全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (6): 829~834　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0028 829
收稿 2014-02-12　　修定 2014-03-28
资助 山东省科技攻关项目(2013GNC11016)、青岛市自然基金
[12-1-4-5-(12)-jch]和青岛农业大学高层次人才启动基金
(630722)。
致谢 山东省泰山学者团队建设工程。
* 通讯作者(E-mail: liuxin6080@126.com; Tel: 0532-88030311)。
葡萄VvBAP1基因的克隆及表达特性分析
张广科, 肖培连, 侯丽霞, 王文杰, 马倩, 刘新*
青岛农业大学生命科学学院, 山东省高校植物生物技术重点实验室, 山东青岛266109
摘要: 以抗性葡萄品种‘F-242’组培苗为材料, 利用同源克隆法克隆了葡萄VvBAP1基因。测序结果显示, VvBAP1扩增片段
大小为531 bp, 可编码176个氨基酸序列。利用生物信息学分析VvBAP1基因编码的蛋白序列显示, 该蛋白分子量为19.43
kDa, 含有保守的钙离子依赖性的C2结构域; 等电点pI为9.42; 不稳定系数为37.09, 推测为稳定的亲水性蛋白; 含有多个丝氨
酸/苏氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR表明, 该基因在根茎叶中均有表达, 其中在叶片中表达量较高; 盐胁迫、低温等
逆境因子及逆境相关的信号物质, 如水杨酸和一氧化氮均可诱导VvBAP1的表达, 其中低温对其表达量影响更为显著, 推测
该基因参与了葡萄抵御逆境胁迫的过程, 尤其是与低温相关的过程。
关键词: 葡萄; VvBAP1; 基因克隆; 表达特性分析
Gene Cloning and Expression Analysis of VvBAP1 in Vitis vinifera
ZHANG Guang-Ke, XIAO Pei-Lian, HOU Li-Xia, WANG Wen-Jie, MA Qian, LIU Xin*
Life Science College of Qingdao Agricultural University, Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province,
Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: Using homology cloning method, the full-length cDNA of VvBAP1 was cloned from leaves of Vitis
vinifera cultivar ‘F-242’ tissue culture seedling. Bioinformatic analysis indicated that VvBAP1 consists of 531
nucleotides, encoding 176 amino acids with molecular weight 19.43 kDa, isoelectric point 9.42, and suggesting
a stable hydrophilic protein which contains several serine/threonine phosphorylation sites with a C2-like do-
main, respectively. Real-time PCR analysis showed that the VvBAP1 was expressed in all tested tissues, with
the highest expression in leaves. VvBAP1 was significantly induced by signal molecule in stress such as salicyl-
ic acid (SA) and nitric oxide (NO). Moreover, the VvBAP1 was accumulated in response to salt stress and cold
stress, especially the low temperature. It suggested that the VvBAP1 was involved in various stresses in grape,
in particular, the response to low temperature process.
Key words: Vitis vinifera; VvBAP1; gene clone; expression analysis
葡萄(Vitis vinifera)是广泛种植于世界各地的
果树作物, 有“水果之神”之称。其果实的营养价值
很高, 可制成葡萄汁、葡萄干和葡萄酒, 是最有经
济价值的果树之一。我国的主栽葡萄品种为欧亚
种, 其抗逆性差, 每年因生物与非生物胁迫造成的
经济损失巨大。近年来人们利用分子生物学技术
手段从葡萄中克隆研究了多个与逆境应答相关的
基因并研究了其功能。如冷应答相关基因VrCB-
F1a、VrCBF1b、VvCBF1等(Xiao等2006), VvCBFL
和VvZFPL (Takuhara等2011), VvbZIP23 (Tak和
Mhatre 2013), VvCBF2 (Kobayashi等2012); 参与葡
萄抗冷过程的VvIPK2 (李希东等2011); 抗病相关
基因VvPR1、VvNPR1.1和Vcchit1b等(侯丽霞等
2012; Le Henanff等2009; Fernandez-Caballero等
2009), WRKY家族成员VvWRKY13、VvWRKY45和
VvWRKY71 (侯丽霞等2013a, b)。研究报道, 将葡
萄VvbZIP23转入葡萄愈伤组织中, 使其过表达, 发
现多种逆境相关基因被诱导表达(Tak和Mhatre
2013)。目前葡萄基因组已经测序, 但葡萄抗逆分
子机制的研究还刚起步, 因此, 克隆葡萄抗逆相关
基因分析其特性, 研究其作用机制, 为改良葡萄种
质资源提供理论依据。
在拟南芥中, BAP (BON1-associated protein)
作为BON1相关蛋白, 是一种含C2结构域的蛋白,
以钙依赖性的方式与质膜结合(Hua等2001; Yang
植物生理学报830
等2006)。其中AtBAP1作为PCD的负调控因子可
以被生物和非生物的刺激所诱导, 如细菌、机械
损伤、化学刺激、活性氧等。研究表明, 拟南芥
bap1-1突变体受病菌感染后, 抗病相关基因PR1表
达量明显提高, AtBAP1的过表达导致植株更易受
到病菌侵染, 说明拟南芥AtBAP1在抗病过程中起
负调控作用(Yang等2006); 当植株受到机械损伤或
经SA处理后, 该基因表达量都明显提高(Yang等
2006); 此外, 温度也可以诱导该基因的高度表达
(Yang等2006; Zhu等2011)。因此推测AtBAP1参与
拟南芥响应逆境胁迫过程, 但是目前尚未见葡萄
VvBAP1基因特性与功能的相关研究报道。
本实验以抗性葡萄‘F-242’为材料, 克隆葡萄
的VvBAP1基因并研究该基因的表达特性, 为葡萄
的遗传改良提供候选基因。
材料与方法
1 实验材料
以抗性葡萄(Vitis vinifera L.)品种‘F-242’为实
验材料, 以一年生枝条新梢为供试外植体, 75%的
乙醇浸泡30 s, 无菌水冲洗3~5次, 0.1%的升汞处理
8 min, 无菌水冲洗5~6次, 将端部切除2~3 mm, 接
种于生根培养基(1/2MS+0.1 mg·L-1 IAA)上, 置于
培养室中培养[(25±1) ℃, 200 μmol·m-2·s-1, 12 h光
照/12 h黑暗], 将获得的试管苗切成带芽的外植体
接种于生根培养基上, 以扩大繁殖试管苗, 30~50 d
后使用。
2 材料处理
分别用一氧化氮(nitric oxide, NO)供体硝普钠
(sodium nitroprusside, SNP) (0.1 mmol·L-1)、脱落
酸(abscisic acid, ABA) (10 μmol·L-1)、水杨酸(sali-
cy l ic ac id , SA) (1 mmol·L -1)、甘露醇 (200
mmol·L-1)、NaCl (150 mmol·L-1)、4 ℃低温处理
‘F-242’葡萄组培苗叶片0、3、6、9、12、18和24
h后, 提取总RNA, 用于基因相对表达量的研究。
3 实验方法
3.1 总RNA的提取和cDNA合成
按照李希东等(2011)方法提取葡萄总RNA,
M-MLV反转录试剂盒合成cDNA第一条链作为
模板。
3.2 VvBAP1基因的克隆及序列分析
采用同源克隆法, 以拟南芥中相应的CDS进
行WU-BLAST序列比对, 检索到VvBAP1基因同源
序列 , 并设计特异性引物 : Sense , 5 ′ -GCTC-
TAGAAGTATCTACTACATAGTTTGCGTACT-3′,
包含XbaI酶切位点(下划线); Anti-sense, 5′-GGGG-
TACCCTTTTATTATTTTCTCCGAATTGAC-3′, 包
含 KpnI酶切位点(下划线), 由上海桑尼生物工程有
限公司合成。PCR反应程序如下: 94 ℃预变性5
min后, 94 ℃变性30 s, 55.3 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1
min, 35个循环, 最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。
PCR产物利用宝生物工程(大连)有限公司试剂盒
回收, 与pMD18-T载体连接。阳性克隆由上海桑
尼生物工程有限公司测序。借助DNAStar软件分
析基因序列并推导其编码的氨基酸序列 , 并预
测其分子量、PI及稳定性 , 在线软件预测分析
VvBAP1的理化性质。通过BLAST (http://blast.
ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列比对分析, 选择
与葡萄VvBAP1蛋白同源的其他植物BAP1氨基酸
序列用Clustal X进行序列比对, 利用MEGA4.0软件
neighbor joining (NJ)算法构建系统进化树。
3.3 VvBAP1理化性质分析
利用在线软件ProtParam (http://web.expasy.
org/protparam/)对VvBAP1氨基酸序列进行分析;
用NCBI网站在线软件Conserved Domains (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预
测保守结构域; 利用在线软件NetPhos (http://
www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析磷酸化位
点; 利用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)
分析氨基酸序列的疏水性 /亲水性 (侯丽霞等
2013b)。
3.4 VvBAP1基因表达分析
利用实时荧光定量PCR检测VvBAP1基因相对
表达量变化 , 引物如下 : VvBAP1 Sense , 5 ′ -
AGAAGAATGCCTTTGCCTTG-3′, Anti-Sense, 5′-
CCTCGCAGTTCCGATGACCC-3′; ACTIN Sense,
5′-AATGAGAGATGGCTGGAAGAG-3′, Anti-
sense, 5′-TACGAGCAAGAGCTGGAAA-3′。荧光
实时定量 PCR程序为: 95 ℃ 60 s、95 ℃ 10 s、56
℃ 20 s、72 ℃ 20 s, 40个循环。Melt曲线从72 ℃
至99 ℃, 第1步维持45 s, 以后每升高1 ℃维持5 s。
每样品进行3次重复。以ACTIN为内参对基因进行
相对定量, VvBAP1表达量参考Livak和Schmittgen
(2001)的方法计算。
张广科等: 葡萄VvBAP1基因的克隆及表达特性分析 831
实验结果
1 VvBAP1基因的克隆和序列分析
1.1 VvBAP1全长序列的克隆
以拟南芥的AtBAP1的cDNA进行BLAST序列
同源比对, 检索到葡萄品种‘黑比诺’中VvBAP1基
因同源序列 , 片段长度为531 bp。以葡萄品种
‘F-242’为材料, 反转录的cDNA为模板进行PCR扩
增, 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 结果表明:
扩增得到的片段大小在500~750 bp (图1-A), 其中
含有180 bp的5′-UTR部分区域, 然后以得到的片段
为模板再次进行PCR扩增, 得到的片段大小在500
bp左右(图1-B), 片段大小符合数据库中预测的大
小。将上述PCR产物进行回收, 然后连接pMD18-T
载体(pMD18-T-VvBAP1), 提交测序。结果表明, 克
隆得到的目的片段大小为531 bp, 编码176个氨基
酸, 与数据库中提交的‘黑比诺’VvBAP1基因编码
氨基酸序列相比, 136位为Met, 而‘黑比诺’中136位
为Val。
列亲水性和疏水性特性, 有助于预测该蛋白的结构
和功能特性。利用在线软件ProtScale分析VvBAP1
氨基酸序列的亲水性/疏水性, 根据氨基酸对应的
得分越高该氨基酸疏水性越强, 得分越低亲水性
越强。从图2可以得出VvBAP1大部分氨基酸属于
亲水性, 故整条肽链表现为亲水性, 推测该蛋白属
于亲水性蛋白。
图2 VvBAP1氨基酸序列疏水性/亲水性预测
Fig.2 Predication of hydrophobicity/hydrophilicity
for VvBAP1
图1 葡萄VvBAP1基因CDS序列的PCR扩增
Fig.1 RT-PCR amplification products of VvBAP1
M: DL2000 DNA Marker; S: VvBAP1扩增产物。
1.2 VvBAP1序列分析
1.2.1 VvBAP1的理化性质和同源性分析 利用
在线软件ProtParam对葡萄VvBAP1进行氨基酸
组成分析, 结果表明, VvBAP1的分子式组成为
C848H1362N250O255S9, 分子量约为19.43 kDa, 等电点
为9.42, 不稳定系数为37.09 (40以下为稳定蛋白),
推测为稳定蛋白。
蛋白质结构的亲水性/疏水性对蛋白质的水溶
性和稳定性有决定作用。分析VvBAP1氨基酸序
进一步利用ClustalX 2.0软件分析比较, 结果
表明VvBAP1编码氨基酸序列与多种植物中BAP1
同源, 并且含有钙依赖型膜结合位点C2功能结构
域(图3-A)。在进化距离上, 葡萄的VvBAP1与毛果
杨的PtBAP1亲缘关系较近, 聚为一类, 同属于木本
植物(图3-B)。
1.2.2 VvBAP1氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预
测 蛋白质的磷酸化修饰是在细胞信号传递过程
中起着重要作用的一种蛋白调节方式, 丝氨酸、
苏氨酸和酪氨酸是蛋白质磷酸化修饰的三种主
要的部位。利用在线软件NetPhos分析(图4)可看
出, 在VvBAP1中含有9个丝氨酸磷酸化位点, 4个
苏氨酸磷酸化位点, 1个酪氨酸磷酸化位点。推测,
VvBAP1蛋白磷酸化后, 可以影响蛋白质的活性,
从而参与葡萄代谢过程。
2 VvBAP1基因的表达特异性分析
为探究VvBAP1的组织表达模式, 以‘F-242’组
培苗为实验材料, 采用实时荧光定量PCR的方法检
测了VvBAP1表达的组织特异性。结果表明, VvBAP1
植物生理学报832
图4 VvBAP1氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测
Fig.4 Phosphorylation site prediction of VvBAP1
图3 VvBAP1与其他物种BAP1序列同源性分析(A)和进化树(B)
Fig.3 Alignment of the predicted amino acid sequences (A) and phylogenetic tree (B) of VvBAP1 and other BAP1s
黑色表示完全相同的氨基酸残基, 灰色程度越浅氨基酸残基保守性越低。毛果杨PtBAP1 (Populus trichocarpa, GenBank accession
No.7494050); 拟南芥AtBAP1 (Arabidopsis thaliana, GenBank accession No. 825291); 蓖麻RcBAP1 (Ricinus communis, GenBank accession
No. 8265443); 粳稻OsBAP1 (Oryza sativa Japonica Group, GenBank accession No. 9266962); 高粱SbBAP1 (Sorghum bicolor, GenBank acces-
sion No. 8054880); I代表钙依赖型膜结合位点C2。
张广科等: 葡萄VvBAP1基因的克隆及表达特性分析 833
在葡萄根、茎、叶中均有表达, 其中在叶中的表
达量最高(图5)。
由图6得知 , 经逆境相关的信号物质SA、
ABA和SNP处理‘F-242’叶片, 发现SA和SNP均可
诱导‘F-242’叶片中VvBAP1相对表达量的增加, 并
且均在18 h表达量最高, 但表达量变化存在差异;
而 ABA诱导的VvBAP1基因表达量变化较小。推
测, VvBAP1基因参与了SA和NO介导的葡萄响应
逆境胁迫过程, 但在不同逆境条件下其信号转导
途径可能存在差异。
经低温、NaCl和甘露醇处理‘F-242’叶片, 实
时荧光定量PCR检测VvBAP1的相对表达量。由图
7可以看出, 低温(图7-A)和盐胁迫(图7-B)均可不同
程度地诱导VvBAP1基因的表达, 其中低温的作用
最为显著。低温和NaCl处理后该基因在12 h相对
表达量达到最大。而甘露醇处理后, VvBAP1的相
图5 VvBAP1的组织特异性表达分析
Fig.5 Characterization of VvBAP1 expression in tissues
图6 几种逆境信号分子对‘F-242’叶片VvBAP1
相对表达量的影响
Fig.6 Quantitative RT-PCR analysis of stress-related signal
substances induced VvBAP1 expression in leaves of ‘F-242’
对表达量并没有明显变化。推测VvBAP1参与葡萄
抵御低温和盐胁迫的过程。
讨　　论
拟南芥BAP1是含有一个C2结构域的蛋白, 参
与植物对逆境的应答过程(Yang等2006; Zhu等
2011)。在本文中我们从抗性葡萄‘F-242’组培苗中
克隆了葡萄VvBAP1基因, 与数据库中提交的‘黑比
诺’VvBAP1序列编码氨基酸序列相比, 136位为
Met, 而在‘黑比诺’中136位为Val。软件分析表明,
该基因含有一个保守的钙依赖性膜脂结合位点C2
结构域(图3-A), 含有多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位
点, 为亲水性蛋白。
含C2结构域的蛋白质大多是Ca2+依赖型磷脂
结合蛋白, 定位于细胞质膜上, 在细胞信号转导途
径中发挥着重要作用(Yang等2006; Cho和Stahelin
2006)。低温处理拟南芥6 h后AtBAP1的表达量明
图7 逆境因子对‘F-242’叶片VvBAP1相对表达量的影响
Fig.7 Quantitative RT-PCR analysis of some stresses-induced
VvBAP1 expression in leaves of ‘F-242’
A: 4 ℃处理; B: NaCl和甘露醇处理。
植物生理学报834
显提高(Yang等2006; Zhu等2011), AtBAP1启动子
含有一个ICE1结合位点——MYC顺式作用元件,
进一步实验证明低温诱导AtBAP1表达的过程受抗
冷相关基因AtICE1的调控, 在Atice1突变体中At-
BAP1的表达量明显降低; 在缓慢的温度下降过程
中, AtBAP1的表达为SA依赖型模式(Zhu等2011),
植株经SA处理AtBAP1表达量明显增加(Yang等
2006)。同样的, 我们发现低温和盐胁迫上调了
VvBAP1的表达, 其中, 对低温的反应更为明显(图
7-A), 说明该基因参与了葡萄响应逆境胁迫的过
程。同时我们还发现SA能够诱导VvBAP1的表达
量上调, 这与拟南芥AtBAP1类似。
NO参与拟南芥对低温的应答, 植株经NO供
体SNP处理3 d后抗冻性明显增强(Zhao等2009),
NO可以通过CBF途径诱导拟南芥低温相关基因
COR15a、LT130和LTI78的表达(Cantrel等2011);
而NO合成酶抑制剂L-硝基精氨酸(nitro-L-arginine,
L-NAA)处理可阻断低温对番茄CBF表达的调控
(Zhao等2011), 本实验发现葡萄叶片经NO供体SNP
处理后, VvBAP1的表达量明显提高(图6), 进一步说
明该基因与葡萄响应低温胁迫有着密切的关系。
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