全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (1): 57~62 5 7
收稿 2010-08-16 修定 　2010-10-22
资助 国家自然科学基金(30 8 70 1 9 4)、陕西省重点实验室研
究计划(08JZ70; 2010JS090)和陕西省科学技术研究发展
计划(攻关计划 20 10K 16-04 -01 )。
* 通讯作者(E-mail: ziqinxu@nwu.edu.cn; Tel: 029-88303484)。
拟南芥AZI1基因对酿酒酵母细胞生长和蒜薹灰霉菌侵染的抑制作用
张欣1, 徐之艳1, Michael Schläppi2, 徐子勤1,*
1西北大学生命科学学院, 西部资源与现代生物技术省部共建教育部重点实验室, 陕西省生物技术重点实验室, 西安 710069;
2美国马凯大学生物科学系, 密尔沃基WI 53233
摘要: 本工作采用酿酒酵母细胞表达载体pESC和植物细胞表达载体pPZP211分析了拟南芥AZI1基因对真菌的抗性功能。
半乳糖诱导产生的AZI1蛋白可以使酵母细胞的生长能力明显降低。DAB和台酚蓝染色结果显示用蒜薹灰霉菌孢子处理
Col-0野生型植株叶片后被侵染部位只能产生少量H2O2, 病原体可以扩散, 而AZI1基因过表达植株叶片在侵染部位有大量
H2O2产生, 着色较深, 表明转化体能够以局部细胞的死亡来阻止病原体侵染周围的细胞。在Col-0野生型植株中, AZI1基
因的表达受外源水杨酸诱导, 24 h后达到峰值。以上结果说明AZI1基因在拟南芥对生物胁迫因素的应答过程中具有重要
作用。
关键词: AZI1基因; 过表达; 酿酒酵母; 蒜薹灰霉菌; 水杨酸; H2O2
Inhibition of Arabidopsis AZI1 to the Growth of Saccharomyces cerevisiae and
Infection of Botrytis cinerea Pers. ex of Garlic Sprout
ZHANG Xin1, XU Zhi-Yan1, Michael Schläppi2, XU Zi-Qin1,*
1Provincial Key Laboratory of Biotechnology of Shaanxi, Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China,
Ministry of Education, College of Life Sciences, Northwest University, Xi’an 710069, China; 2Department of Biological Sciences,
Marquette University, Milwaukee, WI 53233, USA
Abstract: Resistance of Arabidopsis AZI1 to fungus was analyzed with Saccharomyces cerevisiae expression
vector pESC and plant expression vector pPZP211. Synthesis of AZI1 after induction with galactose resulted in
remarkable decrease of the growth ability of yeast cells. DAB and trypan blue staining showed that only small
amounts of H2O2 were produced at the infection sites of Botrytis cinerea spores and the pathogens could spread
to surrounding cells in leaves of wild-type Col-0 plants. In contrast to this, the infection sites on leaves of AZI1
overexpression Col-0 plants accumulated large amounts of H2O2 and were stained intensively by DAB, indicating
the transformants could prevent the spread of pathogen by the death of local cells around the infection sites. In
wild-type Col-0 plants, the expression of AZI1 could be induced by salicylic acid and peaked after 24 h. All these
results suggested that AZI1 play an important role in defense system of Arabidopsis against biotic stresses.
Key words: AZI1; overexpression; Saccharomyces cerevisiae; Botrytis cinerea Pers. ex of garlic sprout; sali-
cylic acid; H2O2
AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED)基因属于
HyPRP (hybrid proline-rich protein)家族, 编码产物
由N端的信号肽、中间的富含脯氨酸结构域和 C
端的八半胱氨酸结构域构成。由于具有疏水性 C
末端, AZI1蛋白也被划分到蛋白酶抑制剂 /种子储
藏蛋白 / 脂转运蛋白家族中( J os e - Es ta ny ol 等
2004)。对GENEVESTIGATOR数据库中的拟南芥
基因芯片信息进行分析(www.genevestigator.ethz.
ch/gv/index.jsp), 发现AZI1 (At4g12470)和其他3个
HyPRP基因 EARLI1 (At4g12480)、At4g12490和
At4g12500具有共表达特征, 受低温、盐和干旱等
环境胁迫因素的调节。由于核苷酸序列和氨基酸
序列存在很高的相似性, 一般将 EARLI1、AZI1、
At4g12490和At4g12500归类为HyPRP家族EARLI1
亚家族。
AZI1基因受壬二酸诱导, azi1突变体在受到病
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2011.01.008
植物生理学报5 8
原体、壬二酸或者水杨酸处理时, 不能表现出由水
杨酸介导的获得性系统免疫抗性(Jung等 2009)。
作为分泌性蛋白, AZI1对拟南芥植株产生可以抵抗
病原体的维管束渗出液也十分关键(程世亚等
2008)。已有的报道显示, AZI1基因对葡萄灰霉菌
具有一定的抗性(Chassot等2007), 它还可以在低温
条件下维持细胞膜和细胞壁的稳定性(Bubier和
Schläppi 2004; Wilkosz和 Schläppi 2000)。
水杨酸(salicylic acid, SA)能够促进开花、气
孔关闭和种子萌发过程, 也可以增加膜通透性和植
物细胞对离子的吸收能力, 但它最受关注的作用是
可以诱导多种植物对病毒、真菌及细菌病原体产
生抗性。对花生、黄瓜和马铃薯等作物施用外源
水杨酸, 能够诱导产生抗病性(王媛等 2007)。对于
水杨酸是否能够诱导AZI1基因以及AZI1基因是否
具有蒜薹灰霉菌抗性尚无研究报道。本实验利用
转AZI1基因酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和
AZI1过表达拟南芥植株研究了该基因对真菌的抗
性特征。
材料与方法
以拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)生态型 Co-
lumbia-0 (Col-0)野生型植株为起始材料。拟南芥
种子首先在 4 ℃处理 2 d以打破休眠状态, 然后用
75%酒精溶液浸泡 1 min, 无菌水清洗 1次, 0.1%
HgCl2浸泡 3~4 min, 无菌水清洗 4~6 次。将种子
均匀点播在附加 0.8%琼脂的MS (Murashige和
Skoog 1962)固体培养基表面, 置于光照培养箱。
将种子苗移栽到珍珠岩:蛭石:营养土(1:1:1)中, 在人
工气候室中于 22 ℃、65%湿度、短日照(8 h光
照 /16 h黑暗)条件下生长。
以Col-0野生型拟南芥基因组DNA为模板扩
增AZI1基因编码序列, 连接至酵母表达载体pESC-
URA (Stratagene, La Jolla, CA, USA)中的GAL1启
动子之后, 在酿酒酵母受体细胞W303-1A MATa
(leu2-3,112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-
11,15) (Veal等 2003)中表达AZI1-myc融合蛋白。
酵母细胞在含有 2%蔗糖的 SC-URA培养基[1.45
g·L-1无氨基酸酵母氮源; 5 g·L-1硫酸铵; 2 g·L-1缺少
尿嘧啶的氨基酸混合物(-URA)]上生长, 在含有2%
半乳糖的 SC-URA 培养基中诱导表达。在分析
AZI1对酵母细胞生长的影响时, 从SC-URA培养基
上挑取酵母单菌落, 接种于含有 2%蔗糖的液体培
养基中, 28 ℃培养至菌液的 OD600=1。用液体培
养基将菌液稀释 10-1、10-2、10-3倍, 分别取 5 mL
接种到含有 2%蔗糖的SC-URA培养基上, 生长 48
h和 72 h后拍照。同时将稀释不同倍数的酵母细
胞接种到只含有2%半乳糖的SC-URA培养基上, 48
h和 144 h后拍照。
分别挑取转空载和转 AZI1酵母单菌落, 接种
于附加2%蔗糖的SC-URA培养基中, 28 ℃培养至
OD600=1, 然后转接到含有2%半乳糖的SC-URA液
体培养基中进行诱导。收集酵母细胞, 用玻璃珠涡
旋处理后加入 10% TCA沉淀蛋白质, 再经 SDS-
PAGE分离后转移到PVDF膜上。免疫印迹分析采
用兔抗myc多克隆抗体(GenScript)和带有碱性磷
酸酶的二抗(羊抗兔, BIOS), 最后加入NBT/BCIP显
色(Sangon)。
从 Col-0野生型拟南芥植株中扩增 AZI1基因
编码序列, 上下游引物分别为5 CTAGGATCCTA-
TAAATACCAA 3 (下划线处为BamHI酶切位点)和
5 ATCGAATTCATAATGGATATT 3 (下划线处为
EcoRI酶切位点)。PCR产物经 BamHI和EcoRI酶
切后用于构建植物表达载体 pPZP211-AZI1, AZI1
由MAC启动子和mas终止子控制(Comai等 1990;
Gleave 1992)。将二元载体导入农杆菌ABI菌株,
采用浸花法转化野生型 Col-0植株(Clough和Bent
1998), 收获种子, 并在含有50 mg·mL-1卡那霉素的
1/2MS固体培养基上筛选 T1代转基因个体。
蒜薹灰霉菌(Botrytis cinerea Pers. ex of garlic
sprout)由本实验室保存。菌株在马铃薯培养基上
于 28 ℃培养 4 d后, 在无菌水中悬浮孢子, 经玻璃
棉过滤除去菌丝, 用1/4马铃薯培养基配制成5?04
个(孢子)·mL-1的悬浮液待用。将 5 mL孢子悬浮液
接种于Col-0和AZI1过表达植株叶片的表面, 侵染
24 h后用 0.4%台酚蓝于 37 ℃染色 1 h, 在 85%乙
醇中煮 10 min脱去叶绿素, 用 80%甘油封片, 在显
微镜下观察侵染情况。为了检测侵染部位H2O2的
积累水平, 侵染 24 h后的叶片用 0.5% DAB在 37
℃染色过夜, 经 80%乙醇脱色后用 80%甘油封片,
在显微镜下观察侵染情况。
用0.1 mmol·L-1 SA喷洒拟南芥Col-0野生型和
张欣等: 拟南芥AZI1基因对酿酒酵母细胞生长和蒜薹灰霉菌侵染的抑制作用 5 9
AZI1 过表达植株, 在处理后不同时间取样, 用
TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。RNA经紫外
定量和甲醛变性胶分离后, 采用毛细管方法转移到
尼龙膜上。Northern印迹分析过程参照DIG High
Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
(Roche)说明书进行。
结果与讨论
1 AZI1对酿酒酵母细胞生长的抑制作用
与转移有空载体 pESC-URA的对照组酵母细
胞相比, 包含pESC-AZI1的酵母细胞在SC-URA平
板上的生长能力明显下降(图 1)。稀释 10倍的酵
母菌液在附加2%蔗糖的SC-URA培养基上生长48
h后, 对照组和转AZI1基因酵母生长情况看不出明
显差异。但当菌液被稀释100倍时, 可以清楚地观
察到转AZI1基因酵母的生长较对照组差。当菌液
被稀释1 000倍时, 转AZI1基因酵母生长速度很慢,
可以分辨出单个克隆, 并且菌落稀疏(图 1-A)。72
h以后, 菌斑生长趋势与 48 h相同(图 1-C)。在本
实验中, AZI1基因由酵母GAL1启动子控制, 表达
受半乳糖诱导。转空载酵母和转AZI1基因酵母在
只含有2%半乳糖的SC-URA培养基上生长48 h后
只能观察到对照酵母生长, 而转AZI1基因酵母未见
生长(图 1-B)。144 h以后, 可以观察到稀释 10倍
和100倍的转AZI1基因酵母生长形成菌斑, 但菌斑
明显小于对照组。这说明AZI1基因可以抑制酵母
细胞的生长, 该基因被半乳糖诱导表达以后, 在144
h才出现较小的菌斑。
氨基酸序列比对结果显示AZI1蛋白属于脂转
运蛋白(lipid transfer protein, LTP)家族。LTP参与
角质的合成, 在植物抵抗病菌侵染过程中具有重要
作用(Arondel等 2000)。Chassot等(2007)的研究结
果表明过表达 AZI1、EARLI1和 At4g12500可以
显著提高拟南芥对葡萄灰霉菌的抗性, 其中以AZI1
过表达个体的抗性最强。本研究发现AZI1蛋白对
酿酒酵母的生长有明显的抑制作用。转AZI1酵母
在以蔗糖为碳源的培养基上生长速度比转空载体酵
母稍慢, 而在培养基中加入 2%半乳糖后, 转基因
酵母相对于转空载对照生长速度明显下降。其原
因可能是由于酵母本身也是一种真菌, 半乳糖诱导
转基因酵母表达产生的AZI1蛋白抑制了酵母细胞
的生长。
本工作采用Western免疫印迹技术分析了酵母
细胞中AZI1基因的表达情况。AZI1蛋白大小约为
16 kDa。AZI1蛋白在酵母细胞中可以被半乳糖诱
导表达(图 2)。与对照组相比, 转 AZI1基因酵母在
16 kDa左右有明显的条带。同时, 在 30 kDa左右
有一条带的亮度是16 kDa条带的2倍, 可能是AZI1
图 1 AZI1基因对酵母生长的影响
Fig.1 Influence of AZI1 on the growth of S. cerevisiae
A: 在含有 2%蔗糖的 SC-URA培养基上生长 48 h; B: 在含有 2%半乳糖的 SC-URA培养基上生长 48 h; C: 在含有 2%蔗糖的 SC-
URA培养基上生长 72 h; D: 在含有 2%半乳糖的 SC-URA培养基上生长 144 h。CK: 转空载酵母细胞; AZI1: 含有 pESC-AZI1的酵母
细 胞 。
植物生理学报6 0
蛋白的二聚体。这说明酵母生长受到的影响确实
是由于 AZI1基因在酵母细胞内的表达而产生的。
2 AZI1对蒜薹灰霉菌侵染的抗性
为了分析 AZI1基因对病原体真菌的抗性, 本
工作通过农杆菌转化方法获得了组成性表达 AZI1
的转基因拟南芥植株。Northern印迹实验结果显
示, 转基因个体可以组成性表达AZI1基因; 经水杨
酸诱导 8 h后, 由于内源 AZI1基因受到诱导, 杂交
信号进一步加强(图 3)。蒜薹灰霉菌侵染 4 d后,
AZI1过表达植株和Col-0野生型植株的表现基本相
同。首先可以看到在叶片的被侵染位点周围有黄
色病斑形成, 病变组织与健康组织之间有明显的界
限。在侵染 8 d后, Col-0野生型植株叶片上的病
斑逐渐扩大, 最后整个叶片开始褪绿变黄, 逐渐软
化成为湿腐状, 最终遍及整片叶子。而 AZI1过表
达植株只有少数叶片出现整片湿腐现象, 在大部分
侵染位点能看到黄色的斑点, 但是病变组织与健康
组织之间仍有明显的界限。侵染 3周以后, Col-0
野生型植株几乎全部死亡, 叶片枯萎。而 AZI1过
表达植株仍有少数存活, 并且在部分被侵染的叶片
上只能看到侵染位点, 叶片其余部位仍然保持绿色
(图 4)。这说明与 Col-0野生型植株相比, AZI1基
因过表达植株对灰霉菌具有明显的抗性。
图 2 AZI1蛋白在酵母细胞中表达的免疫印迹分析
Fig.2 Immunoblot analysis of AZI1 protein expressed in
yeast cells
M: 分子量标准; 1和 2: 含有 pESC-AZI1的酵母细胞; 3: 转空
载酵母细胞。
图 3 AZI1转基因拟南芥植株的Northern印迹分析
Fig.3 Northern blot analysis of AZI1 overexpression
Arabidopsis plant
1: AZI1转基因植株; 2: SA处理 8 h的 AZI1转基因植株。
图 4 蒜薹灰霉菌侵染 3周后拟南芥的生长状况
Fig.4 Symptoms of AZI1 overexpression and wild type Col-0 plants 3 weeks
after inoculation with Botrytis cinerea Pers. ex of garlic sprout
A: AZI1过表达植株; B: Col-0野生型植株。
植物在受到真菌侵染时, 会发生超敏反应
(hypersensitive response, HR)。HR指侵染位点产
生的活性氧(reactive oxygen species, ROS, 包括
H2O2、O2-和OH等)会引起细胞死亡, 限制病原体
的扩散。DAB可以和H2O2反应而显示出红褐色
(Wang等 2008)。在蒜薹灰霉菌侵染 24 h后, Col-
0野生型叶片经过DAB染色可以观察到有大片着
色较浅的区域, 显示灰霉菌侵染可引起较低水平的
张欣等: 拟南芥AZI1基因对酿酒酵母细胞生长和蒜薹灰霉菌侵染的抑制作用 6 1
H2O2积累, 不能引发超敏反应, 病原体可以扩散, 菌
丝的生长最终会使整个叶片枯萎(图 5-A)。而在
AZI1过表达植株叶片上可以观察到分散的染色较
深的红褐色斑点, 由于高水平H2O2积累引发了HR
反应, 灰霉菌不能继续侵染周围的细胞(图5-B), 说
明AZI1基因过表达以后可以明显提高拟南芥的抗
真菌能力。
台酚蓝可以将死亡细胞染成蓝色, 而活细胞则
不被着色。经台酚蓝染色后, Col-0野生型植株叶
片被侵染位点周围大部分细胞呈蓝色, 说明细胞已
经坏死(图 6-A)。在AZI1过表达植株中, 有一些蓝
色的斑点, 大部分细胞不能被染成蓝色, 细胞完整,
坏死现象明显减轻(图 6-B), 这与DAB染色结果一
致。说明灰霉菌菌丝在AZI1过表达植株的叶片上
图 5 采用DAB染色观察侵染位点的H2O2积累水平
Fig.5 Detection of H2O2 level in B. cinerea infected leaves of AZI1 overexpression and
wild type Col-0 plants by DAB staining
A: Col-0 野生型植株叶片; B: AZI1 过表达植株叶片。图 6 同。
生长缓慢, 不能扩散。
3 SA对AZI1基因表达的诱导作用
用水杨酸喷洒拟南芥 Col-0野生型植株 8、
24、36和 48 h后, 提取总RNA进行Northern印
迹杂交检测, 分析AZI1基因在受到水杨酸诱导后的
表达情况, 结果表明外施水杨酸 8 h到24 h后AZI1
mRNA的表达量明显上升, 诱导 24 h后达到峰值。
图 6 被侵染拟南芥叶片的台酚蓝染色
Fig.6 Detection of cell death in B. cinerea infected leaves of AZI1 overexpression and
wild type Col-0 plants by trypan blue staining
诱导 36 h以后, mRNA丰度开始降低, 48 h后恢复
到诱导 8 h后的水平(图 7)。
植物的抗病性是建立在一系列的物质代谢基
础上的, SA虽然不是诱导抗性产生的最初系统信
号, 但却是诱导抗性产生的重要因素(李淑菊等
2000)。很多研究表明外施 SA后, 植物体内的 SA
水平会明显上升, SA与其受体蛋白(SA-binding
植物生理学报6 2
protein, SABP)结合后能够抑制过氧化氢酶的活性
及自由基的产生, 激活POD的合成及其他防卫反应
(丁秀英等 2001)。SA可以作为SAR反应中的一种
内源性信号分子, 使植物获得局部和系统免疫能力,
以抵抗丁香假单胞菌等病原体的侵染。组成性表
达nahG的转基因烟草能够产生大量的水杨酸羟化
酶, 催化SA转化为儿茶酚; 这种转基因植株在受到
病原体侵染时无法积累SA, 不能表现出系统获得性
抗性(systemic acquired resistance, SAR) (Gaffney等
2008; Song等 2008)。AZI1因受壬二酸诱导而得
名, 壬二酸能够诱导植物积累防御信号分子 SA。
azi1突变体在受到致病菌或壬二酸诱导时, 也不能
产生由水杨酸积累引起的特异性的系统免疫反应
(Jung等 2009), 说明 AZI1基因与植物的抗菌防御
机制有关。GENEVESTIGATOR数据库中的基因
芯片分析结果显示, AZI1基因在拟南芥生长发育的
幼苗阶段表达量很高, 在长角果中表达量最低; 且
AZI1基因表达受到多种真菌病原体、机械损伤和
低温等胁迫因素的诱导。在本工作中, 外施一定浓
度的 SA可以诱导 AZI1基因的表达, 说明 AZI1基
因可能通过参与SA信号途径使植物表现出对病原
体侵染的抗性。
参考文献
程世亚, 袁澍, 席德慧, 林宏辉(2008). 植物系统获得性抗性的分
子机理. 生命的化学, 28: 256~259
丁秀英, 张军, 苏宝林, 徐惠风(2001). 水杨酸在植物抗病中的作
用. 植物学通报, 18: 163~168
李淑菊, 马德华, 庞金安, 霍振荣(2000). 水杨酸对黄瓜几种酶活
性及抗病性的诱导作用. 华北农学报, 15: 118~122
王媛, 杨红玉, 程在全(2007). SA诱导拟南芥对灰霉病的抗性与
木质素含量的关系. 植物保护, 33: 50~53
Arondel V, Vergnolle C, Cantrel C, Kader JC (2000). Lipid transfer
proteins are encoded by a small multigene family in
Arabidopsis thaliana. Plant Sci, 157: 1~12
Bubier J, Schläppi M (2004). Cold induction of EARLI1, a putative
Arabidopsis lipid transfer protein , is light and calcium
dependent. Plant Cell Environ, 27: 929~936
Chassot C, Nawrath C, Metraux JP (2007). Cuticular defects lead
to full immunity to a major plant pathogen. Plant J, 49:
972~980
Clough SJ, Bent AF (1998). Floral dip: a simplified method for
Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis
thaliana . Plant J, 16: 735~743
Comai L, Moran P, Maslyar D (1990). Novel and useful proper-
ties of a chimeric plant promoter combining CaMV 35S and
MAS elements. Plant Mol Biol, 15: 373~381
Gaffney T, Friedrich L, Vernooij B, Negrotto D, Nye G, Uknes S,
Ward E, Kessmann H, Ryals JA (1993). Requirement of sali-
cylic acid for the induction of systemic acquired resistance.
Science, 261: 754~756
Gleave AP (1992). A versatile binary vector system with a T-
DNA organisational structure conducive to efficient integra-
tion of cloned DNA into the plant genome. Plant Mol Biol,
20: 1203~1207
Jose-Estanyol M, Gomis-Ruth FX, Puigdomenech P (2004). The
eight-cysteine motif, a versatile structure in plant proteins.
Plant Physiol Bioch, 42: 355~365
Jung HW, Tschaplinski TJ, Wang L, Glazebrook J, Greenberg JT
(2009). Priming in systemic plant immunity. Science, 324:
89~91
Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth
and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plantarum,
15: 473~497
Song JT, Koo YJ, Seo HS, Kim MC, Choi YD, Kim JH (2008).
Overexpression of AtSGT1, an Arabidopsis salicylic acid
glucosyltransferase, leads to increased susceptibility to
Pseudomonas syringae. Phytochemistry, 69: 1128~1134
Veal EA, Ross SJ, Malakasi P, Peacock E, Morgan BA (2003).
Ybp1 is required for the hydrogen peroxide-induced oxida-
tion of the Yap1 transcription factor. J Biol Chem, 278:
30896~30904
Wang CF, Huang LL, Buchenauer H, Han QM, Zhang HC, Kang
ZS (2008). Histochemical studies on the accumulation of
reactive oxygen species (O2- and H2O2) in the incompatible
and compatible interaction of wheat––Puccinia striiformis f.
sp. tritici. Physiol Mol Plant P, 71: 230~239
Wilkosz R, Schläppi M (2000). A gene expression screen identifies
EARLI1 as a novel vernalization-responsive gene in
Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol, 44: 777~787
图 7 SA诱导 AZI1基因表达分析
Fig.7 RNA gel blot analysis of AZI1 transcript abundance
induced by SA