图4 在不同环境胁迫下二倍体、三倍体和四倍体大花蕙兰类原球茎的增殖和芽分化情况
Fig.4 Proliferation and bud/seedling differentiation of PLBs of diploid, triploid
and tetraploid C. hybridum at different environmental stress
A~C: 正常培养; D~F: 10 ℃; G~I: 紫外线照射; J~L: 黑暗。
植物生理学报1270
植物的耐热性和抗寒性与MDA含量呈负相
关关系(李衍素等2007; 王小丽等2009), 与SOD、
POD和CAT活性呈正相关关系(刘小俊等2011; 孙
军利等2014)。王园园等(2013)对二倍体和四倍体
杂交兰抗逆性的研究结果表明, 四倍体较二倍体
杂交兰具有更强的抗高温和低温特性, 高温胁迫
下, 四倍体的SOD和CAT活性增幅均显著大于二倍
体, POD活性的降幅则小于二倍体; 而低温胁迫下,
杂交兰叶片抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性总
体上呈增加趋势 , 且四倍体增幅显著大于二倍
体。本研究发现, 三倍体和四倍体类原球茎比二
倍体更耐高温和低温, 其SOD、POD和CAT的活性
比二倍体高, MDA含量比二倍体低, 说明在组织细
胞水平耐热性和抗寒性与SOD、POD和CAT活性
以及MDA含量密切相关, SOD、POD和CAT活性
以及MDA含量可以成为组织细胞水平筛选耐热和
抗寒大花蕙兰类原球茎的依据。但组织细胞水平
耐高温耐寒性与植株水平是否一致还有待于进一
步研究。
光照与植物的生长、发育、分布等密切相
关。黄荣福等(1996)对青藏高原59个草本植物倍
性研究时发现, 多年生草本被子植物多倍体频率
随海拔高度上升而增加。本试验中, 在紫外灯下
培养, 多倍体类原球茎增殖率的增幅高于二倍体
增幅, 表明多倍体PLBs在强紫外线环境中适应能
图6 在35 ℃培养下二倍体、三倍体和四倍体
大花蕙兰PLBs的死亡率
Fig.6 Death rate of PLBs of diploid, triploid
and tetraploid C. hybridum at 35 ℃
图5 在35 ℃下二倍体、三倍体和四倍体大花蕙兰类原球茎的存活情况
Fig.5 The survial of PLBs of diploid, triploid and tetraploid C. hybridum at 35 ℃
A~C: 35 ℃培养第10天; D~F: 35 ℃培养第20天; G~I: 35 ℃培养第30天。
周珊珊等: 环境胁迫对不同倍性大花蕙兰类原球茎增殖和分化的影响 1271
表4 不同倍性大花蕙兰PLBs中SOD、POD、CAT活性和MDA含量
Table 4 The activities of SOD, POD, CAT and MDA content of PLBs of different ploidy C. hybridum
倍性 SOD活性/U·g-1 (FW) POD活性/U·g-1 (FW) CAT活性/U·g-1 (FW) MDA含量/μmol·g-1
二倍体 83.44±4.46b 6.51±0.45a 6.76±0.31c 0.881±0.055a
三倍体 118.03±4.72a 6.98±0.60a 7.67±0.79b 0.782±0.012b
四倍体 87.07±3.36b 6.80±1.79a 9.24±2.04a 0.536±0.115c
力变强。而研究表明, 紫外线通过抑制光合作用
物质合成(Yao和Liu 2006; 黄梅玲等2010)以及光氧
化造成植株体内IAA含量下降(Li等2002)影响植物
生长, 多倍体具有的较强紫外线适应能力可能由
于基因组剂量的变化引起了植物体内内源激素含
量(孙敏红和张蜀宁2006; 齐永顺等2009)和光合作
用(Coate等2011; 安飞飞等2013)的改变而导致
的。在组织培养中, 暗培养有利于提高中间繁殖
体的增殖率(邢小明2013), 但不利于分化, 本研究
结果也表明短期暗培养有利于类原球茎的增殖,
但连续暗培养导致增值率下降。暗培养对不同倍
性类原球茎增殖的影响不同, 对多倍体类原球茎
增殖影响更大, 暗培养不利于多倍体类原球茎的
芽苗分化, 但二倍体的芽苗分化率不降反增。表
明多倍体对黑暗环境适应性更差, 其机理有待于
进一步的研究。
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