全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (3): 275~280 275
收稿 2010-10-20　　修定 2011-01-25
资助 山西省留学人员科研资助项目(2010041)和山西农业大学
引进人才基金(416568)。
* 通讯作者(E-mail: drhan@hotmail.co.uk; Tel: 0354-
6288344)。
30个枣树种质资源遗传多样性的ISSR分析
侯思宇1, 孙朝霞1, 申洁1, 王玉国1, 韩渊怀1,2,*
山西农业大学1农学院生物技术系, 2生物工程研究所, 山西太谷030801
摘要: 取30个枣树品种进行ISSR分子标记分析, 其扩增条带分别进行琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测, 以期获得不同产
地品种之间的遗传多态性。从100条选择扩增的ISSR引物中筛选出17条扩增清晰、重复性和稳定性好的引物, 选取其中8
条扩增条带多态性强的引物进行遗传聚类分析。结果表明: (1) 1%琼脂糖凝胶电泳和5%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增总
条带数分别为72和127条, 其中多态性条带分别为51条和113条, 多态性条带比率(PPB)分别为70.8%和88.9%。(2)基于
UPGMA软件对30个品种的遗传差异性分析表明, 8个ISSR引物可以将枣树品种之间遗传差异明显区分开来。两种电泳检
测方法相比较, 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测可获得较为精细的枣树品种间遗传图谱。其遗传相似系数范围在0.56~1.00之间,
以0.62为最低遗传相似系数, 可将30个枣树品种分成3个大类, 6个亚类, 为进一步研究枣树品种间分类、起源进化关系和分
子辅助育种奠定基础。
关键词: 枣; ISSR; 遗传多样性
Genetic Variation among Thirty Ziziphus jujuba Mill. Cultivars as Revealed by
ISSR Marker Assays
HOU Si-Yu1, SUN Zhao-Xia1, SHEN Jie1, WANG Yu-Guo1, HAN Yuan-Huai1,2,*
1Department of Biotechnology, School of Agriculture, 2Bioengineering Institute, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi
030801, China
Abstract: Genetic diversity among 30 accessions of jujube (Ziziphus jujuba) were investigated with inter sim-
ple sequence repeats (ISSR) technique, using agarose gel electrophoresis and polyacrylamide gel electrophore-
sis (PAGE). ISSR analysis was carried out 8 random primers generated from 17 polymorphic primers. The re-
sults showed that: (1) 72 and 127 DNA bands were amplified and detected by 1% agarose gel electrophoresis
and 5% PAGE respectively, with the percentage of polymorphic bands (PPB) (88.9%) in PAGE detection higher
than that in agarose gel electrophoresis (70.8%); (2) An efficient separation of 30 jujube accessions was
achieved using unweighted pair group method with arithmetic means (UPGMA) clustering. Those detected by
PAGE electrophoresis could achieve more fine genetic map among 30 accessions of jujube compared with by
agarose gel. The genetic similarity coefficient (GS) ranged from 0.56-1.00. Those detected by agarose gel elec-
trophoresis were clustered into three groups and seven subgroups, meanwhile those detected by PAGE were
clustered into three groups and six subgroups. These results indicates that ISSR analysis by PAGE is much bet-
ter than that by agarose gel electrophoresis.
Key words: jujube; ISSR; genetic diversity
枣树在我国分布甚广, 北起内蒙、辽宁, 南至
两广 , 西起新疆 , 东至沿海各省 , 大致在东经
75~125o、北纬19~43o范围内均有分布(陈贻金等
1991)。我国枣树栽培品种达700余种, 种质资源十
分丰富。根据我国气候、土壤、品种特点和栽培
管理情况, 枣的分布可划分为南北两个大区。其
中北方产区又可分为黄河、海河中下游河流冲击
土枣区, 黄土高原丘陵枣区和甘肃、内蒙古、宁
夏、青海、新疆干旱地带河谷丘陵枣区(曲泽洲和
王永惠1993)。山西省作为枣栽培发源地之一, 栽
培面积已由1995年13万hm2增加到2004年的35万
hm2, 红枣产量也由1995年的1.6亿kg增加到2004年
的3亿kg。
植物生理学报276
枣树多为无性繁殖, 栽培品种繁多, 导致同物
异名、同名异物的现象比较严重 (宋晓兵等
2007)。目前, 对枣树传统分类研究与种质资源开
发和鉴定, 已经从传统的形态学、细胞学和生物
化学手段走向了与分子生物学手段相结合的开发
与应用上。如: 赵锦和刘孟军(2003)采用随机扩增
多态性DNA (random amplified polymorphic DNA,
RAPD)标记技术, 用3个引物就可将25个枣品种、
品系及两个近缘种区分开 ; 刘平等(2005)采用
RAPD技术分析了枣与酸枣之间的关系; 乔勇等
(2009)采用扩增片段长度多态性(amplified frag-
ment length polymorphism, AFLP)技术, 将21个枣
品种(系)分为6类, 并得到了18个品种(系)的特征性
AFLP标记。本研究选用采集的23个原产地为山西
的品种和7个其他产地的枣树品种, 采用内部简单
序列重复(inter simple sequence repeats, ISSR)分子
标记技术(Zietkiewicz等1994), 从分子水平上探讨
山西省本地枣树品种与引种外省优势品种之间的
遗传多样性及亲缘关系, 旨在充分挖掘山西枣树
品种资源 , 为枣树品种鉴定和品质改良打下基
础。此外, 本研究采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯
酰胺凝胶电泳两种检测方法分别对扩增条带进行
分析, 比较两者对遗传聚类图谱的影响及贡献, 为
进一步开发鉴定枣树品种的ISSR标记和SSR功能
标记提供依据。
材料与方法
1 材料
选取30个枣(Ziziphus jujuba Mill.)品种(表1),
采自山西农业大学枣圃, 其中23个品种产自山西,
7个品种产自其他省区。
2 方法
2.1 枣树基因组DNA的提取及ISSR分析
采用本实验室改良CTAB法(孙朝霞等2008)提
取枣树幼嫩叶片基因组DNA。反应体系的优化参
见本实验申洁等(2010)的方法, 20 μL的反应体系
中含模板DNA (20 ng·μL-1) 1 μL、10×缓冲液 2
μL、MgCl2 (25 mmol·L-1) 1.2 μL、dNTPs (2.5
mmol·L-1) 1.6 μL、引物2 μL、Taq DNA聚合酶(2.5
U·μL-1) 0.5 μL、ddH2O 11.7 μL。PCR循环条件为:
94 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s (30个
循环); 72 ℃ 5 min。本文重点在于分析琼脂糖凝
胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳对ISSR结果的影响, 以
及在构建遗传图谱、分析遗传多样性方面的效率
和科学性。
根据British Columbia大学公布的100条ISSR
引物, 由TaKaRa公司合成, 其余试剂均购于TIAN-
GEN生化科技有限公司, PCR仪为Biometra T1型。
2.2 数据统计与分析
ISSR扩增结果分别由1%琼脂糖凝胶和5%聚
表1 供试枣品种
Table 1 Chinese jujube tested in this study
编号 品种 产地 编号 品种 产地
1 ‘榆次团枣’ 山西榆次 16 ‘板枣’ 山西稷山
2 ‘不落酥’ 山西平遥 17 ‘鸡心蜜枣’ 山西太谷
3 ‘平陆尖枣’ 山西平陆 18 ‘襄汾龙枣’ 山西襄汾
4 ‘临汾蜜枣’ 山西临汾 19 ‘临汾团枣’ 山西临汾
5 ‘针葫芦’ 山西临汾 20 ‘金昌’ 山西太谷
6 ‘官滩枣’ 山西襄汾 21 ‘骏枣’ 山西交城
7 ‘平遥大枣’ 山西平遥 22 ‘晋矮4号’ 山西
8 ‘稷山圆枣’ 山西稷山 23 ‘晋矮2号’ 山西
9 ‘相枣’ 山西运城 24 ‘密云小枣’ 北京密云
10 ‘襄汾木枣’ 山西襄汾 25 ‘大荔鸡蛋枣’ 陕西大荔
11 ‘柳罐枣’ 山西稷山 26 ‘胎里红’ 河南镇平
12 ‘婆婆枣’ 山西运城 27 ‘疙瘩长红’ 山东泰安
13 ‘紫圆’ 山西夏县 28 ‘敦煌大枣’ 甘肃敦煌
14 ‘壶瓶枣’ 山西太谷 29 ‘赞皇大枣’ 河北赞皇
15 ‘郎枣’ 山西太谷 30 ‘沾化冬枣’ 山东渤海
侯思宇等: 30个枣树种质资源遗传多样性ISSR分析 277
丙烯酰胺凝胶电泳检测, 在紫外灯下由凝胶成像
分析仪(北京六一仪器厂)拍照后统计多态性条带
并进行赋值, 当某个引物在某一位置有条带, 赋值
为“1”, 反之赋值为“0”, 根据Nei-Li相似系数法计算
出 30份供试品种之间ISSR数据的遗传相似系数,
并用UPGMA (unweighted pair group method with
arithmetic mean)软件构建系统进化树。
实验结果
1 遗传多态性分析
所筛选的100条ISSR引物中, 引物Tm值在40
℃
以下经扩增程序调整未见扩增条带, Tm值大于65 ℃
扩增效率也较差, Tm值在50~56 ℃扩增效率较高;
共筛选出有多态性条带的引物17条, 核心序列为
(AT)8、(TA)8、(GT)8、(TC)8的引物无扩增条带, 而
其中8条引物扩增的多态性条带较多、清晰且稳
定重复性好, 其中核心序列为(AG)8N的引物扩增
效果最为清晰, 多态性条带最多(图1和图2)。
选取有较好扩增结果的8条引物进行多态性
条带统计分析, 引物序列及扩增条带数见表2。琼
脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果
(表3)显示, 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测可大幅度提
高扩增条带的检出率和分辨率, PPB值也大幅度增
加。
2 遗传差异性比较分析
ISSR引物扩增结果分别由两种电泳检测, 并
图1 琼脂糖凝胶电泳检测ISSR标记
Fig.1 ISSR amplified products detected by agarose gel electrophoresis
M: DNA分子量标准; 1~30: ISSR引物880扩增不同枣树品种。
图2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ISSR标记
Fig.2 ISSR amplified products detected by PAGE
M: DNA分子量标准(100 bp Ladder); 1~30: ISSR引物880扩增不同枣树品种。
植物生理学报278
构建了30个枣树品种的系统进化树和遗传距离图
谱(图3)。结果表明: 8个ISSR标记引物可明显区分
30个枣树品种的遗传差异, 由于检测方法的差异,
所构建的聚类图也不相同。琼脂糖凝胶电泳检测
数据所构建的遗传聚类图, 其遗传相似系数范围
在0.44~0.94之间, 如果以0.70为最低遗传相似系
数, 可以将30个检测品种分成3个大类(1、2和3), 7
个亚类(1、2a、2b、3a、3b、3c和3d), 其中‘榆次
团枣’单独划分为1类, ‘紫圆’和‘大荔鸡蛋枣’遗传相
似系数较高, 为0.93。而聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
数据所构建的遗传聚类图, 其遗传相似系数范围
在0.58~1.00之间, 如果以0.62为最低遗传相似系
数, 可将30个枣树品种分成3个大类(1、2和3), 6个
亚类(1a、1b、1c、2a、2b和3), 其中‘金昌’和‘骏
枣’聚为一类, 两者遗传相似系数为1.00。
讨　　论
RFLP、RAPD、AFLP和ISSR等分子标记技
术已被广泛应用于果树种质资源评价、品种鉴别
与分类、基因定位及基因组图谱构建等领域(彭建
营等 2001)。在枣属植物方面, 刘孟军(1995)首次
应用RAPD对枣和酸枣进行了分析, 将亲缘关系极
表3 ISSR扩增数据统计
Table 3 Statistics of the amplification by ISSR markers
　　
检测方法
多态性引物 扩增产物 扩增出多态 平均每条引物扩 多态性条带占总
扩增条带数 大小范围 性条带总数 增的多态性带数 条带的百分比/%
琼脂糖凝胶电泳 72 0.30~1.50 51 6.3 70.8
聚丙烯酰胺凝胶电泳 127 0.12~2.80 113 14.1 88.9
表2 ISSR引物及扩增条带数
Table 2 ISSR primers and the numbers of amplified products
编号 引物 序列 Tm/℃
琼脂糖凝胶电泳检测 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
扩增条带数 多态性条带数 扩增条带数 多态性条带数
1 827 (AC)8G 54 8 6 15 14
2 834 (AG)8YT 53 9 6 16 14
3 836 (AG)8YA 53 11 7 17 13
4 840 (GA)8YT 56 8 6 15 13
5 856 (AC)8YA 53 9 7 16 15
6 873 (GA)8C 51 7 6 16 15
7 880 GGAGAGGAGAGGAGA 53 11 8 18 16
8 891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 52 9 5 14 13
　　Y=C, T; H=A, C, T; V=A, C, G。
近的金丝小枣和无核小枣区分开。2000年, 彭建
营等利用RAPD技术对64个枣品种和类型进行了
亲缘关系分析, 对无核性状相关的分子标记进行
了探究。彭建营等(2002)同样利用RAPD技术对枣
的种下划分进行了探讨, 研究结果表明: 枣的种下
不宜设变种, 对枣种下的众多品种, 可根据品种间
的遗传关系 , 直接划分品种群。宋婉和续九如
(2000)用AFLP的方法建立了枣优良品种的DNA指
纹图谱。目前, 枣属种质资源分子鉴定以及遗传
多样性的研究仍处在初步探索阶段, 基于ISSR分
子标记技术探索枣属种质资源遗传多样性目前尚
未见报道。SSR引物开发成本高、效率低和工作
量大, 并且无法在未知测序物种之间通用。RFLP
操作复杂, 成本较高, 需要一定经验的人才能熟练
操作。RAPD标记尽管简单方便但重复性差(Gar-
cia等2004)。比较其他几种标记方法, ISSR分子标
记不仅结合了RAPD和SSR的优点, 具有操作简
便、稳定性和多态性强 , 而且产物多态性远比
RFLP、SSR和RAPD更加丰富。
在筛选ISSR扩增引物中 , 核心重复序列为
AC、AG和GA的引物扩增效率较高, 推测这些核
心重复序列在枣树基因组中所占比例较高。尽管
侯思宇等: 30个枣树种质资源遗传多样性ISSR分析 279
图3 基于琼脂糖凝胶电泳(A)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(B)检测构建279的30个枣树品种间的ISSR聚类图
Fig.3 Dendrogram of cluster of 30 jujube accessions based on agarose gel electrophoresis (A) and PAGE (B)
虚线表示不同类群划分的最低相关系数。
植物生理学报280
Awasthi等(2004)曾在桑葚的ISSR分析中表明, AC
重复序列在植物中并不多见。无论是来源于山西
省还是其他省份的枣树栽培品种, 由两种方法所
构建的遗传聚类图均表现出明显的种间差异, 这
可能与枣树长期采用扦插方式繁殖, 遗传背景较
为复杂有关。
比较两种方法检测的灵敏度, 聚丙烯酰胺凝
胶电泳检测出的总条带数以及多态性条带数要明
显高于琼脂糖凝胶电泳的, 因此所构建的遗传聚
类图也不相同。琼脂糖凝胶电泳检测数据所构建
的遗传聚类图, 其遗传相似系数范围跨度较大, 品
种之间遗传距离较小, 类和亚类的划分不够精细,
有的品种单独划为一个大类或亚类, 如: ‘榆次团
枣’与其他品种相比, 遗传相似系数最低, 为0.32,
单独聚为一类。而原产地为山西晋中地区的‘榆次
团枣’, 单从形态特征、产地和用途, 无法与其他枣
树品种严格划分出来。‘紫圆’和‘大荔鸡蛋枣’原产
地相距较远, 分别为山西夏县和陕西大荔, 而且果
实形状和果核等特性均不相同, 遗传相似度却高
达0.93。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所构建的遗传
聚类图, 其遗传相似系数范围跨度较小, 类和亚类
划分相对精细。其中‘榆次团枣’与‘不落酥’遗传相
似度为0.79, 归为一个亚类, 这与两者同一起源地
(山西晋中地区)相关。亚类中如1a、2a和2b都明
显将晋中枣树品种与晋南品种划分开来。‘金昌’
和‘骏枣’聚为一类, 推测两者同产于山西中部, 且
‘骏枣’在山西太谷地区引种已有历史。综合比较
分析, 琼脂糖凝胶电泳的分辨率远不及聚丙烯酰
胺凝胶电泳, 因此, 我们认为聚丙烯酰胺凝胶电泳
方法检测ISSR数据能构建更为精细的遗传聚类图,
可作为划分枣属种下品种间遗传多样性的分子依
据。并且我们获得部分枣树品种特异性ISSR分子
标记条带, 进一步克隆测序, 基于核心重复序列的
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