全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (8): 795~803 795
收稿 2012-04-01　　修定 2012-06-26
资助 国家自然科学基金(30870194)、陕西省重点实验室科
研计划(08JZ70和2010JS090)、陕西省教育厅科研计划
(11JK0612)和陕西省科学技术研究发展计划(社发攻关
2010K16-04-01)。
* 通讯作者(E-mail: ziqinxu@nwu.edu.cn; Tel: 029-88303484)。
拟南芥HyPRP蛋白AZI1在转基因烟草中的亚细胞定位及其对灰葡萄孢
的抗性
杜改亮, 高航, 徐子勤*
西北大学生命科学学院, 陕西省生物技术重点实验室, 西部资源与现代生物技术省部共建教育部重点实验室, 西安710069
摘要: 通过农杆菌转化法得到了整合有拟南芥AZI1基因的烟草植株, 进一步利用转基因烟草分析了AZI1蛋白的亚细胞定位
及其对真菌病原体的抗性特征。在上下游引物5端分别引入NcoI和SpeI酶切位点, 采用高保真耐热DNA聚合酶Pfu从拟南
芥Col-0生态型基因组DNA扩增AZI1基因的编码序列, 用NcoI和SpeI对扩增片段和pCAMBIA1302质粒载体进行双酶切, 通
过T4 DNA连接酶构建产生AZI1-GFP融合表达载体。用包含融合表达载体的农杆菌细胞转化烟草叶片, 经潮霉素选择获得
了完整的再生植株, 并收取了T0代种子。激光共聚焦显微观察发现, AZI1蛋白主要定位于细胞表面。病原体侵染结果显示,
AZI1基因能够明显提高烟草对灰葡萄孢的抗性。说明AZI1蛋白通过分泌途径被定位到细胞表面后, 能够抑制真菌病原体
对植物组织的侵染过程。
关键词: AZI1基因; ‘秦烟95’; 亚细胞定位; 灰葡萄孢; DAB染色; 台盼蓝染色
Subcellular Localization and Resistance to Botrytis cinerea of the Arabidopsis
HyPRP Protein AZI1 in Transgenic Tobacco
DU Gai-Liang, GAO Hang, XU Zi-Qin*
Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Shaanxi Provincial Key Labo-
ratory of Biotechnology, College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China
Abstract: Transgenic tobacco plants harbouring AZI1 of Arabidopsis thaliana were regenerated by Agrobacte-
rium mediated transformation method. In subsequent experiments, these plants were used in determination of
the subcellular localization of AZI1 and identification of the resistance to Botrytis cinerea. A NcoI site and a
SpeI site were introduced into the 5 end of the forward primer and the reverse primer respectively. The coding
sequence of AZI1 were amplified with Pfu from genomic DNA of Arabidopsis ecotype Col-0. NcoI and SpeI di-
gested PCR product and pCAMBIA1302 were ligated with T4 DNA ligase to produce the funsion expression
vector of AZI1-GFP. Agrobacterium tumefaciens strain containing the fusion expression vector was used in ge-
netic transformation of tobacco leaves. Transgenic plants were regenerated by hygromycin selection. Observa-
tion under laser scanning confocal microscope showed that AZI1 was mainly localized to cell surface. Results
of pathogen inoculation indicated that AZI1 could improve the resistance of tobacco plants to B. cinerea effec-
tively. It suggests that the secreted form of AZI1 can repress the infection process of pathogenic fungi to plant
tissues.
Key words: AZI1; ‘Qinyan 95’; subcellular localization; Botrytis cinerea; DAB staining; trypan blue staining
动物、植物和微生物中都存在大小为9~10
kDa的脂转移蛋白(lipid transfer protein, LTP), 含量
约占总可溶性蛋白的4%。LTP属于分泌性蛋白,
定位于细胞壁, 它们能够在膜之间转移磷脂分子
(Kader 1996)。LTP对脂类分子的亲和作用没有选
择性, 所以也被称为非特异性脂转移蛋白(non-spe-
cific lipid transfer protein, nsLTP)。已有的研究结
果显示, LTP与角质层形成、胚胎发育和植物对真
菌的防御反应有关。真菌侵染可以诱导LTP基因
表达, 这时在植物细胞表面能够观察到大量LTP蛋
白, 说明这类蛋白质参与了植物对病原体的抗性
应答过程(Reina-Pinto和Yephremov 2009)。LTP蛋
植物生理学报796
白最重要的特征是含有8个位置高度保守的半胱
氨酸, 可以形成4个二硫键。它们的三级结构十分
稳定, 中间具有一个疏水性空穴, 可以转运多种类
型的脂质分子(Shin等1995)。在大肠杆菌等受体
细胞中表达的LTP重组蛋白对病原体也具有很强
的抗性(Zottich等2011)。
拟南芥AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1,
AT4G12470)基因编码的蛋白质由N端的信号肽、
中间的富含脯氨酸结构域(proline-rich domain,
PRD)和C端的八半胱氨酸结构域(eight cysteine
motif, 8CM)构成(Zhang和Schläppi 2007)。由于C
端的疏水性8CM在结构上与LTP十分相似, AZI1蛋
白也被划分到蛋白酶抑制剂/种子储藏蛋白/脂转
移蛋白家族中。GENEVESTIGATOR数据库中的
基因芯片分析结果显示, AZI1基因的表达受到多种
真菌病原体的诱导。过表达AZI1基因的拟南芥植
株能够抵抗真菌病原体的侵染(Chassot等2007)。
相反, azi1突变体的系统性获得抗性遭到破坏(Jung
等2009)。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)
是一种重要的蛋白质标签, 利用它独特的发光机
制可以监测基因的表达情况, 确定蛋白质在细胞
内的分布特征。将目的基因与GFP基因融合后转
移到合适的细胞中进行表达, 然后借助荧光显微
镜便可对标记的蛋白质进行活体观察(Nishimura
等2008)。本工作将AZI1基因的编码序列连接到绿
色荧光蛋白基因之前, 通过农杆菌介导的遗传转
化方法得到了可以表达AZI1-GFP融合蛋白的烟草
植株, 在研究AZI1对真菌病原体的抗性的同时, 还
对该蛋白进行了定位分析。
已有的研究结果表明 , 在拟南芥中过表达
A Z I 1基因对灰葡萄孢具有抑制作用 (张欣等
2011)。本工作将AZI1基因转入烟草, 发现它也能
够提高烟草对灰葡萄孢的抵抗能力, 显示该基因
在改良农作物对生物胁迫的抗性方面具有一定的
应用价值。
材料与方法
本工作使用的起始材料为拟南芥(Arabidopsis
thaliana L.) Columbia-0 (Col-0)生态型种子和烟草
(Nicotiana tabacum L.)品种‘秦烟95’种子。基因克
隆实验的受体细胞为DH5α大肠杆菌菌株, 烟草遗
传转化实验采用农杆菌LBA4404。
以拟南芥Col-0基因组DNA为模板, 根据AZI1
基因的开放阅读框设计引物。上游引物的序列为
5 CATGCCATGGCTTCAAAGAACTCAGCC 3
(横线表示NcoI酶切位点) ; 下游引物的序列为
5 GGACTAGTAGCACATTGGAAACCAG 3 (不包
含终止密码, 横线表示SpeI酶切位点)。使用Pfu高
保真DNA聚合酶进行PCR反应, 用NcoI和SpeI对纯
化的485 bp扩增片段和pCAMBIA1302进行双酶
切 , 用T4 DNA连接酶将AZI1编码序列插入到
pCAMBIA1302的35S启动子和GFP报告基因之
间。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后, 用附加50
mg·L-1卡那霉素的LB培养基进行选择。37 ℃恒温
培养16~18 h后, 挑取单菌落进行菌液PCR及酶切
分析。将鉴定后的克隆送上海生工生物技术公司
进行测序。
采用液氮冻融法将AZI1-GFP融合表达载体导
入农杆菌LBA4404感受态细胞, 在附加100 mg·L-1
链霉素、50 mg·L-1卡那霉素和20 mg·L-1利福平的
YEB培养基上进行选择。抗性菌落经PCR鉴定后
在附加相同抗生素的YEB液体培养基中培养至
OD600≈0.6, 用于烟草转化。将灭菌处理的烟草叶
片切成小块, 放到农杆菌细胞培养物中侵染7 min
左右。外植体先在附加0.2 mg·L-1 NAA和1 mg·L-1
6-BA的MS固体培养基上暗培养3 d, 然后转移到含
有25 mg·L-1潮霉素B (HmB)、500 mg·L-1头孢霉素
(Cef)的相同培养基上进行选择培养, 形成愈伤组
织和芽。将再生芽切下, 转接到MS固体培养基上
生根。再生的完整烟草植株长到一定高度后, 移
栽到营养土中生长, 成熟后收取种子。取转基因
烟草的叶片和根, 在Olympus激光扫描共聚焦显微
镜下进行观察。使用495~511 nm FITC滤光器拍摄
GFP荧光, 激发光波长采用488 nm。
采用CTAB法提取基因组DNA (Stewart和Via
1993), 对具有潮霉素抗性的烟草植株进行PCR检
测。上游引物序列为5 C AT G C C AT G G C T-
TCAAAGAACTCAGCC 3 , 下游引物序列为
5 GGACTAGTAGCACATTGGAAACCAG 3。为
了检测AZI1基因在烟草基因组中的拷贝数, 从野
生型烟草和PCR鉴定为阳性的转基因烟草叶片提
杜改亮等: 拟南芥HyPRP蛋白AZI1在转基因烟草中的亚细胞定位及其对灰葡萄孢的抗性 797
取DNA, 用NcoI进行单酶切, 并以NcoI和SpeI双酶
切的pCAMBIA1302-AZI1-GFP质粒DNA为阳性对
照。用PCR扩增产生的485 bp AZI1基因ORF序列
制备探针, 按Roche公司的DIG High Prime DNA
Labeling and Detection Starter Kit II试剂盒说明书
进行Southern印迹分析。
抗性分析使用的灰葡萄孢(Botrytis cinerea
Pers. ex Fr.)由本实验室保存。菌株在马铃薯培养
基上于22 ℃培养8 d后(杨红玉等2005), 用无菌水
悬浮孢子, 经玻璃棉过滤除去菌丝后用1/4马铃薯
培养基稀释成6×104 (孢子)·mL-1的悬浮液。将40
μL孢子悬浮液接种于离体的野生型‘秦烟95’和
AZI1转基因烟草叶片表面, 然后置于22 ℃、16 h光
照、90%湿度条件下, 每隔5 d观察叶片的颜色变
化情况和灰葡萄孢的侵染程度。侵染实验重复4
次, 每次接种2片叶子。
为了检测侵染部位H2O2的积累水平, 将侵染
24 h后的叶片用0.5% DAB (3,3-二氨基联苯胺)在
37 ℃染色过夜, 经75%乙醇脱色后用80%甘油封
片, 在显微镜下观察侵染情况。同时, 在接种24 h
后用0.4%台酚蓝于37 ℃染色1 h, 在85%乙醇中煮
10 min脱去叶绿素, 用80%甘油封片, 在显微镜下
观察细胞的存活状态。
为了研究T-DNA插入拷贝数对烟草植株中
GFP表达的影响, 从3株不同的转基因烟草(分别命
名为TT1、TT2和TT3)和野生型烟草各取0.1 g叶
片, 提取RNA, 应用ExScript RT Reagent Kit (TaKa-
Ra)合成cDNA, 进行反转录PCR, 上游引物序列为
5 CATGCCATGGCTTCAAAGAACTCAGCC 3,
下游引物序列为5 GGACTAGTAGCACATTG-
GAAACCAG 3。分析AZI1基因的的表达水平。
RT-PCR实验共重复4次。同时, 在激光共聚焦显微
镜下观察不同植株根的GFP荧光强度。在分析拷
贝数对抗性水平的影响时, 取不同株转基因烟草
和野生型烟草各1片叶子, 在离体条件下用灰葡萄
孢侵染, 7 d后观察叶片的损伤程度。
为了检测转基因烟草中AZI1基因的表达是否
受病菌侵染诱导, 取TT2植株进行灰葡萄孢侵染, 2
d后取侵染叶片和无侵染叶片各0.1 g提取RNA, 应
用ExScript RT Reagent Kit (TaKaRa)合成cDNA, 进
行反转录PCR, 上游引物序列为5 CATGCCATG-
GCTTCAAAGAACTCAGCC 3, 下游引物序列为
5 ACGTGTCTTGTAGTTCCCGTCP 3, 分析AZI1
的表达水平。RT-PCR实验共重复4次。
结果与讨论
1 AZI1蛋白的结构特征
AZI1基因属于HyPRP家族, 开放阅读框全长
485 bp, 编码产物由N端的信号肽(1~25)、中间的
PRD (26~77)和C端的8CM (78~161)构成(图1)
(Zhang和Schläppi 2007), 大小为14.7 kDa。生物信
息学分析发现AZI1蛋白的富含脯氨酸结构域具有
亲水性特征 , 八半胱氨酸结构域具有疏水性特
征。正是由于双亲性结构域的存在, 该蛋白被归
类到HyPRP家族中。AZI1的8CM在结构上与非特
异性脂转移蛋白十分相似, 它可能具有LTP蛋白的
功能。对GENEVESTIGATOR (www.genevestiga-
tor.ethz.ch/gv/index.jsp)数据库中的芯片实验数据
进行分析, 结果显示AZI1基因在拟南芥受到病原
体侵染时表达水平会大幅度提高, 说明AZI1基因
能够应答生物胁迫因素, 它可能参与了植物防卫
体系。
2 转AZI1烟草植株的再生
用NcoI和SpeI对构建好的pCAMBIA1302-AZI1-
GFP融合表达载体进行双酶切, 可以产生预期的
485 bp片段(图2)。通过冻融法将pCAMBIA1302-
AZI1-GFP转入农杆菌LBA4404, 采用菌落PCR进
行鉴定后对‘秦烟95’进行遗传转化。取烟草叶片
图1 AZI1蛋白的氨基酸序列
Fig.1 Amino acid sequence of AZI1
黑色部分为信号肽; 红色部分为PRD; 蓝色部分为8CM。
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进行灭菌处理, 将其切成小块, 浸入农杆菌中侵染。
在含有0.2 mg·L-1 NAA和1 mg·L-1 6-BA的固体培养
基上暗培养3 d后, 将外植体转移到附加25 mg·L-1
潮霉素B (HmB)和500 mg·L-1头孢霉素(Cef)的相同
培养基上进行选择。在MS固体培养基上生根。最
后将再生植株移栽到营养土中生长至成熟(图3)。
经潮霉素选择和PCR检测共获得4株转基因烟草植
株(图4)。
3 AZI1蛋白在烟草中的亚细胞定位
首先采用聚合酶链反应从拟南芥中克隆了
AZI1基因的编码序列, 然后将其连接到pCAM-
BIA1302中, 通过载体上的GFP基因确定了AZI1蛋
白在细胞内的存在部位, 发现该蛋白主要分布在
细胞表面。AZI1蛋白的这一亚细胞定位特征反映
它可能与感受和传递病原体侵染信号有关, 参与
图3 转AZI1基因再生烟草
Fig.3 Regeneration of AZI1 transgenic tobacco plants
A: 侵染后的外植体; B: 再生芽; C: 在MS培养基上生根; D: 完整的再生植株; E: 移栽苗; F: 开花的转基因烟草。
了拟南芥对生物胁迫因素的应答过程。用激光共
聚焦显微镜观察阳性GFP-AZI1转基因烟草的叶
片, 结果显示AZI1蛋白定位在细胞表面, GFP荧光
和叶绿素荧光不能重叠(图5)。对转基因烟草的根
进行荧光观察, 可以更为清楚地看到GFP仅出现在
细胞膜或细胞壁上(图6)。
绿色荧光蛋白是一种能够产生强烈荧光的特
殊蛋白质, 与其他蛋白融合后它的发光特性不会
受到影响。与荧光素酶(Luc)和β-葡萄糖苷酶
(GUS)相比, GFP具有不需要任何底物和辅助因子
就可以自身发光的特性, 在植物遗传转化实验中
已得到广泛应用(赵华等2003)。
4 转AZI1-GFP基因烟草的抗性分析
从叶片提取DNA, 单酶切后进行Southern印迹
分析, 结果显示转基因烟草中整合有1~2个拷贝的
外源基因。如图7所示, TT1和TT3有两个拷贝的
AZI1-GFP基因, TT2只有一个拷贝的AZI1-GFP基
因。
为了分析AZI1基因对真菌病原体的抗性, 对
切下的转基因烟草叶片进行了灰葡萄孢侵染。侵
图2 pCAMBIA1302-AZI1-GFP融合表达载体的酶切鉴定
Fig.2 Restriction digestion of fusion expression vector of
pCAMBIA1302-AZI1-GFP
1: 未经酶切的pCAMBIA1302-AZI1-GFP; 2: 经NcoI和SpeI双
酶切的pCAMBIA1302-AZI1-GFP; M: DL2000 DNA Marker。
杜改亮等: 拟南芥HyPRP蛋白AZI1在转基因烟草中的亚细胞定位及其对灰葡萄孢的抗性 799
染5 d后的转基因烟草和野生型烟草叶片在表型上
基本相似, 中间出现坏死现象但两种烟草差别不
大。侵染10 d之后, 野生型烟草叶片中间的坏死部
位慢慢扩散, 损伤程度明显比转基因烟草严重(图
8)。结果显示与野生型烟草相比, AZI1-GFP转基
因烟草对灰葡萄孢具有明显的抗性。
转基因烟草被灰葡萄孢侵染后, 会产生超敏
反应(hypersensitive response, HR)。HR指在接种后
的短时间内感染部位产生的大量活性氧(ROS)分
子可以造成细胞死亡, 将病原体的生长限制在一
定范围内, 能够阻止病菌的扩散, 防止产生大范围
的损伤。ROS包括H2O2、O2·ˉ和·OH等(Thordal-
christensen等1997; Wang等2008)。DAB能够将产
图4 转基因烟草的PCR分析
Fig.4 PCR analysis of transgenic tobacco plants
1: 阴性对照H2O; 3、5: 非转基因植物的DNA; 2、4、6、
7: 转基因植物的DNA; PCR产物大小为485 bp; M: DL2000 DNA
Marker。
图5 转AZI1-GFP基因TT2烟草叶片细胞的荧光检测
Fig.5 Fluorescence detection in leaf cells of TT2 transgenic tobacco plant habouring AZI1-GFP
A: 叶绿素荧光; B: GFP荧光; C: A与B的叠加。
图6 转AZI1-GFP基因TT2烟草根细胞的荧光检测
Fig.6 Fluorescence detection of GFP in root cells of TT2 transgenic tobacco plant
A: 转基因烟草根的横切面; B: 转基因烟草的根; C: 野生型烟草的根。
生H2O2的部位染成红色。用灰葡萄孢接种后, 野
生型烟草叶片经DAB染色后, 可以观察到范围较
大的被染成浅红色的区域(图9-A), 表明灰葡萄孢
接种后会造成低水平的H2O2积累, 不能产生超敏
反应, 病原体可以继续侵染周围的细胞, 并最终使
叶片枯萎。与此不同, 在转基因烟草叶片上可以
植物生理学报800
观察到一些被染成深红色的点(图9-B), 反映灰葡
萄孢侵染可以引起H2O2的大量积累; 由于HR的发
生, 这些被侵染位点的细胞会在短时间内发生程
序性死亡, 抑制了分生孢子和菌丝的生长, 使得灰
葡萄孢不能继续侵染周围的细胞。以上结果表明,
AZI1能够明显提高烟草对灰葡萄孢的抵抗能力。
台盼蓝染色结果显示野生型烟草叶片的被感
染部位可以逐渐扩大, 细胞已经解体, 在周围可以
看到大量被染成蓝色的死亡细胞。而AZI1转基因
烟草叶片的被侵染部位很小, 坏死现象明显减轻,
病原菌不能扩散(图10)。台盼蓝是检测细胞膜完
整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能
够排斥台盼蓝, 而死亡细胞由于膜的完整性被破
坏、通透性增加, 可被台盼蓝染成蓝色。灰葡萄
孢侵染后, 用台盼蓝对烟草叶片进行染色可以观
察损伤细胞的分布范围。实验结果显示AZI1转基
因烟草叶片上被侵染部位很小, 野生型烟草叶片
上损伤部位很大。在与病原体的相互作用中, LTP
可能参与激发子触发植物细胞过敏性反应的信号
转导过程(刘梅芳等2008; Kirubakaran等2008)。激
发子具有甾醇转移活性, 它们与甾醇形成的复合
图7 转基因烟草的Southern印迹分析
Fig.7 Southern blotting analysis of transgenic tobacco plants
P: 双酶切的pCAMBIA1302-AZI1-GFP质粒DNA; TT1~TT3:
单酶切的转AZI1-GFP烟草基因组DNA; CK: 野生型烟草的基因组
DNA。
图8 灰葡萄孢侵染后野生型和转基因TT2烟草叶片的表型特征
Fig.8 Phenotype of the leaves of wild-type and TT2 transgenic tobacco plants after inoculation with B. cinerea
A: 接种当天; B: 接种后5 d; C: 接种后10 d。W: 野生型烟草叶片; T: 转基因烟草叶片。箭头指向侵染点。
图9 灰葡萄孢侵染24 h后TT2叶片的DAB染色观察
Fig.9 DAB staining of the TT2 leaves subjected to infection
with B. cinerea after 24 h
A: 野生型烟草叶片; B: AZI1转基因烟草叶片。箭头指向侵染点。
图10 灰葡萄孢侵染后TT2烟草叶片的台盼蓝染色
Fig.10 Trypan blue staining of the TT2 tobacco leaves after
infection with B. cinerea
A: 野生型烟草的叶片; B: AZI1转基因烟草叶片。箭头指向侵染点。
杜改亮等: 拟南芥HyPRP蛋白AZI1在转基因烟草中的亚细胞定位及其对灰葡萄孢的抗性 801
物可以和植物细胞膜上的受体蛋白互相作用, 引
起植物细胞的超敏反应, 进而激活与抗病防卫反
应有关的信号转导途径, 诱导植物抗性。LTP也参
与了系统性获得抗性, 除了通过超敏反应阻止病
原体的扩散、防止产生大范围的损伤外, 还涉及
胁迫反应信号向个体其他部位的传递过程(Suzuki
等2004; Maldonado等2002)。由于LTP和激发子在
空间结构上有相似性, 所以LTP可以竞争性结合激
发子的膜受体, 抑制细胞死亡并诱导系统抗性的
产生。
AZI1蛋白也是LTP家族的一个成员(范芸等
2011)。拟南芥在受到壬二酸和病原体诱导后 ,
AZI1基因明显上调, 同时伴随着水杨酸(SA)的积
累, 而azi1突变体不具有这一特征(Jung等2009)。
在拟南芥中过表达AZI1基因可以增加个体对生物
胁迫的抗性(张欣等2011)。为了进一步证实AZI1
基因在植物防御体系中的功能, 本工作将其转入
模式植物烟草中, 并用灰葡萄孢孢子对转AZI1基
因烟草和野生型烟草叶片进行离体侵染, 从DAB
和台盼蓝染色结果都可以看出AZI1基因对灰葡萄
孢具有一定的抗性。AZI1基因由CaMV 35S启动
子控制, 无需诱导即可实现组成型表达。已有研
究报道AZI1蛋白对灰葡萄孢有一定的抑制作用
(张欣等2011)。本研究实验结果显示, 作为细胞表
面蛋白, AZI1有可能会直接破坏真菌病原体的细
胞壁和细胞膜, 同时激活植物细胞的防御性机制,
通过产生H2O2启动系统获得性抗性, 阻止灰葡萄
孢继续扩散。而野生型烟草受到病原菌侵染后,
无法形成HR反应, 病原体可以继续侵染接种位点
周围的细胞。
灰葡萄孢侵染植物时, 会产生许多细胞壁降
解酶或毒素, 从而导致植物细胞破裂死亡。AZI1
蛋白作用的机制(郑灿伟和宾金华2008)可能包括4
个方面: (1)改变细胞膜的通透性, 在灰葡萄孢与植
物细胞相互作用过程中, AZI1蛋白插入到灰葡萄
孢细胞膜中, 其中央疏水区形成的空洞促使真菌
细胞内部离子流出, 导致真菌死亡。(2) AZI1蛋白
可能直接插入真菌细胞膜中, 引起细胞膜穿孔导
致细胞破裂。(3) AZI1蛋白可能破坏病原性真菌
孢子, 抑制孢子萌发; 它还可能降低菌丝活力, 其
抑菌效果与渗透蛋白引起真菌细胞膜pH梯度的消
失有关。(4)灰葡萄孢侵染植物后, 病菌的激发子
可能与植物细胞膜上的受体蛋白相互作用, 从而
引起下游抗性基因的表达, 抑制灰葡萄孢的生长
和扩散; 激光共聚焦观察结果显示AZI1蛋白定位
于细胞表面, 它有可能会促进胁迫信号的传递过
程(Jung等2009), 加强植物细胞对病原体的防御性
反应。
5 转基因拷贝数对GFP表达水平的影响
对3株转基因烟草进行RT-PCR分析, 结果表
明TT2植株的GFP mRNA表达量比TT1植株和TT3
植株高, 说明双拷贝植株中外源基因的转录水平
比单拷贝植株低(图11)。通过激光共聚焦发现TT2
植株的绿色荧光强度也比TT1植株和TT3植株强
(图12)。原因可能在于多个拷贝会诱导基因沉默,
拷贝数越多, 基因沉默现象越严重。以前的研究
报道显示, 外源基因如果以多拷贝的形式整合到
同一位点, 形成首尾相连的正向重复或反向重复,
有可能被完全沉默, 因为重复序列之间会自发配
对, 进而被甲基化和异染色质化(叶爱华等2003)。
图11 转基因烟草的RT-PCR分析
Fig.11 RT-PCR analysis of transgenic tobacco plants
1~4: 烟草actin基因, 1: TT1, 2: TT2, 3: TT3, 4: 非转基因烟草
的cDNA; M: DL2000 DNA Marker; 5~7: AZI1-GFP融合基因, 5:
TT1, 6: TT2, 7: TT3; 8: 重组质粒AZI1-GFP (PCR产物大小为824
bp); 9: 非转基因烟草的cDNA。
6 灰葡萄孢侵染前后转基因烟草中AZI1基因的表
达分析
选取TT2两片叶子, 其中一片叶子进行灰葡萄
孢侵染, 另一片叶子不作任何处理, 提取RNA, 进
行反转录PCR。从图13可以看出TT2植株受灰葡
萄孢侵染前后, AZI1基因的表达量基本一致, 说明
转基因烟草中AZI1的表达不受病菌侵染诱导, 病
植物生理学报802
菌侵染后AZI1的表达没有增强。
7 不同拷贝数对转基因烟草抗性水平的影响
用灰葡萄孢侵染不同转基因烟草株系, 从图
14可以看出野生型烟草叶片变黄, 中间的接种点
出现较大的坏死区域, 而转基因烟草TT1、TT2、
TT3植株的受损伤程度较轻, 中间的接种点只出现
较小的坏死区域。不同转基因烟草株系的抗菌性
没有明显差异, 说明AZI1能够明显提高烟草对灰
葡萄孢的抵抗能力。
参考文献
范芸, 周晓燕, 王幼平(2011). 脂质转移蛋白在植物抗病中的作用.
分子植物育种, 9: 1245~1252
刘梅芳, 朱晓程, 肖华山(2008). 植物激发子及其信号传导之研究进
展. 中国农学通报, 24: 215~220
杨红玉, 李湘, 张一凡, 李然(2005). 灰霉菌培养及其对拟南芥的侵
染. 西南农业学报, 18: 431~433
叶爱华, 吴延军, 杨莉(2003). 基因沉默及其克服策略. 中国农学通
报, 19: 81~83
张欣, 徐之艳, Schläppi M, 徐子勤(2011). 拟南芥AZI1 基因对酿酒
酵母细胞生长和蒜薹灰霉菌侵染的抑制作用. 植物生理学报,
47: 57~62
赵华, 梁婉琪, 杨永华, 张大兵(2003). 绿色荧光蛋白及其在植物分
子生物学研究中的应用. 植物生理学通讯, 39: 171~178
郑灿伟, 宾金华(2008). 植物抗真菌蛋白的抗菌机制. 植物生理学通
讯, 44: 989~996
Chassot C, Nawrath C, Métraux J-P (2007). Cuticular defects lead to
full immunity to a major plant pathogen. Plant J, 49: 972~980
Jung HW, Tschaplinski TJ, Wang L, Glazebrook J, Greenberg JT
(2009). Priming in systemic plant immunity. Science, 324: 89~91
Kader JC (1996). Lipid-transfer proteins in plants. Annu Rev Plant
Physiol Plant Mol Biol, 47: 627~654
Kirubakaran SI, Begum SM, Ulaganathan K, Sakthivel N (2008).
Characterization of a new antifungal lipid transfer protein from
wheat. Plant Physiol Biochem, 46: 918~927
Maldonado AM, Doerner P, Dixon RA, Lamb CJ, Cameron RK (2002).
A putative lipid transfer protein involved in systemic resistance
signalling in Arabidopsis. Nature, 419: 399~403
Nishimura S, Tatano S, Gomi K, Ohtani K, Fukumoto T, Akimitsu K
(2008). Chloroplast-localized nonspecific lipid transfer protein
with anti-fungal activity from rough lemon. Physiol Mol Plant
Pathol, 72: 134~140
Reina-Pinto JJ, Yephremov A (2009). Surface lipids and plant defens-
es. Plant Physiol Biochem, 47: 540~549
Shin DH, Lee JY, Hwang KY, Kim KK, Suh SW (1995). High-reso-
图12 转基因烟草的GFP强度的比较分析
Fig.12 Comparative analysis of GFP strength
of transgenic tobacco
A: TT1植株的根; B: TT2植株的根; C: TT3植株的根。
图14 不同株转基因烟草和野生型烟草受灰葡萄孢
侵染后叶片的表型特征
Fig.14 Phenotype of the leaf of wild-type and different lines
of transgenic tobacco plants after inoculation with B. cinerea
A: 野生型烟草; B: TT1植株; C: TT3植株; D: TT2植株。箭头
指向接种点。
图13 灰葡萄孢菌侵染前后转基因烟草中
AZI1基因的表达分析
Fig.13 Expression analyses of AZI1 in transgenic tobacco
plants before and after infection with B. cinerea
1~3: 烟草actin基因, 1: 侵染前的TT2植株, 2: 侵染后的TT2植
株, 3: 野生型烟草; M: DL2000 DNA Marker; 4~6: AZI1基因, 4: 侵
染前的TT2植株, 5: 侵染后的TT2植株, 6: 重组质粒AZI1-GFP (PCR
产物大小为485 bp); 7: 野生型烟草。
杜改亮等: 拟南芥HyPRP蛋白AZI1在转基因烟草中的亚细胞定位及其对灰葡萄孢的抗性 803
lution crystal structure of the non-specific lipid-transfer protein
from maize seedlings. Structure, 3: 189~199
Stewart CN Jr, Via LE (1993). A rapid CTAB DNA isolation tech-
nique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applica-
tions. BioTechniques, 14: 748~749
Suzuki H, Xia Y, Cameron R, Shadle G, Blount J, Lamb C, Dixon
RA (2004). Signals for local and systemic responses of plants to
pathogen attack. J Exp Bot, 55: 169~179
Thordal-christensen H, Zhang Z, Wei Y, Collinge DB (1997). Sub-
cellular localization of H2O2 in plants, H2O2 accumulation in
papillae and hypersensitive response during the barley-powdery
mildew interaction. Plant J, 11: 1187~1194
Wang CF, Huang LL, Buchenauer H, Han Q-M, Zhang H-C, Kang Z-S
(2008). Histochemical studies on the accumulation of reactive
oxygen species (O2
- and H2O2) in the incompatible and compat-
ible interaction of wheat—Puccinia striiformis f. sp. Tritici.
Physiol Mol Plant Pathol, 71: 230~239
Zhang Y, Schläppi M (2007). Cold responsive EARLI1 type HyPRPs
improve freezing survival of yeast cells and form higher order
complexes in plants. Planta, 227: 233~243
Zottich U, Da Cunha M, Carvalho AO, Dias GB, Silva NCM, Santos
IS, do Nacimento VV, Miguel EC, Machado OLT, Gomes VM
(2011). Purification, biochemical characterization and antifun-
gal activity of a new lipid transfer protein (LTP) from Coffea
canephora seeds with α-amylase inhibitor properties. Biochim
Biophys Acta, 1810: 375~383